本文主要研究 β 連環蛋白（β-catenin）和含 IQ 基序的 GTP 激酶活化蛋白 1（IQGAP1）的相互調控，及其在腸癌細胞增殖中的功能。利用細胞轉染技術改變腸癌細胞 SW1116 中的 β-catenin 或者 IQGAP1 表達后，通過蛋白質印跡法分別檢測 SW1116 細胞中 IQGAP1 和 β-catenin 的表達情況。利用 CCK-8 細胞增殖實驗檢測干擾下調 IQGAP1 對 β-catenin 促進 SW1116 細胞增殖的影響。結果發現在 SW1116 細胞中干擾 β-catenin 可以下調 IQGAP1 表達，過表達 β-catenin 可以上調 IQGAP1 并加強有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）通路；干擾 IQGAP1 在 SW1116 細胞中反而引起 β-catenin 上升；同時 CCK-8 細胞增殖實驗發現干擾 IQGAP1 減弱了 β-catenin 的促腸癌細胞增殖作用。本研究表明 β-catenin 與 IQGAP1 形成負向反饋調控環路，在調控腸癌細胞的增殖中發揮著重要功能。
引用本文： 徐煥基, 夏洪偉, 唐秋琳, 畢鋒. β-catenin 和 IQGAP1 的調控環路及其在腸癌細胞增殖中的作用. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(1): 81-86. doi: 10.7507/1001-5515.201701041 復制
引言
腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率在我國呈逐年上升趨勢[1]。研究發現，腸癌中 Wnt/β-catenin 通路和有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路通常都異常活化，其下游調控的靶基因可促進細胞異常的增殖和分化，在腸癌發生發展中發揮著重要作用[2-3]。含 IQ 基序的 GTP 激酶活化蛋白 1（IQ motif containing GTPase-activating protein 1，IQGAP1）是一種支架蛋白，擁有多個蛋白結合域，可以作為蛋白信號傳遞的平臺，協調細胞黏附和遷移信號、MAPK 通路和 G 蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCR）等多種信號通路[4-5]。既往研究發現，IQGAP1 在 MAPK 通路中發揮著重要功能，可以通過多種機制強化信號強度并延長通路激活時間，發揮著橋梁作用。IQGAP1 作為細胞骨架蛋白，可以分別與 Raf 蛋白激酶、絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）和細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）等 MAPK 通路中關鍵蛋白相互作用，促進 Raf 對 MEK 的磷酸化及 MEK 對 ERK 的磷酸化，從而上調 MAPK 通路活性[6]。此外，IQGAP1 還可以調節 MAPK 通路上游的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的激活，既往研究發現，在敲除 IQGAP1 的細胞中 EGFR 的功能受到明顯抑制[7]。動物實驗也發現 IQGAP1 在 MAPK 信號通路驅動的腸癌中發揮著關鍵功能，在 KRAS 突變誘導的小鼠腸癌模型中敲除 IQGAP1 后，腫瘤的增殖速度明顯減慢[8]。目前，關于 IQGAP1 和 β-catenin 相互間調控和功能影響的報道還很少，β-catenin 是否對 IQGAP1 具有調控作用目前未見報道，并且 IQGAP1 在腸癌細胞中對 β-catenin 的調控作用也不十分清楚。本文將研究 β-catenin 和 IQGAP1 在腸癌細胞中如何相互調控，及其在腸癌細胞增殖中的作用。
1 材料與方法
1.1 細胞培養與傳代
人腸癌細胞 SW1116 用含 10% 胎牛血清（Gibco，美國）的 DMEM 培養基（Gibco，美國）在 37℃ 的孵箱中培養。生長融合至 70%～80% 時進行傳代，棄去舊培養液，加適量磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗 2～3 次；加入 0.75 mL 0.25% 的胰酶，37℃ 消化適當時間，待細胞消化完全后加入培養液 3 mL 終止消化反應，重懸細胞；室溫，800 r/min，離心 5 min，棄上清；細胞用適量新鮮培養基重懸，根據其數量、生長速度及用量多少，按一定比例進行傳代。
