骨重建是以骨形成和骨吸收為特征的重要生理過程，人們早已發現骨組織受到力學載荷作用后，會通過骨重建過程優化其結構以適應變化的載荷環境。目前已有大量研究證實，載荷作用下骨內孔隙結構中的液體會發生流動，所產生的流體剪切力是使骨組織細胞產生生物學響應的主要因素。本文綜述了近年來骨內液體流動方面的相關研究進展和成果，主要包括流體刺激下骨組織細胞的生物學響應，骨孔隙中的壓力及其對液體流動的影響，以及骨內液體流動的實驗、理論及數值模擬研究，并對骨內液體流動研究未來的發展趨勢加以分析和展望。
引用本文： 陳澤彬, 霍波. 骨內液體流動生物力學的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(2): 308-313. doi: 10.7507/1001-5515.201611024 復制
引言
生命體的骨骼系統發育完成后，仍會持續進行舊骨吸收及新骨生成以維持正常的骨礦含量，這一過程通常稱為骨重建。自從 19 世紀 90 年代德國骨科醫生 Julius Wolff（1836–1902）提出所謂“Wolff 定律”以來[1]，已有大量研究表明：當骨組織受到力學載荷作用時，會啟動骨重建過程，從而使骨骼結構發生優化調整，以適應變化的載荷環境。通常而言，適當的運動和力學刺激會促進骨內礦物含量的增加，反之當力學刺激缺失時會引起骨丟失。例如，執行長期空間飛行任務的宇航員骨丟失情況非常嚴重，股骨部位骨礦含量每月下降 0.4%～1.8%。但這種空間微重力環境下骨丟失的原因仍不清楚，也尚無有效的預防和治療措施[2]。
骨骼一般由密質骨、松質骨和骨髓液組成，例如股骨外部由結構緊密、低孔隙率的密質骨包裹，內部則是桿狀和板狀骨小梁交織形成三維網狀結構的松質骨（圖 1a、b）。密質骨主要由骨單位組成，骨單位的管狀中心區域稱為哈弗氏管，管周圍的多層骨基質內含有成骨細胞和骨細胞。與哈弗氏管垂直排列的福克曼氏管將骨單位連接在一起，血管經由哈弗氏管-福克曼氏管系統將營養輸運到密質骨內側，并將代謝產物運走。在骨單位中還有尺度更小的孔隙結構，即骨陷窩-骨小管系統。骨細胞位于骨陷窩中，通過骨小管通道內的突觸與鄰近骨細胞相互連接（圖 1c）。骨細胞突觸及骨小管壁之間的空隙中充滿了間隙液及胞周基質，兩者通過纖維突起直接連接在一起。骨陷窩-骨小管系統在骨細胞間、骨細胞與血管間營養和代謝廢物交換中發揮著關鍵作用，研究者們普遍認為骨陷窩-骨小管系統主導了骨內的力刺激傳導過程。
松質骨是骨重建最活躍的區域，也包含著兩級不同尺度的孔隙結構，即骨小梁結構和骨陷窩-骨小管結構。人松質骨中骨小梁的直徑約為 130 μm，骨小梁平均間距約為 1 000 μm。骨小梁結構的孔隙中充滿了液體，主要為由紅細胞、血小板和白細胞等組成的紅骨髓。成骨細胞和破骨細胞通常貼附于骨小梁表面，前者可以分泌骨基質以促進骨形成，后者溶解骨礦物導致骨吸收。在這些骨小梁中同樣具有更小一級的骨陷窩-骨小管系統[3]，甚至可以形成類似密質骨骨單位的結構。
骨重建主要由成骨細胞主導的骨形成過程及破骨細胞主導的骨吸收過程組成，闡明力學刺激如何傳導到骨組織細胞并調控其生物學功能是骨力學領域要解決的核心問題。當人們活動身體時，來自肌肉的收縮力及重力會使骨組織發生變形，而作用于骨的外力傳遞至細胞通常有兩種方式：骨基質的變形引起附著于其上的的細胞產生相應的應變；另外，外力作用下上述孔隙的體積改變，引起孔隙內液體的流動，進而在細胞表面產生流體剪切力（圖 1）。在上述載荷的作用下，骨組織細胞會直接感受力學刺激而產生生物學響應；另外，骨內生化因子、營養供應、pH 值等生理參數也會在力學刺激下發生動態改變，從而進一步引起骨組織細胞對骨結構的改造[4-5]。本文將主要綜述近年來骨內液體流動方面的相關研究進展和成果，并對未來的發展趨勢加以分析和展望。
圖1
骨組織結構 a.股骨； b.松質骨和密質骨微觀結構； c.骨陷窩-骨小管結構
Figure1.
