利用天然高分子葡聚糖（Dextran）和烯丙基異氰酸酯（AI）反應，首先合成了預聚物 Dex-AI，然后預聚物 Dex-AI 再與聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）反應，制備了具有良好親水性和生物相容性的水凝膠（DP）。同時探索了反應物比例對最終產物的影響，結果是在 Dex-AI∶PEGDA 為 4∶6（質量比）時，所制得的水凝膠 DP 的吸水率最大，可達 810%。將此水凝膠接枝于經二苯甲酮在紫外光下處理的臨床用導管表面，經靜態和動態表面接觸角測試，接枝有水凝膠的導管其表面親水性顯著提高，如靜態表面接觸角由水凝膠接枝前的（97 ± 6.1）° 下降到了接枝后的（25 ± 4.2）°。另一方面，以小鼠（ICR，30 只）為實驗動物，將接枝前后的導管植入小鼠背部皮下，觀察時間為 30 d。發現導管經 DP 接枝后，反映急性炎癥情況的白細胞水平始終低于未接枝的樣本；大體觀察和組織學檢測也發現，與未接枝的導管相比，在相同的時間點接枝 DP 的導管其炎性程度明顯下降，導管與周邊組織相容性提高。本研究證實了接枝水凝膠的技術可以提高目前臨床用的 PE 導管的組織相容性，這對改善因治療需要導管較長時間置留于體內而對患者帶來的不良影響是非常有利的。
引用本文： 徐擇賢, 金嘉長, 侯雷, 竺亞斌, 徐頂立, 徐振強, 沈志森. 超親水性醫用導管的制備及其動物體內組織相容性研究. 生物醫學工程學雜志, 2019, 36(2): 238-244. doi: 10.7507/1001-5515.201707017 復制
引言
醫用導管在臨床上應用非常廣泛。目前用以制備醫用導管類制品的材料主要有硅橡膠、塑料、聚氨酯及其共聚物等。這些高分子材料表面非常疏水，又沒有可與組織和細胞親和的活性成分，患者在使用后往往會引起嚴重的炎癥、疼痛等不良反應，對需要長時間在體內留置導管的患者，其并發癥尤為嚴重。導致這種情況的原因主要是：一方面，現有導管表面親水性差、摩擦系數大，導管與人體接觸時不能形成浸潤性表面而產生很大的摩擦；另一方面，導管植入體內后與肌肉、體液、血管等直接接觸，會引起人體的排異反應。如果炎癥嚴重的話還會造成導管與組織的粘連，醫生不得不在植入后非常短的時間內更換或易位導管，這在增加患者痛苦的同時，也增加了醫療費用。因此，制備具有良好生物相容性的醫用導管顯得十分迫切。
水凝膠是由親水性的聚合物鏈構成具有三維網絡結構的多元體系[1]，分子鏈上的親水基團以氫鍵與水分子相連接，使其具有強大鎖水功能的同時本身卻不被水所溶解[2]，大量的水分子可以保留在聚合物三維網絡結構中，從而形成水凝膠[3]。與此同時，人體組織中除了細胞以外，大部分是富含親水性的蛋白質和多糖類物質，這些物質在正常情況下組成與水凝膠類似的三維網絡結構，正因為如此，水凝膠在與人體相關的如藥物控釋、軟組織支架構建等生物醫學工程領域中得到了廣泛的開發和應用[4-5]。自 1960 年 Wichterle 和 Lim 等制備出聚甲基丙烯酸-2-羥基乙酯水凝膠以來，有關高分子水凝膠的合成與性能研究十分活躍[6-10]，比如能夠在體內環境被分解的水凝膠、可被體內弱堿性條件下融蝕的水凝膠、能夠被酶分解的水凝膠、能以離子交換形式釋放蛋白質的水凝膠以及具有“記憶”功能的水凝膠等等[11-16]。由天然高分子與合成高分子材料共同生成的功能性水凝膠的研究也成為生命科學研究中的熱點，比如利用殼聚糖和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）合成具有良好組織親和性的功能水凝膠等[17-19]。也有一些報道將水凝膠化學接枝于生物支架上，以提高支架的親水性[20-21]。合成的水凝膠也可通過涂覆的方法用于對醫用導管的親水性改進，但是涂覆方法的牢固性欠佳，容易脫落，造成表面不均勻。故有人運用耦合劑或采用等離子體的方法進行化學鍵結合，不僅可以增加結合水凝膠層的厚度，也可以提高其附著牢固性[22-23]。