1.2 細胞轉染干擾 RNA 或者質粒
轉染前一天將 SW1116 細胞種植于六孔板中，待細胞生長到一定密度（50%～60%）時，用 Lipofectamine TM2000（Thermo Fisher，美國）將干擾 RNA 或者過表達質粒轉染到細胞中。將干擾 RNA 或者過表達質粒和 5 μL Lipofectamine TM2000，分別用 opti-MEM（Gibco，美國）補齊到 250 μL，室溫孵育 5 min 后，再將二者混勻，注意動作輕柔，室溫繼續孵育 20 min。棄舊培養液，用 opti-MEM 清洗一次，將孵育好的混合液加到 6 孔板中，置于 37℃ 孵箱中，4～6 h 后換 10% FBS 的 DMEM 繼續培養。所用干擾 RNA 序列：
β-catenin：5′-AGCTGATATTGATGGACAGTT-3′
IQGAP1：5′-UUAUCGCCCAGAAACAUCUUGUUGG-3′
陰性對照干擾 RNA（negative control，NC）：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′
陰性對照干擾 RNA 為無意義的 RNA 序列，不靶定任何基因 mRNA，作為 IQGAP1 和 β-catenin 干擾 RNA 轉染的陰性對照。過表達 β-catenin 質粒（pcDNA3.1-β-catenin）和空載質粒（pcDNA3.1）為實驗室以前構建。空載質粒 pcDNA3.1 是 β-catenin 質粒的基本骨架，作為 β-catenin 質粒轉染的陰性對照。
1.3 蛋白質免疫印跡法檢測處理后 IQGAP1、β-catenin 和 pERK1/2 的表達
細胞按實驗要求對應處理一定時間后，棄去舊培養基，加 PBS 洗滌。每孔（6 孔板）加入 80 μL 通用蛋白裂解抽提試劑（碧云天，中國），收集細胞于 1.5 mL EP 管置于冰上，充分裂解細胞后，4℃、12 000 r/min 離心 15 min，吸取上清即為細胞總蛋白。用蛋白定量試劑盒（碧云天，中國）按照說明進行蛋白濃度測定后，配制 12% 的分離膠、5% 的濃縮膠進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，待目的蛋白已經被適當分離后即可停止電泳進行轉膜；用聚偏二氟乙烯膜（Millipore，美國）進行轉膜；5% 的脫脂奶粉封閉 2 h；加入一抗 4℃ 過夜，用含 Tween-20 的 Tris-HCl 緩沖鹽溶液（TBST）洗膜 3 次，每次 10 min；按 1∶10 000 的比例加入羊抗兔或羊抗鼠二抗，室溫動孵育 2 h，避光；加入適量 TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。最后將聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）直接置于奧德賽紅外熒光掃描儀中進行掃描成像。實驗中所用一抗為 β-catenin（sc-65480，Santa Cruz，美國）、IQGAP1（ab133490，Abcam，英國）、pERK1/2（ab76299，Abcam，英國）、ERK1（ab32537，Abcam，英國）、C-Myc（ab32072，Abcam，英國）、GAPDH（BM1623，博士德，中國）。所用二抗為羊抗兔和羊抗鼠熒光二抗（Licor，美國）。
1.4 CCK-8 細胞增殖實驗檢測細胞處理后的增殖速度
實驗按 CCK-8 試劑盒說明進行，具體步驟如下：細胞種板、轉染見前一步驟；各實驗組均設有 3 個復孔，3 個對照；每孔加入 90 μL 新鮮培養液并加入 10 μL CCK-8，輕微振蕩，混勻，在 37℃ 孵箱內培養 2 h，根據說明于酶標儀上測得光密度值（OD 值）。CCK-8 實驗中共分四組，對照組（Control 組，轉染了陰性對照干擾 RNA 和空載質粒），β-catenin 組（轉染 β-catenin 質粒和陰性對照干擾 RNA），si-IQGAP1 組（轉染 IQGAP1 干擾 RNA 和空載質粒）和共轉染組（轉染 IQGAP1 干擾 RNA 和 β-catenin 質粒）。OD 值越大細胞增殖速度越快，統計分析時，將 β-catenin 組的 OD 值標定為 100%，根據其他各組與 β-catenin 組的 OD 值比值，算出各組的相對 OD 值，縱坐標標為相對增殖速度。以上實驗重復 3 次。