Structure of bones a. femur; b. the microstructure of compact and cancellous bone; c. lacunar-canalicular stucture
1 流體刺激下骨組織細胞的生物學響應
從 20 世紀 90 年代末開始，人們開始關注骨內孔隙中液體流動對骨內細胞的影響[6]，代表性的工作包括紐約城市學院的 Stephen C. Cowin 和 Sheldon Weinbaum。此后大量研究結果表明，在流體剪切力作用下，骨組織細胞會發生顯著的生物學響應。例如，成骨細胞和骨細胞在施加穩定流或脈動流后，細胞中的一氧化氮水平快速增加[7]，脈動流還可在成骨細胞中引起前列腺素 E2（prostag-landin E2，PGE2）的釋放[8]。由于鈣離子是細胞內最重要的第二信使分子，參與眾多的胞內信號通路，人們也通過實驗研究了流體剪切力對骨組織細胞內鈣響應的影響[9-10]。例如，有人發展了骨組織受載情況下在體成像技術，觀察到了骨內流體剪切力作用下嵌入骨基質內部的骨細胞與骨表面細胞（成骨細胞或破骨細胞）的力致鈣響應，發現骨細胞具有顯著鈣振蕩現象[11]。
在相關研究方法和技術方面，近年來有非常顯著的進展。在體外對骨組織細胞施加流體剪切力的實驗中，通常會采用平板流動腔技術，該方法可以提供穩定流場。由于人體運動時骨所受的載荷是周期性的，也有研究在進行體外細胞實驗時采用振蕩流，以與生理條件更加接近。此外，人們還發展了一些其它的技術在體外模擬骨組織細胞的力學環境[12]。例如，有人將骨組織細胞培養在三維基質中模擬生理流體環境[13-16]。又如，微模式化技術被用于更精確地控制骨組織細胞的幾何形狀、相互之間的距離及連接方式，有研究表明細胞網絡結構可以模擬骨陷窩-骨小管結構，從而可以更定量地研究細胞的信號傳導途徑[17-18]。
實際上，當前骨細胞力學領域的主要研究方向之一是細胞流體力學的體外實驗，即應用流動腔、微流控等技術對骨組織細胞施加流體剪切力刺激并觀察其生物學響應。有理由推測，在體情況下骨內間隙流可以有效地刺激在體骨組織細胞的生物學響應。但是受限于骨內液體流動的真實情況（如壓力、剪切力、液體流動速度等）并未明確，難以提供在體骨內液體流動與骨組織細胞響應甚至骨形成之間相關的直接證據。如何證明體外實驗中施加的液體流動條件能夠真實反映在體骨組織細胞的力學環境，以及如何直接開展在體情況下的細胞力學實驗，仍需進行更加深入的研究。
2 骨內液體的壓力
如前文所述，骨內的兩級孔隙（血管通道與骨陷窩-骨小管系統）尺度差距為 2～3 個數量級，因此推測這兩級孔隙結構內的壓力可能也不同。在較大的血管通道中，有足夠大的空間使液體通過擴散很快地釋放壓力，從而可以在較長時間內維持較低的壓力。血管通道內的液體壓力被認為與骨內毛細血管的壓力相當（40～60 mm Hg），如果長時間保持在高于血壓的壓力水平會使骨組織缺乏氧氣和營養。另一方面，骨陷窩-骨小管系統因其較小的孔隙導致液體壓力較難釋放，從而可能在相對較長的時間內保持在一個較高的壓力水平。在骨陷窩-骨小管孔隙中產生的靜水壓力，其大小是骨組織軸向應力的 12%，比血管通道內壓力高出近 40 倍[2]。