除了上述物理和化學方法以外，表面氧化法也是一種常用的表面改性的方法。研究者通過具有強氧化性的試劑處理，使材料表面發生化學反應而生成親水基團，以此提高材料的表面親水性[24-25]。這種方法的缺點是系統中引入了強氧化劑，有可能因其殘留而對醫用材料的使用安全性造成危害。Iwata 等[26]曾將丙烯酸、丙烯酰胺邊聚合邊接枝在聚偏二氟乙烯材料上以改善其親水性。這類接枝反應大都運用合成類的高分子，如聚乙烯基吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）和聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA），通過物理涂覆或者化學鍵結合的方法改進導管的親水性或潤滑性[27-28]。
本研究以天然高分子材料葡聚糖（Dextran，Dex）為主要原料，在氮氣保護下，與烯丙基異氰酸酯（allyl isocyanate，AI）反應，首先合成預聚物（Dex-AI）；進一步將預聚物與聚乙二醇二丙烯酸酯（polyethylene glycol diacrylate，PEGDA）在紫外光（365 nm）照射下共聚反應，制備了高分子水凝膠 DP。將此水凝膠采用化學方法接枝于臨床上廣泛使用的醫用導管表面，檢測導管的表面親水性。然后在 ICR 小鼠體內植入水凝膠接枝后的導管，并與未改性的導管進行比較，評估導管的組織親和性，以期探討本文所提出的改性技術是否具有良好的應用前景。
1 材料和方法
1.1 主要試劑和儀器
葡聚糖（Dex，MW 40 000）購自國藥集團化學試劑有限公司；PEGDA（PEG 平均分子量 500）、異丙醇、二甲亞砜（DMSO）、環己烷、二苯甲酮、二月桂酸二丁基錫（DBTDL）等均購自阿拉丁試劑上海有限公司；AI 購自阿法埃莎天津化學有限公司；紫外光引發劑艷佳固（Irgacure 2959）購自東京化工業株式會社。上述試劑都為分析純。實驗中所用的醫用 PE 導管由寧波大學醫學院附屬醫院提供（靈洋醫療器械，浙江省臨海市）。
水接觸角測量儀（OCA 20 型，美國科諾工業有限公司）；臺式冷凍離心機（Centrifuge 5804R，Eppendorf AG，德國）；電熱恒溫干燥箱（DHG-9023A 型，上海精宏實驗設備有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（HH-2 型，常州國華電器有限公司）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌機（DF-101S 型，河南省予華儀器有限公司）；真空干燥箱（DZF-6050 型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；紫外儀（WD-9403B 型，北京市六一儀器廠）；表面張力接觸角儀（DIGIDROP，GBX，法國）；全自動血細胞分析儀（BM830，北京寶靈曼陽光科技有限公司）；顯微鏡（CX40，Olympus，日本）。
1.2 水凝膠 DP 的制備
Dex-AI 預聚物的合成：稱取干燥的葡聚糖（Dex）0.75 g，加入四口燒瓶，加 20 mL 無水 DMSO 使其溶解，在 N2 保護下，逐滴加入 AI 410 μL，30℃ 下反應 5 h。冷卻至室溫，在此溶液中加入過量冷的異丙醇，產生白色乳狀沉淀，用冷凍離心機 10 000 r/min 離心 5～6 min，將所得沉淀重復離心一次，在真空干燥箱中室溫干燥 1 d，即得 Dex-AI 預聚物。
水凝膠的合成：稱取上述干燥 Dex-AI 預聚物 0.58 g，加 PEGDA 795 μL，并加去離子水 15 mL（內含紫外光引發劑艷佳固 Irgacure 2959，0.5%），將上述混合溶液移入培養皿中，在紫外光（365 nm）下照射 1～3 h，得到水凝膠 DP。其合成路線見圖 1。
圖1
DP 水凝膠的合成路線圖
Figure1.