1.5 統計分析
用圖像分析軟件 Image-Pro 5.1 對蛋白條帶進行灰度分析。所有結果以均數±標準差表示。用 SPSS 19.0 統計軟件進行統計學分析，兩組間比較采用 t 檢驗分析，P < 0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 β-catenin 正調控腸癌細胞 IQGAP1 的表達
使用 β-catenin 質粒（pcDNA3.1-β-catenin）轉染腸癌 SW1116 細胞 72 h 后提取蛋白，利用蛋白質印跡法檢測細胞 β-catenin 和 IQGAP1 的表達，結果如圖 1 所示。相對于對照組（pcDNA3.1 組），轉染組（β-catenin 組）的 β-catenin 蛋白表達量明顯上升（P < 0.05），同時 IQGAP1 的蛋白表達量也出現上升（ P < 0.05）。利用 β-catenin 干擾 RNA 轉染 SW1116 細胞系 72 h 后，結果如 圖 1 所示，相對于對照組（NC 組），干擾組（si-β-catenin 組）的 β-catenin 和 IQGAP1 蛋白表達均出現明顯下降（P < 0.05）。這些結果說明在腸癌細胞 SW1116 中，β-catenin 可以正調控 IQGAP1 的蛋白表達。
圖1
β-catenin 正調控 SW1116 腸癌細胞系 IQGAP1 的表達
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2.2 β-catenin 通過上調 IQGAP1 表達加強 MAPK 信號通路
IQGAP1 可以調節 ERK1/2 的磷酸化，如圖 2 所示，利用 IQGAP1 干擾 RNA 轉染 SW1116 細胞系 72 h 后，相對于對照組（NC 組），干擾組（si-IQGAP1 組）中 ERK1/2 的磷酸化水平出現明顯下降（P < 0.05）。那么 β-catenin 能否通過 IQGAP1 調節 MAPK 信號通路呢？將細胞分為四組：對照組（Control 組，轉染陰性對照 NC 干擾 RNA 和空載質粒 pcDNA3.1），β-catenin 組（轉染 β-catenin 質粒和陰性對照 NC 干擾 RNA），si-IQGAP1 組（轉染 IQGAP1 干擾 RNA 和空載質粒 pcDNA3.1）和共轉染組（轉染 IQGAP1 干擾 RNA 和 β-catenin 質粒）。如 圖 2 所示，β-catenin 組相對于對照組（Control 組），磷酸化 ERK1/2 明顯上升（P < 0.05）。但共轉染組（β-catenin 質粒+si-IQGAP1）相對于 si-IQGAP1 組（si-IQGAP1+pcDNA3.1），磷酸化 ERK1/2 的變化并不明顯，差異無統計學意義。表明在干擾 IQGAP1 表達的情況下，過表達 β-catenin 并不能上調 pERK1/2。這些結果說明 β-catenin 是通過上調 IQGAP1 的表達促進 ERK1/2 的磷酸化，從而加強 MAPK 通路。
圖2
β-catenin 通過上調 IQGAP1 表達加強 MAPK 信號通路
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2.3 干擾 IQGAP1 減弱 β-catenin 的促腸癌細胞增殖作用
通過 CCK-8 細胞增殖實驗檢測發現，如圖 3 示，干擾 IQGAP1（si-IQGAP1 組）后，相對于對照組（Control 組），SW1116 細胞增殖速度顯著下降（P < 0.05），證明 IQGAP1 可以調節 SW1116 細胞的增殖。β-catenin 的異常活化可以促進腸癌細胞的增殖，那么 IQGAP1 在 β-catenin 促進腸癌細胞增殖中發揮著什么功能呢？如 圖 3 所示，過表達 β-catenin（β-catenin 組）后，相對于對照組（Control 組），SW1116 細胞增殖速度明顯增加（P < 0.05）。但過表達 β-catenin 的同時干擾 IQGAP1（共轉染組）后，相對于 β-catenin 組，SW1116 細胞的增殖速度明顯下降（ P < 0.05），證明干擾 IQGAP1 減弱了 β-catenin 促腸癌細胞增殖的作用。但共轉組相對于對照組，SW1116 細胞的增殖速度仍然有輕度地上升（ P < 0.05），說明 β-catenin 還存在其他機制促進腸癌細胞增殖。
圖3
