生物型人工肝臟支持系統（BALSS）具有肝臟的解毒、提供營養及改善內環境等功能，為治療肝功能衰竭提供了新方法，也為患者等待肝移植爭取了時間。生物反應器和具有良好生物活性的肝細胞是 BALSS 的核心，決定著治療效果。在長時間的治療過程中，肝細胞的功能活性會產生較大變化，因此為保證 BALSS 的治療效果，檢測肝細胞狀態十分重要。本文介紹了表征細胞損傷程度、解毒功能以及合成功能這三方面的指標及其常用檢測方法，總結了細胞狀態檢測技術在 BALSS 中的應用并討論了其發展趨勢。
引用本文： 許詩晨, 吳昌哲, 張廣浩, 張丞, 霍小林. 用于生物型人工肝臟支持系統的肝細胞狀態檢測及應用進展. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(1): 151-155. doi: 10.7507/1001-5515.201705066 復制
引言
生物型人工肝臟支持系統（bioartificial liver support system，BALSS）是使肝細胞與患者血漿通過半透膜或直接接觸的方法進行雙向物質交換的體外支持系統，具有肝臟的解毒、提供營養及改善內環境等功能，其發展為肝功能衰竭的治療提供了新方法，并為患者等待肝移植爭取了時間[1]。
BALSS 的核心部件是生物反應器，生物反應器為肝細胞與患者血漿提供了物質交換場所[2]。生物反應器內裝有具備解毒、代謝、合成等功能的高活性肝細胞，這是 BALSS 區別于其他非生物人工肝支持系統的關鍵。這些肝細胞在治療過程中可以代替受損肝臟實現大部分功能[3-4]，其生物活性決定著治療效果[5-6]。為保證 BALSS 具有良好的體外支持功能，其裝載的肝細胞必須始終保持良好的功能和活性，在長時間的治療過程中，這些肝細胞的生物活性將發生很大變化，因此，醫護人員必須經常檢測肝細胞狀態，及時掌握細胞狀態信息[7-8]，以便作出及時有效的應對措施。
1 現有肝細胞狀態檢測方法和應用
1.1 現有肝細胞狀態檢測指標及方法
為掌握細胞狀態，首先需要選擇合適的評價指標。在現有的研究和臨床應用中，對肝細胞狀態的評估，主要集中在損傷程度、解毒功能和合成功能等方面。目前常用指標有：丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰轉肽酶、總膽紅素（total bilirubin，TBil）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，Alb）、免疫球蛋白、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、尿素等[9-12]。
ALT 是肝細胞內血清酶的一種，主要存在于細胞質中，是反映肝細胞受損最敏感的指標，也是目前評價肝細胞功能損傷程度使用最多的指標[13]。檢測 ALT 濃度常用的方法有：速率法和賴氏檢測法[14-15]。速率法方便、精確但是重復性差，多需使用紫外分光光度計，成本高昂[16]；賴氏比色法工作量較大，加樣和加試劑都不可避免地引入誤差，影響了檢測的準確度和精密度[17]。
肝細胞解毒功能的主要檢測指標是尿素合成量。氨是機體正常代謝產物，具有毒性，體內的氨主要在肝內合成尿素而解毒，因此，通過檢測尿素合成量可以評價肝細胞的解毒功能。檢測尿素合成量的常用方法有：脲酶-波氏比色法[18]和酶偶聯速率法[19]。脲酶-波氏比色法能有效縮短反應時間，其靈敏度高、線性良好、精密度好，且操作簡便不需要避光處理[20]；速率法特異性高、檢測快、結果準確精密，但是該法所用的試劑價格昂貴，且溶解后很不穩定，檢測需要紫外分光光度計，成本較高[21]。