The chart of the hydrogel (DP) synthesis
1.3 超親水醫用導管的制備
稱取 0.3 g 二苯甲酮，室溫下溶于 15 mL 環己烷中。將醫用導管浸沒于其中，紫外光（365 nm）照射 40 min，取出導管，去離子水沖洗，真空干燥，備用，這樣處理的導管記為 A0。
將此導管置入由 Dex-AI、PEGDA、去離子水（內含紫外光引發劑艷佳固 2959 0.5%）組成的溶液體系中，365 nm 的紫外光下處理 1～3 h，取出導管，用去離子水沖洗三次，于真空干燥箱中室溫干燥 24 h，即得到超親水醫用導管，記為 B0。為了檢測只經二苯甲酮和紫外光處理后導管表面的變化情況，以區別于接枝水凝膠后導管的性能，在后面的檢測中均設立三組導管樣本，即未處理導管 a0、二苯甲酮處理導管 A0 以及二苯甲酮處理和 DP 接枝導管 B0。
1.4 吸水率
將上述制備的干燥后的超親水導管 B0，稱重記為 M0，將其置入去離子水中，分別在 1、4、9、24 h 后，取出瀝去多余水，分別稱重記為 Mx，按下式計算吸水率：
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1.5 表面接觸角
將處理后的導管從中間剖開，以雙面膠使其平置于載玻片上，對其表面進行兩項接觸角測試：靜態表面接觸角和動態表面接觸角。靜態接觸角在表面張力接觸角儀系統中于室溫下進行測試，每個樣品隨機檢測 3 個位置，用水量 1.0 μL，3 點平均所得即為接觸角值。動態接觸角在 Data physics OCA20 系統中于室溫下進行測試，每個樣品隨機檢測 3 個位置，去離子水用水量 1.0 μL，記錄每秒鐘水滴在樣品上的接觸角值。最終值以均值 ± 標準差所示。接觸角的大小可以反映導管表面對水的親和情況，接觸角愈小，親水性愈好。
1.6 動物體內組織相容性檢測
小鼠（ICR，5～8 周齡，雄性，體重 18～30 g）15 只，根據控制變量法的原理，保證實驗的可行性和實驗結果的科學性，將小鼠分為三組：空白組導管 a0，對照組導管 A0，實驗組導管 B0，每組各 5 只。將小鼠麻醉（腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉的氯化鈉溶液，0.10～0.20 mL）后，將其后背皮去毛，將 3 組醫用導管樣品（長度 1 cm）分別植入各組小鼠的后背皮下，1 只小鼠背部一側植入一個樣品，碘酒消毒后縫合皮膚，正常喂養。一定時間后將小鼠處死，切取導管樣品及周圍皮膚組織，對所取樣本進行固定包埋，行冷凍切片、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、顯微鏡拍照，以觀察導管周圍組織的情況，并與正常組織相比較。
同時，對植入導管樣品后小鼠的血液中白細胞（white blood cell，WBC）的變化情況進行檢測，以了解樣品植入體內后的急性炎癥反應情況。然后，分別在不同時間從小鼠尾靜脈處抽取血液，立即在全自動血細胞分析儀上進行血液常規檢測，得到白細胞總數。小鼠植入導管前測得的數值作為第 1 天的基礎值（Day1），不同時間點所測的白細胞數值與此基礎值相比較，以時間為變量作曲線，目的是觀察水凝膠接枝和未接枝的導管樣品在小鼠體內造成的炎癥情況，以檢測導管在小鼠體內的組織相容性。
實驗動物由寧波大學醫學院實驗動物中心提供，實驗也在此進行。所有動物實驗操作符合寧波大學倫理委員會和國家實驗動物規章的相關規定。
1.7 統計學分析
在研究過程中，所有數據資料采用 SPSS 統計學軟件行 t 檢驗，P < 0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果與討論
2.1 DP 水凝膠的親水性能
為確保成功改性醫用導管，我們首先對用于改性的水凝膠的制備及親水性能進行了探索。圖 2 匯總了不同單體比例及不同吸水時間時所得水凝膠的吸水能力。
圖2
不同配比的聚合物 DP 在不同吸水時間下的吸水率
Figure2.
The water absorption of DP hydrogels made from various monomer ratios as a function of time
力學性能與溶脹性有一個很好的平衡關系，適合的交聯密度對最終獲得的水凝膠擁有良好的力學和溶脹性能具有十分關鍵的作用[29-30]。在 DP 水凝膠的合成過程中，隨著交聯密度的增加，凝膠的力學強度隨之增加，而凝膠溶脹性能隨之下降，分子鏈的活動性下降，凝膠的彈性也下降。圖 2 是在 Dex-AI∶PEGDA 不同配比而其他條件都相同時，所制得 DP 水凝膠在純水中隨時間變化的吸水率，三種配比所獲得的 DP 在水中 1 h 時已有較高的吸水率，說明吸水速率很快，在 9 h 時基本達到最大值，而后直到 24 h 時吸水率變化不大，三種配比的水凝膠具有相似的變化趨勢。在三種配比的親水性能測試中，Dex-AI∶PEGDA 比值為 4∶6（質量比）的 DP 在所有實驗時間點內吸水率都是最大的，與其他兩種配比（5∶5 和 6∶4）相比差異具有統計學意義（P < 0.05），在水中 9 h 時吸水率達到 810%，具有相對更好的吸水速率和吸水率。因此，在下面的實驗中選擇以 4∶6 單體配比合成的水凝膠作為醫用導管表面接枝的最佳水凝膠材料。
2.2 導管表面接觸角
對醫用導管進行表面水接觸角測試，以檢測其對水的親和性，結果如圖 3 所示。在靜態接觸角測試中，未經處理的醫用導管（a0）其水接觸角在（97 ± 6.1）°，表面非常疏水，對于動物體的水環境是不親和的。導管經二苯甲酮處理（A0）后，理論上在表面產生了自由基，經靜態水接觸角測試也證實表面的親水性有所提高，從（97 ± 6.1）° 降到了（87 ± 3.1）°，但其親水性能仍未能達到長時間留置體內的要求。經 DP 水凝膠接枝后，導管（B0）的親水性得到顯著提高，水接觸角為（25 ± 4.2）°，與前兩組比較差異具有統計學意義。于是對 B0 導管作了動態接觸角測試，結果發現在 15 s 的時間內，接觸角即從最初的 33° 達到最小值（11°），而后達到平衡。證明水凝膠的引入顯著提高了導管的水親和性，如果用于動物體內也有望使導管與動物體的組織相容性得到顯著提高。
圖3
三組醫用導管的表面接觸角
a. 靜態表面接觸角；b. B0 導管隨時間變化的動態表面接觸角
Figure3. The contact angle of catheter surface of three kinds of medical cathetera. the static contact angle; b the dynamic contact angle of B0 catheter
2.3 改性前后的導管在動物體內的組織相容性
為了檢測改性前后導管在動物體內的組織相容性情況，以 ICR 小鼠為實驗動物，將導管樣本植入小鼠背部皮下，經一定時間后，首先對小鼠的白細胞變化情況進行了檢測，結果如圖 4 所示。
圖4
植入導管后小鼠的白細胞隨時間的變化情況
Figure4.