干擾 IQGAP1 減弱 β-catenin 的促腸癌細胞增殖作用
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2.4 干擾 IQGAP1 促進 SW1116 腸癌細胞 β-catenin 表達上調
利用 IQGAP1 干擾 RNA 轉染 SW1116 細胞 72 h 后提取蛋白，利用蛋白質印跡法檢測細胞 β-catenin 和其下游 C-Myc 的表達。結果如圖 4 所示，相對于對照組（NC 組），IQGAP1 干擾組（si-IQGAP1）的 β-catenin 和其下游 C-Myc 的蛋白表達均出現上升（P < 0.05），說明 IQGAP1 的下調可以促進 SW1116 腸癌細胞 β-catenin 表達上調。
圖4
干擾 IQGAP1 促進 SW1116 腸癌細胞 β-catenin 表達上調
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3 討論
經典 Wnt 信號通路的關鍵分子是 β-catenin，通過調節下游靶基因的表達控制著細胞多種生物學進程[9-10]。當 Wnt 信號存在時，Wnt 蛋白與細胞膜上的卷曲蛋白（frizzled）受體和低密度脂蛋白受體相關蛋白 5 或 6（LDL receptor related protein 5/6，LRP5/6）發生結合形成受體復合體，激活的 LRP5/6 的羧基端與 Axin 結合，破壞了 β-catenin 降解復合體 APC/Axin/GSK3β 的形成，使 GSK-3β 無法磷酸化 β-catenin，進而激活 β-catenin 信號通路[11-12]。約有 90% 的腸癌在腺瘤早期就存在 APC 的突變，導致 β-catenin 的異常激活，促進腸癌發生[13]。
IQGAP1 是一種支架蛋白，通過調節 MAPK 信號通路可以影響細胞增殖和分化[6]，也能與細胞骨架和黏附分子相互作用，在細胞黏附和遷移的信號網絡中發揮關鍵作用[14]。IQGAP1 位于染色體 15q26 上，是基因擴增熱點，其所在位點基因變異和表達增加已在多種腫瘤組織和不同腫瘤細胞株中被觀察到[15-16]。異常激活的 MAPK 信號通路是腸癌分子分型中的一大類，約有 40% 的腸癌存在 KRAS 突變，5%～8% 的腸癌存在 NRAS 突變，10% 左右的腸癌存在 BRAF 突變[13]。而 MAPK 信號通路的順利傳遞明顯依賴 IQGAP1[6, 17-19]，在 KRAS-MAPK 通路驅動的腫瘤中敲除 IQGAP1 可以顯著抑制腫瘤的進展[8]，說明 IQGAP1 的表達增加對 MAPK 通路的重要性。
腸癌的發生發展通常伴隨著一系列的信號通路的異常活化，通路間的調控網絡共同促進了腸癌的進展[20]。Wnt/β-catenin 和 MAPK 通路的相互交聯已有報道[21]。研究發現 β-catenin 在肝癌和前列腺癌中可以直接上調 EGFR 的表達，進而促進 RAS/ERK 通路活化[22-23]。而 ERK1/2 也可以使 GSK3β 失活，導致 β-catenin 的活化[24]。
本文首次發現 β-catenin 可以在腸癌細胞中調節 IQGAP1 的蛋白表達。其次，本文證明了 β-catenin 可以通過上調 IQGAP1 的表達加強 MAPK 通路，進而促進腸癌細胞的增殖。IQGAP1 還在細胞的黏附和遷移以及 G 蛋白偶聯受體信號通路中發揮著重要功能，β-catenin 能否通過 IQGAP1 發揮更多的功能值得進一步的研究。最后本文發現干擾 IQGAP1 后在腸癌中反而可以上調 β-catenin 的表達。既往研究發現在肝癌中 IQGAP1 可以促進 β-catenin 的表達[25]，說明 IQGAP1 的功能具有組織特異性，至于干擾 IQGAP1 如何上調 β-catenin 的機制還不清楚，需要更多的研究。
β-catenin 的異常活化通常是啟動腸癌發生的第一環節[26]，對 β-catenin 是如何促進腫瘤發生發展的研究不斷在深入。本文首次發現 β-catenin 可以調控 IQGAP1，擴展了 β-catenin 的功能，更新了 Wnt/β-catenin 和 MAPK 通路的交聯網絡，加深了對 β-catenin 這一關鍵癌基因在腸癌細胞中如何發揮促增殖功能的理解。更有趣的是，在腸癌細胞 SW1116 中干擾 IQGAP1 后 β-catenin 反而出現上升，提示了腸癌細胞維持 β-catenin 水平穩定的可能機制，即 β-catenin 的下調會引起 IQGAP1 降低，而 IQGAP1 的降低又會反饋地上調 β-catenin，阻止 β-catenin 的持續降低。這種 β-catenin 和 IQGAP1 的負向反饋環路也提示了一種新的 β-catenin 靶向治療的耐藥機制，即在靶向抑制 β-catenin 功能后引起的 IQGAP1 下調，極有可能又會相對地重新上調 β-catenin 表達。綜上所述，本文發現 IQGAP1 與 β-catenin 構成負向反饋環路，對解析腫瘤細胞如何維持相對高強度的 Wnt/β-catenin 和 MAPK 信號的機制提供了新的思路。