由于骨組織細胞通常位于骨內，難以使用無損的方法在體確定骨內細胞周圍的壓力。最近，有人發展了髓內壓動力學的檢測方法，即將股骨開洞，并探入壓力傳感器以實時檢測髓內壓的動態變化。進而他們使用電極對骨骼肌施加不同頻率的電刺激，評估了肌肉收縮對髓內壓和骨應變的影響[19]。此研究發現，髓內壓與刺激頻率之間呈非線性關系，2 Hz 時髓內壓最大，為 14 mm Hg（1.8 kPa），而對所有頻率骨應變都小于 8 με。在距離刺激位置較遠的部分，未觀察到髓內壓和應變的變化。當 5 月齡大鼠受到幅值為 30 mm Hg（4.0 kPa）、頻率為 2 Hz 的動態髓內壓刺激，其成骨相關基因[如 Runt 相關轉錄因子 2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨橋素等]的表達依賴于加載時間，在加載 14 天后增加，而到 21 天后下降[20]。此項研究結果說明髓內壓的動態變化與大鼠的成骨過程密切相關，由于壓力變化通常會引起骨內液體的流動，也間接顯示了液體流動與骨形成相關。
實際上，骨受到動態力學刺激時，細胞會同時受到壓力和流體剪切力的作用，而體外實驗中也不太容易將這兩種力學刺激分割開來。例如流動腔實驗中，人們通常只控制流體剪切力，但會忽略對于腔室中液體壓力的控制。有一個研究設法將流體剪切力和靜態或周期性水壓分離，以觀測各自對成骨細胞的影響[21]。該研究結果顯示施加流體剪切力的同時施加水壓刺激可以影響嘌呤能受體的信號通路以及肌動蛋白骨架的結構，而流體剪切力可獨自影響 B 細胞核轉錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）的核轉移。
由于孔隙結構不同位置處的壓力梯度是驅動液體流動的主要影響因素，因此有必要基于多孔彈性理論、在體流體力學實驗檢測技術、流固耦合數值模擬方法等進一步深入研究骨內的壓力分布以及動態變化特性，從而準確測量和評估骨組織細胞所受的流體力學微環境參數。
3 骨內液體流動的實驗研究
在 20 世紀 70 年代以前，人們并不認為力學載荷作用下骨內液體會發生明顯的流動。實際上，骨細胞深埋于高度不滲透的骨基質中，其周圍可供液體流動的空間很小，徑向寬度不到 1 μm，同時骨細胞間連接的間距又很長（約 30 μm），甚至某些骨細胞與血管通道的距離可達到 200～300 μm。對于骨組織細胞特別是位于骨陷窩內的骨細胞來說，其生存及功能實現需要充足的營養液供應、自身分泌物的交換以及代謝廢物的排放，而簡單的分子擴散并不能滿足這樣的要求。一個合理的解釋是力學刺激主導了骨陷窩里的液體流動，從而為骨細胞的生存提供了充足營養供應及代謝物排放途徑。
目前骨內液體流動的在體檢測技術主要基于染色劑的示蹤灌注技術，例如利用雙硫藍（disul-phine blue）、普施安紅（procion red）、過氧化物酶等。最近有人利用激光共聚焦顯微鏡結合熒光示蹤技術，研究了不同分子量的熒光染料在骨膜處的滲透性，發現 40 kD 以下的染料都可滲透通過骨膜[22]。有人將異硫氰酸熒光素（fluorescein iso-thiocyanate，FITC）標記的牛血清白蛋白注入大鼠脛骨中，施加動態力學刺激后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光染料在骨陷窩-骨小管系統中的運動，發現力學刺激作用下標記有示蹤粒子的骨細胞個數增加，骨質疏松骨內其增加更為顯著，說明骨質疏松會影響力學刺激下的骨內液體流動[23]。骨內的水主要呈現兩種形態，即在孔隙內自由流動或結合在基質上，有學者利用1H 核磁共振技術測量了骨內兩種形態水的比例，發現 70 歲以上人體骨內結合水少而自由水多，并且高體積比的自由水通常對應較低的骨強度，表明骨髓退化導致自由水體積增加[24]。
2005 年 Wang 等[25] 基于熒光漂白恢復（fluore-scence recovery after photobleaching，FRAP）技術發展了一項新的在體測量方法，從而可以實時獲得骨陷窩-骨小管系統中的滲透率。他們構建了在體骨加載模型，然后使用激光共聚焦顯微鏡對骨膜內的密質骨成像，再使用一束高強激光使某個骨陷窩中的熒光染料淬滅，并實時測量了相鄰骨陷窩或骨小管中液體重新擴散到此骨陷窩的動態過程，最后利用對流擴散方程計算滲透率。如果沒有外載，則這種方法可以得到熒光染料的擴散系數，并確定胞外基質的孔隙尺度。通過這一技術，他們測量了不同的幅度、頻率載荷下，骨內液體流動的擴散增強系數及溶質流速[26]。結果發現隨著加載幅度的增加骨內的液體傳輸及溶質速度也相應增強，但是當加載頻率增加時其液體傳輸在一定程度上減弱了。