The WBC ratio of rats after catheter implantation
白細胞水平與動物體內急性炎癥反應的嚴重性成正相關。實驗中發現三種導管樣本均引起小鼠的急性炎癥反應，而且幾乎都在植入 10 天左右達到白細胞最高水平，而后隨著時間逐漸下降，在 30 天左右回復或接近回復到動物體基礎值。三種導管樣本之間比較，未經處理的導管其小鼠的白細胞水平最高（圖 4，a0），二苯甲酮處理的次之（圖 4，A0），經水凝膠接枝的導管組（圖 4，B0）小鼠的白細胞水平始終低于 a0 組和 A0 組，說明植入 B0 的動物體內急性炎性反應程度最輕。
導管植入后分別在第 5、15 和 30 天，對導管及周圍組織的情況進行了檢測，包括大體觀察和 HE 染色。圖 5 是三個導管樣本 a0、A0 和 B0 在小鼠皮下的大體觀察圖。從圖中可見 a0 組在這 3 個時間點導管周圍存在嚴重的炎癥、充血等不良反應，導管周圍明顯增生了許多小血管叢，尤其在第 5 天（a0-5d）時被一圈深紅色炎癥介質包繞，布滿密密麻麻的毛細血管網；導管 A0 在第 5、15 天時情況與 a0 相近，但在第 30 天時充血情況相對于 a0-30d 稍輕。相較之下，B0 組的導管周圍炎癥浸潤及血管增生現象較少，植入第 5 天時可見充血現象，但到第 30 天時（B0-30d）導管周邊組織已恢復正常，無明顯充血和炎癥現象。
圖5
導管植入小鼠皮下后樣本的大體觀察圖
Figure5.
The overview of the medical catheter after implanted subcutaneously into rats
為了更清晰地了解導管周邊的組織情況，對上述組織樣本進行冷凍切片及 HE 染色，結果如圖 6 所示。圖中 a0 樣本在三個時間點都存在局部炎癥介質的浸潤，即使到了第 30 天（a0-30d）還是有滿視野的炎性細胞。A0 的炎性情況比 a0 稍輕，相對來說，30 天的時候減少更明顯。而在 B0 組樣本，第 5 天的時候可見較多炎性細胞，但在第 15 天和第 30 天（B0-15d、B0-30d）時導管周邊組織層次清晰，無明顯炎癥細胞。這些結果充分說明了現有臨床用導管在植入動物體內時易被機體當作異物，引起周邊組織的炎癥反應，而經水凝膠改性后提高了導管的親水性，炎癥反應也明顯減輕。我們制備水凝膠所用的主要原料是天然多糖物質和具有良好性能的 PEG，安全無副作用。通過接觸角檢測和動物體內實驗，能更直觀地顯示改性后材料的親水性和組織相容性的變化情況。更深入的研究仍在進行中，改性方法也在繼續完善和改進，使其更加簡易和標準化，以適應將來規模生產。
3 結論
利用天然高分子與 PEG 反應成功制備了具有較高吸水率的水凝膠，并探索了不同條件對所制得水凝膠吸水率的影響，在葡聚糖和 PEG 比例為 4∶6 時得到水凝膠具有最大吸水率，達 810%。將此水凝膠接枝于臨床上的醫用導管，能顯著提高其親水性，表現為其表面水接觸角由原來的 97° 下降至 25°。親水性的提高使其對小鼠的組織相容性明顯提高，表現為導管植入后的白細胞水平明顯比未處理的導管組低，同時在較短時間內恢復到其基礎水平。大體觀察和組織學觀察（HE 染色）均反映了，經水凝膠接枝后的導管的組織相容性明顯優于未經水凝膠處理的現用導管。另外，在本文中所用導管由附屬醫院提供，是眾多臨床使用的醫用導管中的一種。由于本文所提出的水凝膠接枝技術并不受基體材料所限，此技術也同樣適用于其他材質和其他種類的醫用導管。因此，我們相信并希望能將此技術經進一步完善后推廣于臨床上所有導管的改性，這對于需較長時間置留于體內的醫用導管將是十分必要的，能減輕患者痛苦，減少二次治療，降低治療負擔。
由于本文所制水凝膠其原料安全無毒，制作過程簡便可行且不受接枝對象形狀所限，相信此改性技術將會具有很好的應用前景。
引言
醫用導管在臨床上應用非常廣泛。目前用以制備醫用導管類制品的材料主要有硅橡膠、塑料、聚氨酯及其共聚物等。這些高分子材料表面非常疏水，又沒有可與組織和細胞親和的活性成分，患者在使用后往往會引起嚴重的炎癥、疼痛等不良反應，對需要長時間在體內留置導管的患者，其并發癥尤為嚴重。導致這種情況的原因主要是：一方面，現有導管表面親水性差、摩擦系數大，導管與人體接觸時不能形成浸潤性表面而產生很大的摩擦；另一方面，導管植入體內后與肌肉、體液、血管等直接接觸，會引起人體的排異反應。如果炎癥嚴重的話還會造成導管與組織的粘連，醫生不得不在植入后非常短的時間內更換或易位導管，這在增加患者痛苦的同時，也增加了醫療費用。因此，制備具有良好生物相容性的醫用導管顯得十分迫切。