引言
腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率在我國呈逐年上升趨勢[1]。研究發現，腸癌中 Wnt/β-catenin 通路和有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路通常都異常活化，其下游調控的靶基因可促進細胞異常的增殖和分化，在腸癌發生發展中發揮著重要作用[2-3]。含 IQ 基序的 GTP 激酶活化蛋白 1（IQ motif containing GTPase-activating protein 1，IQGAP1）是一種支架蛋白，擁有多個蛋白結合域，可以作為蛋白信號傳遞的平臺，協調細胞黏附和遷移信號、MAPK 通路和 G 蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCR）等多種信號通路[4-5]。既往研究發現，IQGAP1 在 MAPK 通路中發揮著重要功能，可以通過多種機制強化信號強度并延長通路激活時間，發揮著橋梁作用。IQGAP1 作為細胞骨架蛋白，可以分別與 Raf 蛋白激酶、絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）和細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）等 MAPK 通路中關鍵蛋白相互作用，促進 Raf 對 MEK 的磷酸化及 MEK 對 ERK 的磷酸化，從而上調 MAPK 通路活性[6]。此外，IQGAP1 還可以調節 MAPK 通路上游的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的激活，既往研究發現，在敲除 IQGAP1 的細胞中 EGFR 的功能受到明顯抑制[7]。動物實驗也發現 IQGAP1 在 MAPK 信號通路驅動的腸癌中發揮著關鍵功能，在 KRAS 突變誘導的小鼠腸癌模型中敲除 IQGAP1 后，腫瘤的增殖速度明顯減慢[8]。目前，關于 IQGAP1 和 β-catenin 相互間調控和功能影響的報道還很少，β-catenin 是否對 IQGAP1 具有調控作用目前未見報道，并且 IQGAP1 在腸癌細胞中對 β-catenin 的調控作用也不十分清楚。本文將研究 β-catenin 和 IQGAP1 在腸癌細胞中如何相互調控，及其在腸癌細胞增殖中的作用。
1 材料與方法
1.1 細胞培養與傳代
人腸癌細胞 SW1116 用含 10% 胎牛血清（Gibco，美國）的 DMEM 培養基（Gibco，美國）在 37℃ 的孵箱中培養。生長融合至 70%～80% 時進行傳代，棄去舊培養液，加適量磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗 2～3 次；加入 0.75 mL 0.25% 的胰酶，37℃ 消化適當時間，待細胞消化完全后加入培養液 3 mL 終止消化反應，重懸細胞；室溫，800 r/min，離心 5 min，棄上清；細胞用適量新鮮培養基重懸，根據其數量、生長速度及用量多少，按一定比例進行傳代。
1.2 細胞轉染干擾 RNA 或者質粒
轉染前一天將 SW1116 細胞種植于六孔板中，待細胞生長到一定密度（50%～60%）時，用 Lipofectamine TM2000（Thermo Fisher，美國）將干擾 RNA 或者過表達質粒轉染到細胞中。將干擾 RNA 或者過表達質粒和 5 μL Lipofectamine TM2000，分別用 opti-MEM（Gibco，美國）補齊到 250 μL，室溫孵育 5 min 后，再將二者混勻，注意動作輕柔，室溫繼續孵育 20 min。棄舊培養液，用 opti-MEM 清洗一次，將孵育好的混合液加到 6 孔板中，置于 37℃ 孵箱中，4～6 h 后換 10% FBS 的 DMEM 繼續培養。所用干擾 RNA 序列：