肝細胞合成功能的主要檢測指標是白蛋白合成量[22-23]。白蛋白（又稱清蛋白）由肝實質細胞合成，在血漿中的半衰期為 15～19 d，是血漿中含量最多的蛋白質，占血漿總蛋白的 40%～60%，可迅速地從外周血中檢測到其在肝內合成量的減少，是反映肝臟蛋白質合成的敏感指標。檢測白蛋白通常選用溴甲酚綠法[24]，該方法操作簡便快捷，但是對時間和反應液 pH 值的控制要求較高。
1.2 肝細胞狀態檢測在 BALSS 中的應用
肝細胞能否符合臨床需求是決定 BALSS 能否成功應用的關鍵[25]。在 BALSS 的研究進程中，研究人員基于人類原代肝細胞、豬肝細胞和人肝癌細胞系[26]等多種細胞來源，開展了大量的實驗研究，但都因為種種原因限制了它們在 BALSS 中的應用，因此，篩選出滿足需求的細胞來源仍舊是亟待研究者們解決的問題。在細胞篩選過程中，檢測細胞狀態至關重要。2013 年，荷蘭科學家以尿素和乳酸合成量等作為評價指標，證實 HepaRG 細胞具有良好的功能性并強調了其在 BALSS 中的應用潛力[27]。2016 年，中國科學院上海生命科學研究院惠利健團隊[28]開展 hiHep 生物人工肝臨床治療，選擇總膽紅素、ALT、AST 作為指標，證明 hiHep 細胞能整合到小鼠肝臟中，并且能在小鼠體內發揮肝實質細胞的功能，為細胞來源的選擇提供了新方向。
在 BALSS 的發展歷程中，研究者們研制出的反應器類型多樣，依賴細胞狀態的檢測能幫助選擇出更合適的反應器。2016 年，郭歡等[29]通過檢測肝細胞內尿素和白蛋白合成量，評估其研制的海藻酸鈉/殼聚糖微囊的安全性，同時論證了該微囊作為替代囊膜用于生物人工肝的應用前景。2017 年，Damania 等[30]用葡萄糖濃度、尿素和白蛋白合成量作為評價指標，驗證得出細胞在其研發的集成冷凝混合反應器內生長狀態良好的結論，進一步證明該反應器能夠有效抑制急性肝衰竭的細胞毒性，從而可以更好地應用于臨床治療。
2 BALSS 細胞狀態檢測發展新方向
BALSS 細胞狀態檢測對 BALSS 的發展有著重要意義并且具有廣闊的研究前景，但是現有的檢測方法還存在以下問題：① 多為離線檢測，耗時長，檢測結果反饋不及時，這將影響對反應器內技術參數的控制，降低營養物質添加的有效性，從而影響 BALSS 的治療效果；② 需要定時將反應器內的培養液取樣后送至生化檢測室檢測，容易造成樣品損耗，影響患者血液動力學平衡，也容易導致污染；③ 檢測到的細胞狀態不夠全面，目前常用的指標能在一定程度上反映細胞的損傷度和功能性，但是獲取信息仍不全面。綜合上述現存檢測方法的不足，目前 BALSS 細胞檢測技術的研究有以下幾點新方向。
2.1 檢測在線化
近年來，細胞狀態在線檢測已經成為了一種研究趨勢，越來越多的研究者借助數學和計算機系統對生化反應過程建模并進行優化[31]。2010 年，Hollmann 等[32]對甲基鉍物種進行平行在線檢測，并將檢測結果作為人類肝細胞鉍甲基化的證據；山東大學林建強團隊[33]在 2012 年成功使用電容法在線檢測細胞密度，實現了在微生物發酵過程中的細胞密度在線檢測，并成功地對底物濃度進行實時控制；2017 年，Murray 等[34]將 3 個在線數據與原發性循環前列腺細胞的檢測結果進行比較，實現在初始活檢時對前列腺癌的預測。
中國科學院電工研究所近年來對生物人工肝細胞狀態的在線檢測進行了大量的研究，并且取得一定成果，首次使用超亮發光二極管作為測量光源，采用長程液芯波導吸收池作為樣品池，設計出一套光機結構，發光二極管發出的光透過比色池中的反應溶液，由集成光電傳感器接收并將其轉化為檢測指標的濃度信號，傳輸給控制電路和數據采集系統。控制電路和數據采集系統采用單片機作為核心處理單元，將吸光度的檢測結果直接發送給單片機[35]。該檢測系統能夠方便地集成在 BALSS 系統中，實現在線定性檢測的功能。該系統結果原理圖如圖 1 所示。
圖1
生物人工肝在線快速細胞檢測系統結構原理圖
Figure1.