水凝膠是由親水性的聚合物鏈構成具有三維網絡結構的多元體系[1]，分子鏈上的親水基團以氫鍵與水分子相連接，使其具有強大鎖水功能的同時本身卻不被水所溶解[2]，大量的水分子可以保留在聚合物三維網絡結構中，從而形成水凝膠[3]。與此同時，人體組織中除了細胞以外，大部分是富含親水性的蛋白質和多糖類物質，這些物質在正常情況下組成與水凝膠類似的三維網絡結構，正因為如此，水凝膠在與人體相關的如藥物控釋、軟組織支架構建等生物醫學工程領域中得到了廣泛的開發和應用[4-5]。自 1960 年 Wichterle 和 Lim 等制備出聚甲基丙烯酸-2-羥基乙酯水凝膠以來，有關高分子水凝膠的合成與性能研究十分活躍[6-10]，比如能夠在體內環境被分解的水凝膠、可被體內弱堿性條件下融蝕的水凝膠、能夠被酶分解的水凝膠、能以離子交換形式釋放蛋白質的水凝膠以及具有“記憶”功能的水凝膠等等[11-16]。由天然高分子與合成高分子材料共同生成的功能性水凝膠的研究也成為生命科學研究中的熱點，比如利用殼聚糖和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）合成具有良好組織親和性的功能水凝膠等[17-19]。也有一些報道將水凝膠化學接枝于生物支架上，以提高支架的親水性[20-21]。合成的水凝膠也可通過涂覆的方法用于對醫用導管的親水性改進，但是涂覆方法的牢固性欠佳，容易脫落，造成表面不均勻。故有人運用耦合劑或采用等離子體的方法進行化學鍵結合，不僅可以增加結合水凝膠層的厚度，也可以提高其附著牢固性[22-23]。除了上述物理和化學方法以外，表面氧化法也是一種常用的表面改性的方法。研究者通過具有強氧化性的試劑處理，使材料表面發生化學反應而生成親水基團，以此提高材料的表面親水性[24-25]。這種方法的缺點是系統中引入了強氧化劑，有可能因其殘留而對醫用材料的使用安全性造成危害。Iwata 等[26]曾將丙烯酸、丙烯酰胺邊聚合邊接枝在聚偏二氟乙烯材料上以改善其親水性。這類接枝反應大都運用合成類的高分子，如聚乙烯基吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）和聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA），通過物理涂覆或者化學鍵結合的方法改進導管的親水性或潤滑性[27-28]。
本研究以天然高分子材料葡聚糖（Dextran，Dex）為主要原料，在氮氣保護下，與烯丙基異氰酸酯（allyl isocyanate，AI）反應，首先合成預聚物（Dex-AI）；進一步將預聚物與聚乙二醇二丙烯酸酯（polyethylene glycol diacrylate，PEGDA）在紫外光（365 nm）照射下共聚反應，制備了高分子水凝膠 DP。將此水凝膠采用化學方法接枝于臨床上廣泛使用的醫用導管表面，檢測導管的表面親水性。然后在 ICR 小鼠體內植入水凝膠接枝后的導管，并與未改性的導管進行比較，評估導管的組織親和性，以期探討本文所提出的改性技術是否具有良好的應用前景。
1 材料和方法
1.1 主要試劑和儀器
葡聚糖（Dex，MW 40 000）購自國藥集團化學試劑有限公司；PEGDA（PEG 平均分子量 500）、異丙醇、二甲亞砜（DMSO）、環己烷、二苯甲酮、二月桂酸二丁基錫（DBTDL）等均購自阿拉丁試劑上海有限公司；AI 購自阿法埃莎天津化學有限公司；紫外光引發劑艷佳固（Irgacure 2959）購自東京化工業株式會社。上述試劑都為分析純。實驗中所用的醫用 PE 導管由寧波大學醫學院附屬醫院提供（靈洋醫療器械，浙江省臨海市）。