β-catenin：5′-AGCTGATATTGATGGACAGTT-3′
IQGAP1：5′-UUAUCGCCCAGAAACAUCUUGUUGG-3′
陰性對照干擾 RNA（negative control，NC）：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′
陰性對照干擾 RNA 為無意義的 RNA 序列，不靶定任何基因 mRNA，作為 IQGAP1 和 β-catenin 干擾 RNA 轉染的陰性對照。過表達 β-catenin 質粒（pcDNA3.1-β-catenin）和空載質粒（pcDNA3.1）為實驗室以前構建。空載質粒 pcDNA3.1 是 β-catenin 質粒的基本骨架，作為 β-catenin 質粒轉染的陰性對照。
1.3 蛋白質免疫印跡法檢測處理后 IQGAP1、β-catenin 和 pERK1/2 的表達
細胞按實驗要求對應處理一定時間后，棄去舊培養基，加 PBS 洗滌。每孔（6 孔板）加入 80 μL 通用蛋白裂解抽提試劑（碧云天，中國），收集細胞于 1.5 mL EP 管置于冰上，充分裂解細胞后，4℃、12 000 r/min 離心 15 min，吸取上清即為細胞總蛋白。用蛋白定量試劑盒（碧云天，中國）按照說明進行蛋白濃度測定后，配制 12% 的分離膠、5% 的濃縮膠進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，待目的蛋白已經被適當分離后即可停止電泳進行轉膜；用聚偏二氟乙烯膜（Millipore，美國）進行轉膜；5% 的脫脂奶粉封閉 2 h；加入一抗 4℃ 過夜，用含 Tween-20 的 Tris-HCl 緩沖鹽溶液（TBST）洗膜 3 次，每次 10 min；按 1∶10 000 的比例加入羊抗兔或羊抗鼠二抗，室溫動孵育 2 h，避光；加入適量 TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。最后將聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）直接置于奧德賽紅外熒光掃描儀中進行掃描成像。實驗中所用一抗為 β-catenin（sc-65480，Santa Cruz，美國）、IQGAP1（ab133490，Abcam，英國）、pERK1/2（ab76299，Abcam，英國）、ERK1（ab32537，Abcam，英國）、C-Myc（ab32072，Abcam，英國）、GAPDH（BM1623，博士德，中國）。所用二抗為羊抗兔和羊抗鼠熒光二抗（Licor，美國）。
1.4 CCK-8 細胞增殖實驗檢測細胞處理后的增殖速度
實驗按 CCK-8 試劑盒說明進行，具體步驟如下：細胞種板、轉染見前一步驟；各實驗組均設有 3 個復孔，3 個對照；每孔加入 90 μL 新鮮培養液并加入 10 μL CCK-8，輕微振蕩，混勻，在 37℃ 孵箱內培養 2 h，根據說明于酶標儀上測得光密度值（OD 值）。CCK-8 實驗中共分四組，對照組（Control 組，轉染了陰性對照干擾 RNA 和空載質粒），β-catenin 組（轉染 β-catenin 質粒和陰性對照干擾 RNA），si-IQGAP1 組（轉染 IQGAP1 干擾 RNA 和空載質粒）和共轉染組（轉染 IQGAP1 干擾 RNA 和 β-catenin 質粒）。OD 值越大細胞增殖速度越快，統計分析時，將 β-catenin 組的 OD 值標定為 100%，根據其他各組與 β-catenin 組的 OD 值比值，算出各組的相對 OD 值，縱坐標標為相對增殖速度。以上實驗重復 3 次。
1.5 統計分析
用圖像分析軟件 Image-Pro 5.1 對蛋白條帶進行灰度分析。所有結果以均數±標準差表示。用 SPSS 19.0 統計軟件進行統計學分析，兩組間比較采用 t 檢驗分析，P < 0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 β-catenin 正調控腸癌細胞 IQGAP1 的表達