由于骨細胞主要位于骨骼內部的骨陷窩中，導致很難觀測在體情況下骨細胞周圍的液體流動。即使前述的 FRAP 技術，也由于激光光束穿透深度有限而不易觀察靠近骨髓腔特別是松質骨區域的液體流動。因此，未來有必要進一步發展新的技術手段，如可伸入骨骼內部的微探頭、高分辨率超聲成像、骨骼透明化處理等，從而可以更加準確地測量骨組織細胞周圍的力學微環境。
4 骨內液體流動的理論和數值模擬研究
受限于在體測量實驗技術的缺乏，理論預測和數值模擬成為研究骨內液體流動的有效方法[27-28]。20 世紀 90 年代之前，骨內液體流動的理論模型都只考慮單一尺度的骨孔隙結構（骨單位或骨陷窩-骨小管結構），沒有考慮不同尺度孔隙結構之間的相互影響。1999 年 Wang 等[29] 提出了一個計算模型，同時考慮了骨單位中的血管和骨陷窩系統中的液體流動，用來解釋 Starkebaum 等在 1979 年實驗觀察到的準靜態和動態加載時具有不同應變電勢的現象，并且證明了骨內的液體流動主要通過血管通道來衰減。Wang 等研究結果的意義在于考慮到骨內兩級孔隙結構的孔隙尺度并不相同，即血管通道比骨陷窩-骨小管系統大 2 到 3 個數量級，并證明了血管通道具有更低的壓力，以及同時考慮兩級孔隙結構對于準確計算動載作用下骨內液體流動的重要性。鑒于測量小尺度孔隙內的滲透率較為困難，最近 Benalla 等[30] 建立了一個新的理論模型并應用該模型對實驗結果進行分析，可以準確地測量得到人密質骨內骨陷窩-骨小管系統的滲透率，其量級為 10–22 m2，且隨載荷頻率的增加而線性遞減。
近些年來越來越多的研究使用真實骨結構代替理想的骨模型，并使用流固耦合數值模擬方法來評價骨內的液體流動[31]。2013 年 Birmingham 等[32] 構建了一個包含骨小梁孔隙結構的理想松質骨模型，使用流固耦合數值模擬方法計算了其中的液體流動、壓力分布和流體剪切力。2015 年 Metzger 等[28] 使用微計算機斷層掃描技術（microcomputed tomography，Micro-CT）掃描豬的股骨，通過三維重建得到其真實的松質骨幾何模型。隨后使用流固耦合數值模擬方法對該模型進行計算，研究了豬股骨部位真實松質骨骨小梁孔隙結構中的流體剪切力、壓力分布和流速，并分析了骨髓的不同粘度系數對骨小梁孔隙液體流動的影響。他們的計算結果發現流體剪切力的峰值為 10 Pa，流體剪切力的峰值出現在狹窄區域的流-固交界面上。最近 Fan 等[33] 利用一段小鼠脛骨的 Micro-CT 圖像構建了三維有限元模型，并采用雙相多孔彈性模型來模擬骨的材料力學性質，數值模擬結果顯示靠近髓腔的骨內孔隙流壓力小于靠近骨膜側。
Verbruggen 等[34] 為了評價骨陷窩-骨小管內液體的流動情況，通過對大鼠脛骨中段切片進行熒光染色，再使用熒光共聚焦顯微鏡掃描，經三維重構得到單個骨陷窩-骨小管的真實幾何模型，然后使用流固耦合方法計算了單個骨陷窩-骨小管結構中的液體流動速度、骨細胞膜表面流體剪切力及細胞應變分布，并分析了骨細胞突觸與骨小管壁連接造成的流體剪切力放大現象。計算得到骨陷窩-骨小管內流體剪切力的峰值約為 12 Pa，主要分布于骨細胞突觸與小管連接處，且細胞膜表面流體剪切力均大于 0.8 Pa，高于細胞培養實驗中可導致骨細胞響應的力學刺激閾值。Vaughan 等[35] 的另一工作通過對單個骨陷窩進行流固耦合數值計算，得到了骨陷窩內部骨細胞的應力、應變、流體剪切力的分布情況，討論了骨細胞的原纖毛及整合素蛋白作為細胞力傳感器的潛在可能性。與多孔介質理論比較，盡管這些數值模擬研究中所使用的邊界條件還需進一步討論，但它們能夠更直觀、更細致地反映骨內孔隙中的液體流動情況。