水接觸角測量儀（OCA 20 型，美國科諾工業有限公司）；臺式冷凍離心機（Centrifuge 5804R，Eppendorf AG，德國）；電熱恒溫干燥箱（DHG-9023A 型，上海精宏實驗設備有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（HH-2 型，常州國華電器有限公司）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌機（DF-101S 型，河南省予華儀器有限公司）；真空干燥箱（DZF-6050 型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；紫外儀（WD-9403B 型，北京市六一儀器廠）；表面張力接觸角儀（DIGIDROP，GBX，法國）；全自動血細胞分析儀（BM830，北京寶靈曼陽光科技有限公司）；顯微鏡（CX40，Olympus，日本）。
1.2 水凝膠 DP 的制備
Dex-AI 預聚物的合成：稱取干燥的葡聚糖（Dex）0.75 g，加入四口燒瓶，加 20 mL 無水 DMSO 使其溶解，在 N2 保護下，逐滴加入 AI 410 μL，30℃ 下反應 5 h。冷卻至室溫，在此溶液中加入過量冷的異丙醇，產生白色乳狀沉淀，用冷凍離心機 10 000 r/min 離心 5～6 min，將所得沉淀重復離心一次，在真空干燥箱中室溫干燥 1 d，即得 Dex-AI 預聚物。
水凝膠的合成：稱取上述干燥 Dex-AI 預聚物 0.58 g，加 PEGDA 795 μL，并加去離子水 15 mL（內含紫外光引發劑艷佳固 Irgacure 2959，0.5%），將上述混合溶液移入培養皿中，在紫外光（365 nm）下照射 1～3 h，得到水凝膠 DP。其合成路線見圖 1。
圖1
DP 水凝膠的合成路線圖
Figure1.
The chart of the hydrogel (DP) synthesis
1.3 超親水醫用導管的制備
稱取 0.3 g 二苯甲酮，室溫下溶于 15 mL 環己烷中。將醫用導管浸沒于其中，紫外光（365 nm）照射 40 min，取出導管，去離子水沖洗，真空干燥，備用，這樣處理的導管記為 A0。
將此導管置入由 Dex-AI、PEGDA、去離子水（內含紫外光引發劑艷佳固 2959 0.5%）組成的溶液體系中，365 nm 的紫外光下處理 1～3 h，取出導管，用去離子水沖洗三次，于真空干燥箱中室溫干燥 24 h，即得到超親水醫用導管，記為 B0。為了檢測只經二苯甲酮和紫外光處理后導管表面的變化情況，以區別于接枝水凝膠后導管的性能，在后面的檢測中均設立三組導管樣本，即未處理導管 a0、二苯甲酮處理導管 A0 以及二苯甲酮處理和 DP 接枝導管 B0。
1.4 吸水率
將上述制備的干燥后的超親水導管 B0，稱重記為 M0，將其置入去離子水中，分別在 1、4、9、24 h 后，取出瀝去多余水，分別稱重記為 Mx，按下式計算吸水率：
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1.5 表面接觸角
將處理后的導管從中間剖開，以雙面膠使其平置于載玻片上，對其表面進行兩項接觸角測試：靜態表面接觸角和動態表面接觸角。靜態接觸角在表面張力接觸角儀系統中于室溫下進行測試，每個樣品隨機檢測 3 個位置，用水量 1.0 μL，3 點平均所得即為接觸角值。動態接觸角在 Data physics OCA20 系統中于室溫下進行測試，每個樣品隨機檢測 3 個位置，去離子水用水量 1.0 μL，記錄每秒鐘水滴在樣品上的接觸角值。最終值以均值 ± 標準差所示。接觸角的大小可以反映導管表面對水的親和情況，接觸角愈小，親水性愈好。
1.6 動物體內組織相容性檢測
小鼠（ICR，5～8 周齡，雄性，體重 18～30 g）15 只，根據控制變量法的原理，保證實驗的可行性和實驗結果的科學性，將小鼠分為三組：空白組導管 a0，對照組導管 A0，實驗組導管 B0，每組各 5 只。將小鼠麻醉（腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉的氯化鈉溶液，0.10～0.20 mL）后，將其后背皮去毛，將 3 組醫用導管樣品（長度 1 cm）分別植入各組小鼠的后背皮下，1 只小鼠背部一側植入一個樣品，碘酒消毒后縫合皮膚，正常喂養。一定時間后將小鼠處死，切取導管樣品及周圍皮膚組織，對所取樣本進行固定包埋，行冷凍切片、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、顯微鏡拍照，以觀察導管周圍組織的情況，并與正常組織相比較。