使用 β-catenin 質粒（pcDNA3.1-β-catenin）轉染腸癌 SW1116 細胞 72 h 后提取蛋白，利用蛋白質印跡法檢測細胞 β-catenin 和 IQGAP1 的表達，結果如圖 1 所示。相對于對照組（pcDNA3.1 組），轉染組（β-catenin 組）的 β-catenin 蛋白表達量明顯上升（P < 0.05），同時 IQGAP1 的蛋白表達量也出現上升（ P < 0.05）。利用 β-catenin 干擾 RNA 轉染 SW1116 細胞系 72 h 后，結果如 圖 1 所示，相對于對照組（NC 組），干擾組（si-β-catenin 組）的 β-catenin 和 IQGAP1 蛋白表達均出現明顯下降（P < 0.05）。這些結果說明在腸癌細胞 SW1116 中，β-catenin 可以正調控 IQGAP1 的蛋白表達。
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β-catenin 正調控 SW1116 腸癌細胞系 IQGAP1 的表達
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2.2 β-catenin 通過上調 IQGAP1 表達加強 MAPK 信號通路
IQGAP1 可以調節 ERK1/2 的磷酸化，如圖 2 所示，利用 IQGAP1 干擾 RNA 轉染 SW1116 細胞系 72 h 后，相對于對照組（NC 組），干擾組（si-IQGAP1 組）中 ERK1/2 的磷酸化水平出現明顯下降（P < 0.05）。那么 β-catenin 能否通過 IQGAP1 調節 MAPK 信號通路呢？將細胞分為四組：對照組（Control 組，轉染陰性對照 NC 干擾 RNA 和空載質粒 pcDNA3.1），β-catenin 組（轉染 β-catenin 質粒和陰性對照 NC 干擾 RNA），si-IQGAP1 組（轉染 IQGAP1 干擾 RNA 和空載質粒 pcDNA3.1）和共轉染組（轉染 IQGAP1 干擾 RNA 和 β-catenin 質粒）。如 圖 2 所示，β-catenin 組相對于對照組（Control 組），磷酸化 ERK1/2 明顯上升（P < 0.05）。但共轉染組（β-catenin 質粒+si-IQGAP1）相對于 si-IQGAP1 組（si-IQGAP1+pcDNA3.1），磷酸化 ERK1/2 的變化并不明顯，差異無統計學意義。表明在干擾 IQGAP1 表達的情況下，過表達 β-catenin 并不能上調 pERK1/2。這些結果說明 β-catenin 是通過上調 IQGAP1 的表達促進 ERK1/2 的磷酸化，從而加強 MAPK 通路。
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β-catenin 通過上調 IQGAP1 表達加強 MAPK 信號通路
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2.3 干擾 IQGAP1 減弱 β-catenin 的促腸癌細胞增殖作用
通過 CCK-8 細胞增殖實驗檢測發現，如圖 3 示，干擾 IQGAP1（si-IQGAP1 組）后，相對于對照組（Control 組），SW1116 細胞增殖速度顯著下降（P < 0.05），證明 IQGAP1 可以調節 SW1116 細胞的增殖。β-catenin 的異常活化可以促進腸癌細胞的增殖，那么 IQGAP1 在 β-catenin 促進腸癌細胞增殖中發揮著什么功能呢？如 圖 3 所示，過表達 β-catenin（β-catenin 組）后，相對于對照組（Control 組），SW1116 細胞增殖速度明顯增加（P < 0.05）。但過表達 β-catenin 的同時干擾 IQGAP1（共轉染組）后，相對于 β-catenin 組，SW1116 細胞的增殖速度明顯下降（ P < 0.05），證明干擾 IQGAP1 減弱了 β-catenin 促腸癌細胞增殖的作用。但共轉組相對于對照組，SW1116 細胞的增殖速度仍然有輕度地上升（ P < 0.05），說明 β-catenin 還存在其他機制促進腸癌細胞增殖。
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干擾 IQGAP1 減弱 β-catenin 的促腸癌細胞增殖作用
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2.4 干擾 IQGAP1 促進 SW1116 腸癌細胞 β-catenin 表達上調
利用 IQGAP1 干擾 RNA 轉染 SW1116 細胞 72 h 后提取蛋白，利用蛋白質印跡法檢測細胞 β-catenin 和其下游 C-Myc 的表達。結果如圖 4 所示，相對于對照組（NC 組），IQGAP1 干擾組（si-IQGAP1）的 β-catenin 和其下游 C-Myc 的蛋白表達均出現上升（P < 0.05），說明 IQGAP1 的下調可以促進 SW1116 腸癌細胞 β-catenin 表達上調。