5 總結與展望
由于骨骼內部存在多級孔隙結構，例如密質骨內的哈弗氏系統和骨陷窩-骨小管系統或松質骨內的骨小梁結構和骨陷窩-骨小管結構等，外部載荷作用會引起骨基質變形，進而導致液體部分存在壓力梯度，最終驅動液體發生流動。而液體流動會顯著地影響骨組織細胞的生物學響應，并調控成骨細胞主導的骨形成和破骨細胞主導的骨吸收過程，這也是目前骨生物力學領域公認的調控力致骨重建的主要機制。由本文綜述的相關研究成果可以看出，近年來人們已經在理論、實驗、數值模擬等不同方面取得了大量重要進展，對骨內液體流動的形式及其生物學作用的刻畫也愈來愈清晰。盡管如此，該領域仍然存在一些重要問題尚未解決。
首先，盡管有許多研究通過理論建模試圖闡明骨內液體流動的機制[25]，但是這些研究通常采用理想化的幾何模型，并且對邊界條件作了一定的簡化，實際上這樣的理論預測結果并不能精準地反映骨內液體流動情況。其次，在利用數值模擬方法來探索外力引起的骨內液體流動時，有的研究通過 Biot 滲流理論等多孔彈性介質模型來計算受外力作用時骨內的液體流速、壓力梯度、流體剪切力等參數[7]，但是此種模型并不能反映真實的骨結構，不能準確獲得骨內具體微觀結構（如骨小梁、骨陷窩-骨小管系統）的局部液體流動信息。另外，有人使用流體動力學模型來數值模擬骨內液體流動，并將骨基質假設為剛體，其實并不能準確反映外力作用下骨組織變形導致的流-固耦合現象。近幾年也有人使用流固耦合數值模擬方法計算了松質骨中骨小梁孔隙內和骨陷窩-骨小管內的流體剪切力[28,32,34-35]，但其所使用的邊界條件的合理性仍需要進一步討論，且這些研究中均未考慮不同尺度的孔隙結構之間的相互影響及其流體刺激的量級是否有差異。最后，作為骨重建最活躍的區域，松質骨越來越受到骨生物力學研究人員的關注，但與密質骨相關研究比較，松質骨內兩級孔隙結構中液體流動的研究仍較少。因此，有必要在考慮流固耦合作用的條件下深入研究松質骨兩級孔隙結構中的液體流動。
闡明骨內液體流動的具體形式及生物學調控機制，將促進人們對力致骨重建過程的深入理解，最終有助于解決長期臥床、廢用及宇航員長期空間飛行等由于缺少力學刺激引起的骨流失甚至骨質疏松癥等健康問題。
引言
生命體的骨骼系統發育完成后，仍會持續進行舊骨吸收及新骨生成以維持正常的骨礦含量，這一過程通常稱為骨重建。自從 19 世紀 90 年代德國骨科醫生 Julius Wolff（1836–1902）提出所謂“Wolff 定律”以來[1]，已有大量研究表明：當骨組織受到力學載荷作用時，會啟動骨重建過程，從而使骨骼結構發生優化調整，以適應變化的載荷環境。通常而言，適當的運動和力學刺激會促進骨內礦物含量的增加，反之當力學刺激缺失時會引起骨丟失。例如，執行長期空間飛行任務的宇航員骨丟失情況非常嚴重，股骨部位骨礦含量每月下降 0.4%～1.8%。但這種空間微重力環境下骨丟失的原因仍不清楚，也尚無有效的預防和治療措施[2]。
骨骼一般由密質骨、松質骨和骨髓液組成，例如股骨外部由結構緊密、低孔隙率的密質骨包裹，內部則是桿狀和板狀骨小梁交織形成三維網狀結構的松質骨（圖 1a、b）。密質骨主要由骨單位組成，骨單位的管狀中心區域稱為哈弗氏管，管周圍的多層骨基質內含有成骨細胞和骨細胞。與哈弗氏管垂直排列的福克曼氏管將骨單位連接在一起，血管經由哈弗氏管-福克曼氏管系統將營養輸運到密質骨內側，并將代謝產物運走。在骨單位中還有尺度更小的孔隙結構，即骨陷窩-骨小管系統。骨細胞位于骨陷窩中，通過骨小管通道內的突觸與鄰近骨細胞相互連接（圖 1c）。骨細胞突觸及骨小管壁之間的空隙中充滿了間隙液及胞周基質，兩者通過纖維突起直接連接在一起。骨陷窩-骨小管系統在骨細胞間、骨細胞與血管間營養和代謝廢物交換中發揮著關鍵作用，研究者們普遍認為骨陷窩-骨小管系統主導了骨內的力刺激傳導過程。