同時，對植入導管樣品后小鼠的血液中白細胞（white blood cell，WBC）的變化情況進行檢測，以了解樣品植入體內后的急性炎癥反應情況。然后，分別在不同時間從小鼠尾靜脈處抽取血液，立即在全自動血細胞分析儀上進行血液常規檢測，得到白細胞總數。小鼠植入導管前測得的數值作為第 1 天的基礎值（Day1），不同時間點所測的白細胞數值與此基礎值相比較，以時間為變量作曲線，目的是觀察水凝膠接枝和未接枝的導管樣品在小鼠體內造成的炎癥情況，以檢測導管在小鼠體內的組織相容性。
實驗動物由寧波大學醫學院實驗動物中心提供，實驗也在此進行。所有動物實驗操作符合寧波大學倫理委員會和國家實驗動物規章的相關規定。
1.7 統計學分析
在研究過程中，所有數據資料采用 SPSS 統計學軟件行 t 檢驗，P < 0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果與討論
2.1 DP 水凝膠的親水性能
為確保成功改性醫用導管，我們首先對用于改性的水凝膠的制備及親水性能進行了探索。圖 2 匯總了不同單體比例及不同吸水時間時所得水凝膠的吸水能力。
圖2
不同配比的聚合物 DP 在不同吸水時間下的吸水率
Figure2.
The water absorption of DP hydrogels made from various monomer ratios as a function of time
力學性能與溶脹性有一個很好的平衡關系，適合的交聯密度對最終獲得的水凝膠擁有良好的力學和溶脹性能具有十分關鍵的作用[29-30]。在 DP 水凝膠的合成過程中，隨著交聯密度的增加，凝膠的力學強度隨之增加，而凝膠溶脹性能隨之下降，分子鏈的活動性下降，凝膠的彈性也下降。圖 2 是在 Dex-AI∶PEGDA 不同配比而其他條件都相同時，所制得 DP 水凝膠在純水中隨時間變化的吸水率，三種配比所獲得的 DP 在水中 1 h 時已有較高的吸水率，說明吸水速率很快，在 9 h 時基本達到最大值，而后直到 24 h 時吸水率變化不大，三種配比的水凝膠具有相似的變化趨勢。在三種配比的親水性能測試中，Dex-AI∶PEGDA 比值為 4∶6（質量比）的 DP 在所有實驗時間點內吸水率都是最大的，與其他兩種配比（5∶5 和 6∶4）相比差異具有統計學意義（P < 0.05），在水中 9 h 時吸水率達到 810%，具有相對更好的吸水速率和吸水率。因此，在下面的實驗中選擇以 4∶6 單體配比合成的水凝膠作為醫用導管表面接枝的最佳水凝膠材料。
2.2 導管表面接觸角
對醫用導管進行表面水接觸角測試，以檢測其對水的親和性，結果如圖 3 所示。在靜態接觸角測試中，未經處理的醫用導管（a0）其水接觸角在（97 ± 6.1）°，表面非常疏水，對于動物體的水環境是不親和的。導管經二苯甲酮處理（A0）后，理論上在表面產生了自由基，經靜態水接觸角測試也證實表面的親水性有所提高，從（97 ± 6.1）° 降到了（87 ± 3.1）°，但其親水性能仍未能達到長時間留置體內的要求。經 DP 水凝膠接枝后，導管（B0）的親水性得到顯著提高，水接觸角為（25 ± 4.2）°，與前兩組比較差異具有統計學意義。于是對 B0 導管作了動態接觸角測試，結果發現在 15 s 的時間內，接觸角即從最初的 33° 達到最小值（11°），而后達到平衡。證明水凝膠的引入顯著提高了導管的水親和性，如果用于動物體內也有望使導管與動物體的組織相容性得到顯著提高。
圖3
三組醫用導管的表面接觸角
a. 靜態表面接觸角；b. B0 導管隨時間變化的動態表面接觸角
Figure3. The contact angle of catheter surface of three kinds of medical cathetera. the static contact angle; b the dynamic contact angle of B0 catheter
2.3 改性前后的導管在動物體內的組織相容性
為了檢測改性前后導管在動物體內的組織相容性情況，以 ICR 小鼠為實驗動物，將導管樣本植入小鼠背部皮下，經一定時間后，首先對小鼠的白細胞變化情況進行了檢測，結果如圖 4 所示。
圖4
植入導管后小鼠的白細胞隨時間的變化情況
Figure4.