圖4
干擾 IQGAP1 促進 SW1116 腸癌細胞 β-catenin 表達上調
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3 討論
經典 Wnt 信號通路的關鍵分子是 β-catenin，通過調節下游靶基因的表達控制著細胞多種生物學進程[9-10]。當 Wnt 信號存在時，Wnt 蛋白與細胞膜上的卷曲蛋白（frizzled）受體和低密度脂蛋白受體相關蛋白 5 或 6（LDL receptor related protein 5/6，LRP5/6）發生結合形成受體復合體，激活的 LRP5/6 的羧基端與 Axin 結合，破壞了 β-catenin 降解復合體 APC/Axin/GSK3β 的形成，使 GSK-3β 無法磷酸化 β-catenin，進而激活 β-catenin 信號通路[11-12]。約有 90% 的腸癌在腺瘤早期就存在 APC 的突變，導致 β-catenin 的異常激活，促進腸癌發生[13]。
IQGAP1 是一種支架蛋白，通過調節 MAPK 信號通路可以影響細胞增殖和分化[6]，也能與細胞骨架和黏附分子相互作用，在細胞黏附和遷移的信號網絡中發揮關鍵作用[14]。IQGAP1 位于染色體 15q26 上，是基因擴增熱點，其所在位點基因變異和表達增加已在多種腫瘤組織和不同腫瘤細胞株中被觀察到[15-16]。異常激活的 MAPK 信號通路是腸癌分子分型中的一大類，約有 40% 的腸癌存在 KRAS 突變，5%～8% 的腸癌存在 NRAS 突變，10% 左右的腸癌存在 BRAF 突變[13]。而 MAPK 信號通路的順利傳遞明顯依賴 IQGAP1[6, 17-19]，在 KRAS-MAPK 通路驅動的腫瘤中敲除 IQGAP1 可以顯著抑制腫瘤的進展[8]，說明 IQGAP1 的表達增加對 MAPK 通路的重要性。
腸癌的發生發展通常伴隨著一系列的信號通路的異常活化，通路間的調控網絡共同促進了腸癌的進展[20]。Wnt/β-catenin 和 MAPK 通路的相互交聯已有報道[21]。研究發現 β-catenin 在肝癌和前列腺癌中可以直接上調 EGFR 的表達，進而促進 RAS/ERK 通路活化[22-23]。而 ERK1/2 也可以使 GSK3β 失活，導致 β-catenin 的活化[24]。
本文首次發現 β-catenin 可以在腸癌細胞中調節 IQGAP1 的蛋白表達。其次，本文證明了 β-catenin 可以通過上調 IQGAP1 的表達加強 MAPK 通路，進而促進腸癌細胞的增殖。IQGAP1 還在細胞的黏附和遷移以及 G 蛋白偶聯受體信號通路中發揮著重要功能，β-catenin 能否通過 IQGAP1 發揮更多的功能值得進一步的研究。最后本文發現干擾 IQGAP1 后在腸癌中反而可以上調 β-catenin 的表達。既往研究發現在肝癌中 IQGAP1 可以促進 β-catenin 的表達[25]，說明 IQGAP1 的功能具有組織特異性，至于干擾 IQGAP1 如何上調 β-catenin 的機制還不清楚，需要更多的研究。
β-catenin 的異常活化通常是啟動腸癌發生的第一環節[26]，對 β-catenin 是如何促進腫瘤發生發展的研究不斷在深入。本文首次發現 β-catenin 可以調控 IQGAP1，擴展了 β-catenin 的功能，更新了 Wnt/β-catenin 和 MAPK 通路的交聯網絡，加深了對 β-catenin 這一關鍵癌基因在腸癌細胞中如何發揮促增殖功能的理解。更有趣的是，在腸癌細胞 SW1116 中干擾 IQGAP1 后 β-catenin 反而出現上升，提示了腸癌細胞維持 β-catenin 水平穩定的可能機制，即 β-catenin 的下調會引起 IQGAP1 降低，而 IQGAP1 的降低又會反饋地上調 β-catenin，阻止 β-catenin 的持續降低。這種 β-catenin 和 IQGAP1 的負向反饋環路也提示了一種新的 β-catenin 靶向治療的耐藥機制，即在靶向抑制 β-catenin 功能后引起的 IQGAP1 下調，極有可能又會相對地重新上調 β-catenin 表達。綜上所述，本文發現 IQGAP1 與 β-catenin 構成負向反饋環路，對解析腫瘤細胞如何維持相對高強度的 Wnt/β-catenin 和 MAPK 信號的機制提供了新的思路。