The structure schematic of the on-line rapid cell detection system of biological artificial liver
2.2 取樣微量化
為了減少取樣損耗，研究者們在檢測方法上不斷探索如何在樣品和試劑的混合過程中減少采樣量，同時保證檢測結果精確。近年來，在少量樣品和試劑的高效混合方面取得了一定進展。
2010 年新加坡的 Tan 等[36]在 Sequist 等[37]設計用于分離循環腫瘤細胞的微流體芯片的基礎上，采用微流控技術，成功地從癌癥患者的外周血中對循環腫瘤細胞進行微量檢測。中國科學院電工研究所近年來也在 BALSS 細胞狀態微檢測方面取得一定進展，開發出一套微量實時檢測系統[38-40]。該系統采用由多個微通道構成的微流控芯片進行取樣，通過微溝道混合芯片實現試劑與樣品之間的高效混合，實現了 ALT 和尿素等指標的微量檢測。該方法可以應用于在線檢測，為 BALSS 的在線微量檢測奠定了基礎。
2.3 檢測指標多樣化
雖然上述生化指標能在一定程度上反映細胞的損傷度和功能性狀態，但是這些檢測方法仍不能完全表征細胞的所有特性。例如，無法獲取細胞數量以及細胞膜完整性和通透性的狀態信息，而這些狀態信息與細胞的功能以及活性息息相關。因此在當前的研究中，研究者們正在探索新的指標以及方法，使檢測到的細胞狀態更加全面。
2013 年，方云等[41]研究了人肝癌細胞的電阻抗特性，通過測量肝癌細胞電阻抗，獲得人肝癌 SMMC-7721 細胞電阻抗頻譜。研究中還將正常細胞和人肝癌細胞的電阻抗特性進行了比較，并對細胞電阻抗和細胞膜之間的關系建立模型，成功利用細胞電阻抗表征細胞的特性，為細胞質量監測和用于細胞培養的病毒疫苗生產過程的在線檢測提供了基礎[42]。然而這一技術目前尚未應用到 BALSS 的細胞檢測中。
3 總結與展望
肝細胞狀態檢測對 BALSS 的研究和應用起著重要作用，現有的肝細胞狀態檢測技術無法滿足 BALSS 治療對肝細胞狀態檢測的實時性、微量化等需求，存在自動取樣困難、防污染問題突出等不足，但是目前研究者們對應用到 BALSS 中的在線微量檢測方法做出了積極的嘗試，以期實時監測細胞狀態，改善 BALSS 的治療效果。因此，在今后的研究中還需要進一步拓展思路，深入肝細胞檢測的實時、在線、微量化方面的研究，解決自動取樣困難和控制系統復雜、小型化等難點；選擇的檢測方法也必須適應在線系統快速檢測的要求，同時需要綜合考慮多種指標檢測方法的兼容性。在減少檢測樣品損耗方面，需要進一步選擇混合芯片并需考慮如何將這些檢測系統集成至 BALSS 中。此外，檢測指標的選取應該更加多樣化，除了傳統的生化指標，還應聯合其他物理量，多方位地展示反應器中細胞的狀態，以幫助操作者更好地進行調控。隨著 BALSS 研究的日益推進，作為 BALSS 研究中不可或缺的一部分，細胞狀態檢測的研究意義重大并且有待進一步深入和完善。
引言
生物型人工肝臟支持系統（bioartificial liver support system，BALSS）是使肝細胞與患者血漿通過半透膜或直接接觸的方法進行雙向物質交換的體外支持系統，具有肝臟的解毒、提供營養及改善內環境等功能，其發展為肝功能衰竭的治療提供了新方法，并為患者等待肝移植爭取了時間[1]。
BALSS 的核心部件是生物反應器，生物反應器為肝細胞與患者血漿提供了物質交換場所[2]。生物反應器內裝有具備解毒、代謝、合成等功能的高活性肝細胞，這是 BALSS 區別于其他非生物人工肝支持系統的關鍵。這些肝細胞在治療過程中可以代替受損肝臟實現大部分功能[3-4]，其生物活性決定著治療效果[5-6]。為保證 BALSS 具有良好的體外支持功能，其裝載的肝細胞必須始終保持良好的功能和活性，在長時間的治療過程中，這些肝細胞的生物活性將發生很大變化，因此，醫護人員必須經常檢測肝細胞狀態，及時掌握細胞狀態信息[7-8]，以便作出及時有效的應對措施。
1 現有肝細胞狀態檢測方法和應用
1.1 現有肝細胞狀態檢測指標及方法
為掌握細胞狀態，首先需要選擇合適的評價指標。在現有的研究和臨床應用中，對肝細胞狀態的評估，主要集中在損傷程度、解毒功能和合成功能等方面。目前常用指標有：丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰轉肽酶、總膽紅素（total bilirubin，TBil）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，Alb）、免疫球蛋白、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、尿素等[9-12]。