松質骨是骨重建最活躍的區域，也包含著兩級不同尺度的孔隙結構，即骨小梁結構和骨陷窩-骨小管結構。人松質骨中骨小梁的直徑約為 130 μm，骨小梁平均間距約為 1 000 μm。骨小梁結構的孔隙中充滿了液體，主要為由紅細胞、血小板和白細胞等組成的紅骨髓。成骨細胞和破骨細胞通常貼附于骨小梁表面，前者可以分泌骨基質以促進骨形成，后者溶解骨礦物導致骨吸收。在這些骨小梁中同樣具有更小一級的骨陷窩-骨小管系統[3]，甚至可以形成類似密質骨骨單位的結構。
骨重建主要由成骨細胞主導的骨形成過程及破骨細胞主導的骨吸收過程組成，闡明力學刺激如何傳導到骨組織細胞并調控其生物學功能是骨力學領域要解決的核心問題。當人們活動身體時，來自肌肉的收縮力及重力會使骨組織發生變形，而作用于骨的外力傳遞至細胞通常有兩種方式：骨基質的變形引起附著于其上的的細胞產生相應的應變；另外，外力作用下上述孔隙的體積改變，引起孔隙內液體的流動，進而在細胞表面產生流體剪切力（圖 1）。在上述載荷的作用下，骨組織細胞會直接感受力學刺激而產生生物學響應；另外，骨內生化因子、營養供應、pH 值等生理參數也會在力學刺激下發生動態改變，從而進一步引起骨組織細胞對骨結構的改造[4-5]。本文將主要綜述近年來骨內液體流動方面的相關研究進展和成果，并對未來的發展趨勢加以分析和展望。
圖1
骨組織結構 a.股骨； b.松質骨和密質骨微觀結構； c.骨陷窩-骨小管結構
Figure1.
Structure of bones a. femur; b. the microstructure of compact and cancellous bone; c. lacunar-canalicular stucture
1 流體刺激下骨組織細胞的生物學響應
從 20 世紀 90 年代末開始，人們開始關注骨內孔隙中液體流動對骨內細胞的影響[6]，代表性的工作包括紐約城市學院的 Stephen C. Cowin 和 Sheldon Weinbaum。此后大量研究結果表明，在流體剪切力作用下，骨組織細胞會發生顯著的生物學響應。例如，成骨細胞和骨細胞在施加穩定流或脈動流后，細胞中的一氧化氮水平快速增加[7]，脈動流還可在成骨細胞中引起前列腺素 E2（prostag-landin E2，PGE2）的釋放[8]。由于鈣離子是細胞內最重要的第二信使分子，參與眾多的胞內信號通路，人們也通過實驗研究了流體剪切力對骨組織細胞內鈣響應的影響[9-10]。例如，有人發展了骨組織受載情況下在體成像技術，觀察到了骨內流體剪切力作用下嵌入骨基質內部的骨細胞與骨表面細胞（成骨細胞或破骨細胞）的力致鈣響應，發現骨細胞具有顯著鈣振蕩現象[11]。
在相關研究方法和技術方面，近年來有非常顯著的進展。在體外對骨組織細胞施加流體剪切力的實驗中，通常會采用平板流動腔技術，該方法可以提供穩定流場。由于人體運動時骨所受的載荷是周期性的，也有研究在進行體外細胞實驗時采用振蕩流，以與生理條件更加接近。此外，人們還發展了一些其它的技術在體外模擬骨組織細胞的力學環境[12]。例如，有人將骨組織細胞培養在三維基質中模擬生理流體環境[13-16]。又如，微模式化技術被用于更精確地控制骨組織細胞的幾何形狀、相互之間的距離及連接方式，有研究表明細胞網絡結構可以模擬骨陷窩-骨小管結構，從而可以更定量地研究細胞的信號傳導途徑[17-18]。