The WBC ratio of rats after catheter implantation
白細胞水平與動物體內急性炎癥反應的嚴重性成正相關。實驗中發現三種導管樣本均引起小鼠的急性炎癥反應，而且幾乎都在植入 10 天左右達到白細胞最高水平，而后隨著時間逐漸下降，在 30 天左右回復或接近回復到動物體基礎值。三種導管樣本之間比較，未經處理的導管其小鼠的白細胞水平最高（圖 4，a0），二苯甲酮處理的次之（圖 4，A0），經水凝膠接枝的導管組（圖 4，B0）小鼠的白細胞水平始終低于 a0 組和 A0 組，說明植入 B0 的動物體內急性炎性反應程度最輕。
導管植入后分別在第 5、15 和 30 天，對導管及周圍組織的情況進行了檢測，包括大體觀察和 HE 染色。圖 5 是三個導管樣本 a0、A0 和 B0 在小鼠皮下的大體觀察圖。從圖中可見 a0 組在這 3 個時間點導管周圍存在嚴重的炎癥、充血等不良反應，導管周圍明顯增生了許多小血管叢，尤其在第 5 天（a0-5d）時被一圈深紅色炎癥介質包繞，布滿密密麻麻的毛細血管網；導管 A0 在第 5、15 天時情況與 a0 相近，但在第 30 天時充血情況相對于 a0-30d 稍輕。相較之下，B0 組的導管周圍炎癥浸潤及血管增生現象較少，植入第 5 天時可見充血現象，但到第 30 天時（B0-30d）導管周邊組織已恢復正常，無明顯充血和炎癥現象。
圖5
導管植入小鼠皮下后樣本的大體觀察圖
Figure5.
The overview of the medical catheter after implanted subcutaneously into rats
為了更清晰地了解導管周邊的組織情況，對上述組織樣本進行冷凍切片及 HE 染色，結果如圖 6 所示。圖中 a0 樣本在三個時間點都存在局部炎癥介質的浸潤，即使到了第 30 天（a0-30d）還是有滿視野的炎性細胞。A0 的炎性情況比 a0 稍輕，相對來說，30 天的時候減少更明顯。而在 B0 組樣本，第 5 天的時候可見較多炎性細胞，但在第 15 天和第 30 天（B0-15d、B0-30d）時導管周邊組織層次清晰，無明顯炎癥細胞。這些結果充分說明了現有臨床用導管在植入動物體內時易被機體當作異物，引起周邊組織的炎癥反應，而經水凝膠改性后提高了導管的親水性，炎癥反應也明顯減輕。我們制備水凝膠所用的主要原料是天然多糖物質和具有良好性能的 PEG，安全無副作用。通過接觸角檢測和動物體內實驗，能更直觀地顯示改性后材料的親水性和組織相容性的變化情況。更深入的研究仍在進行中，改性方法也在繼續完善和改進，使其更加簡易和標準化，以適應將來規模生產。
3 結論
利用天然高分子與 PEG 反應成功制備了具有較高吸水率的水凝膠，并探索了不同條件對所制得水凝膠吸水率的影響，在葡聚糖和 PEG 比例為 4∶6 時得到水凝膠具有最大吸水率，達 810%。將此水凝膠接枝于臨床上的醫用導管，能顯著提高其親水性，表現為其表面水接觸角由原來的 97° 下降至 25°。親水性的提高使其對小鼠的組織相容性明顯提高，表現為導管植入后的白細胞水平明顯比未處理的導管組低，同時在較短時間內恢復到其基礎水平。大體觀察和組織學觀察（HE 染色）均反映了，經水凝膠接枝后的導管的組織相容性明顯優于未經水凝膠處理的現用導管。另外，在本文中所用導管由附屬醫院提供，是眾多臨床使用的醫用導管中的一種。由于本文所提出的水凝膠接枝技術并不受基體材料所限，此技術也同樣適用于其他材質和其他種類的醫用導管。因此，我們相信并希望能將此技術經進一步完善后推廣于臨床上所有導管的改性，這對于需較長時間置留于體內的醫用導管將是十分必要的，能減輕患者痛苦，減少二次治療，降低治療負擔。
由于本文所制水凝膠其原料安全無毒，制作過程簡便可行且不受接枝對象形狀所限，相信此改性技術將會具有很好的應用前景。