ALT 是肝細胞內血清酶的一種，主要存在于細胞質中，是反映肝細胞受損最敏感的指標，也是目前評價肝細胞功能損傷程度使用最多的指標[13]。檢測 ALT 濃度常用的方法有：速率法和賴氏檢測法[14-15]。速率法方便、精確但是重復性差，多需使用紫外分光光度計，成本高昂[16]；賴氏比色法工作量較大，加樣和加試劑都不可避免地引入誤差，影響了檢測的準確度和精密度[17]。
肝細胞解毒功能的主要檢測指標是尿素合成量。氨是機體正常代謝產物，具有毒性，體內的氨主要在肝內合成尿素而解毒，因此，通過檢測尿素合成量可以評價肝細胞的解毒功能。檢測尿素合成量的常用方法有：脲酶-波氏比色法[18]和酶偶聯速率法[19]。脲酶-波氏比色法能有效縮短反應時間，其靈敏度高、線性良好、精密度好，且操作簡便不需要避光處理[20]；速率法特異性高、檢測快、結果準確精密，但是該法所用的試劑價格昂貴，且溶解后很不穩定，檢測需要紫外分光光度計，成本較高[21]。
肝細胞合成功能的主要檢測指標是白蛋白合成量[22-23]。白蛋白（又稱清蛋白）由肝實質細胞合成，在血漿中的半衰期為 15～19 d，是血漿中含量最多的蛋白質，占血漿總蛋白的 40%～60%，可迅速地從外周血中檢測到其在肝內合成量的減少，是反映肝臟蛋白質合成的敏感指標。檢測白蛋白通常選用溴甲酚綠法[24]，該方法操作簡便快捷，但是對時間和反應液 pH 值的控制要求較高。
1.2 肝細胞狀態檢測在 BALSS 中的應用
肝細胞能否符合臨床需求是決定 BALSS 能否成功應用的關鍵[25]。在 BALSS 的研究進程中，研究人員基于人類原代肝細胞、豬肝細胞和人肝癌細胞系[26]等多種細胞來源，開展了大量的實驗研究，但都因為種種原因限制了它們在 BALSS 中的應用，因此，篩選出滿足需求的細胞來源仍舊是亟待研究者們解決的問題。在細胞篩選過程中，檢測細胞狀態至關重要。2013 年，荷蘭科學家以尿素和乳酸合成量等作為評價指標，證實 HepaRG 細胞具有良好的功能性并強調了其在 BALSS 中的應用潛力[27]。2016 年，中國科學院上海生命科學研究院惠利健團隊[28]開展 hiHep 生物人工肝臨床治療，選擇總膽紅素、ALT、AST 作為指標，證明 hiHep 細胞能整合到小鼠肝臟中，并且能在小鼠體內發揮肝實質細胞的功能，為細胞來源的選擇提供了新方向。
在 BALSS 的發展歷程中，研究者們研制出的反應器類型多樣，依賴細胞狀態的檢測能幫助選擇出更合適的反應器。2016 年，郭歡等[29]通過檢測肝細胞內尿素和白蛋白合成量，評估其研制的海藻酸鈉/殼聚糖微囊的安全性，同時論證了該微囊作為替代囊膜用于生物人工肝的應用前景。2017 年，Damania 等[30]用葡萄糖濃度、尿素和白蛋白合成量作為評價指標，驗證得出細胞在其研發的集成冷凝混合反應器內生長狀態良好的結論，進一步證明該反應器能夠有效抑制急性肝衰竭的細胞毒性，從而可以更好地應用于臨床治療。
2 BALSS 細胞狀態檢測發展新方向
BALSS 細胞狀態檢測對 BALSS 的發展有著重要意義并且具有廣闊的研究前景，但是現有的檢測方法還存在以下問題：① 多為離線檢測，耗時長，檢測結果反饋不及時，這將影響對反應器內技術參數的控制，降低營養物質添加的有效性，從而影響 BALSS 的治療效果；② 需要定時將反應器內的培養液取樣后送至生化檢測室檢測，容易造成樣品損耗，影響患者血液動力學平衡，也容易導致污染；③ 檢測到的細胞狀態不夠全面，目前常用的指標能在一定程度上反映細胞的損傷度和功能性，但是獲取信息仍不全面。綜合上述現存檢測方法的不足，目前 BALSS 細胞檢測技術的研究有以下幾點新方向。
2.1 檢測在線化
近年來，細胞狀態在線檢測已經成為了一種研究趨勢，越來越多的研究者借助數學和計算機系統對生化反應過程建模并進行優化[31]。2010 年，Hollmann 等[32]對甲基鉍物種進行平行在線檢測，并將檢測結果作為人類肝細胞鉍甲基化的證據；山東大學林建強團隊[33]在 2012 年成功使用電容法在線檢測細胞密度，實現了在微生物發酵過程中的細胞密度在線檢測，并成功地對底物濃度進行實時控制；2017 年，Murray 等[34]將 3 個在線數據與原發性循環前列腺細胞的檢測結果進行比較，實現在初始活檢時對前列腺癌的預測。
中國科學院電工研究所近年來對生物人工肝細胞狀態的在線檢測進行了大量的研究，并且取得一定成果，首次使用超亮發光二極管作為測量光源，采用長程液芯波導吸收池作為樣品池，設計出一套光機結構，發光二極管發出的光透過比色池中的反應溶液，由集成光電傳感器接收并將其轉化為檢測指標的濃度信號，傳輸給控制電路和數據采集系統。控制電路和數據采集系統采用單片機作為核心處理單元，將吸光度的檢測結果直接發送給單片機[35]。該檢測系統能夠方便地集成在 BALSS 系統中，實現在線定性檢測的功能。該系統結果原理圖如圖 1 所示。
圖1
生物人工肝在線快速細胞檢測系統結構原理圖
Figure1.
The structure schematic of the on-line rapid cell detection system of biological artificial liver
2.2 取樣微量化
為了減少取樣損耗，研究者們在檢測方法上不斷探索如何在樣品和試劑的混合過程中減少采樣量，同時保證檢測結果精確。近年來，在少量樣品和試劑的高效混合方面取得了一定進展。
2010 年新加坡的 Tan 等[36]在 Sequist 等[37]設計用于分離循環腫瘤細胞的微流體芯片的基礎上，采用微流控技術，成功地從癌癥患者的外周血中對循環腫瘤細胞進行微量檢測。中國科學院電工研究所近年來也在 BALSS 細胞狀態微檢測方面取得一定進展，開發出一套微量實時檢測系統[38-40]。該系統采用由多個微通道構成的微流控芯片進行取樣，通過微溝道混合芯片實現試劑與樣品之間的高效混合，實現了 ALT 和尿素等指標的微量檢測。該方法可以應用于在線檢測，為 BALSS 的在線微量檢測奠定了基礎。
2.3 檢測指標多樣化
雖然上述生化指標能在一定程度上反映細胞的損傷度和功能性狀態，但是這些檢測方法仍不能完全表征細胞的所有特性。例如，無法獲取細胞數量以及細胞膜完整性和通透性的狀態信息，而這些狀態信息與細胞的功能以及活性息息相關。因此在當前的研究中，研究者們正在探索新的指標以及方法，使檢測到的細胞狀態更加全面。
2013 年，方云等[41]研究了人肝癌細胞的電阻抗特性，通過測量肝癌細胞電阻抗，獲得人肝癌 SMMC-7721 細胞電阻抗頻譜。研究中還將正常細胞和人肝癌細胞的電阻抗特性進行了比較，并對細胞電阻抗和細胞膜之間的關系建立模型，成功利用細胞電阻抗表征細胞的特性，為細胞質量監測和用于細胞培養的病毒疫苗生產過程的在線檢測提供了基礎[42]。然而這一技術目前尚未應用到 BALSS 的細胞檢測中。
3 總結與展望
肝細胞狀態檢測對 BALSS 的研究和應用起著重要作用，現有的肝細胞狀態檢測技術無法滿足 BALSS 治療對肝細胞狀態檢測的實時性、微量化等需求，存在自動取樣困難、防污染問題突出等不足，但是目前研究者們對應用到 BALSS 中的在線微量檢測方法做出了積極的嘗試，以期實時監測細胞狀態，改善 BALSS 的治療效果。因此，在今后的研究中還需要進一步拓展思路，深入肝細胞檢測的實時、在線、微量化方面的研究，解決自動取樣困難和控制系統復雜、小型化等難點；選擇的檢測方法也必須適應在線系統快速檢測的要求，同時需要綜合考慮多種指標檢測方法的兼容性。在減少檢測樣品損耗方面，需要進一步選擇混合芯片并需考慮如何將這些檢測系統集成至 BALSS 中。此外，檢測指標的選取應該更加多樣化，除了傳統的生化指標，還應聯合其他物理量，多方位地展示反應器中細胞的狀態，以幫助操作者更好地進行調控。隨著 BALSS 研究的日益推進，作為 BALSS 研究中不可或缺的一部分，細胞狀態檢測的研究意義重大并且有待進一步深入和完善。