實際上，當前骨細胞力學領域的主要研究方向之一是細胞流體力學的體外實驗，即應用流動腔、微流控等技術對骨組織細胞施加流體剪切力刺激并觀察其生物學響應。有理由推測，在體情況下骨內間隙流可以有效地刺激在體骨組織細胞的生物學響應。但是受限于骨內液體流動的真實情況（如壓力、剪切力、液體流動速度等）并未明確，難以提供在體骨內液體流動與骨組織細胞響應甚至骨形成之間相關的直接證據。如何證明體外實驗中施加的液體流動條件能夠真實反映在體骨組織細胞的力學環境，以及如何直接開展在體情況下的細胞力學實驗，仍需進行更加深入的研究。
2 骨內液體的壓力
如前文所述，骨內的兩級孔隙（血管通道與骨陷窩-骨小管系統）尺度差距為 2～3 個數量級，因此推測這兩級孔隙結構內的壓力可能也不同。在較大的血管通道中，有足夠大的空間使液體通過擴散很快地釋放壓力，從而可以在較長時間內維持較低的壓力。血管通道內的液體壓力被認為與骨內毛細血管的壓力相當（40～60 mm Hg），如果長時間保持在高于血壓的壓力水平會使骨組織缺乏氧氣和營養。另一方面，骨陷窩-骨小管系統因其較小的孔隙導致液體壓力較難釋放，從而可能在相對較長的時間內保持在一個較高的壓力水平。在骨陷窩-骨小管孔隙中產生的靜水壓力，其大小是骨組織軸向應力的 12%，比血管通道內壓力高出近 40 倍[2]。
由于骨組織細胞通常位于骨內，難以使用無損的方法在體確定骨內細胞周圍的壓力。最近，有人發展了髓內壓動力學的檢測方法，即將股骨開洞，并探入壓力傳感器以實時檢測髓內壓的動態變化。進而他們使用電極對骨骼肌施加不同頻率的電刺激，評估了肌肉收縮對髓內壓和骨應變的影響[19]。此研究發現，髓內壓與刺激頻率之間呈非線性關系，2 Hz 時髓內壓最大，為 14 mm Hg（1.8 kPa），而對所有頻率骨應變都小于 8 με。在距離刺激位置較遠的部分，未觀察到髓內壓和應變的變化。當 5 月齡大鼠受到幅值為 30 mm Hg（4.0 kPa）、頻率為 2 Hz 的動態髓內壓刺激，其成骨相關基因[如 Runt 相關轉錄因子 2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨橋素等]的表達依賴于加載時間，在加載 14 天后增加，而到 21 天后下降[20]。此項研究結果說明髓內壓的動態變化與大鼠的成骨過程密切相關，由于壓力變化通常會引起骨內液體的流動，也間接顯示了液體流動與骨形成相關。
實際上，骨受到動態力學刺激時，細胞會同時受到壓力和流體剪切力的作用，而體外實驗中也不太容易將這兩種力學刺激分割開來。例如流動腔實驗中，人們通常只控制流體剪切力，但會忽略對于腔室中液體壓力的控制。有一個研究設法將流體剪切力和靜態或周期性水壓分離，以觀測各自對成骨細胞的影響[21]。該研究結果顯示施加流體剪切力的同時施加水壓刺激可以影響嘌呤能受體的信號通路以及肌動蛋白骨架的結構，而流體剪切力可獨自影響 B 細胞核轉錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）的核轉移。
由于孔隙結構不同位置處的壓力梯度是驅動液體流動的主要影響因素，因此有必要基于多孔彈性理論、在體流體力學實驗檢測技術、流固耦合數值模擬方法等進一步深入研究骨內的壓力分布以及動態變化特性，從而準確測量和評估骨組織細胞所受的流體力學微環境參數。
3 骨內液體流動的實驗研究
在 20 世紀 70 年代以前，人們并不認為力學載荷作用下骨內液體會發生明顯的流動。實際上，骨細胞深埋于高度不滲透的骨基質中，其周圍可供液體流動的空間很小，徑向寬度不到 1 μm，同時骨細胞間連接的間距又很長（約 30 μm），甚至某些骨細胞與血管通道的距離可達到 200～300 μm。對于骨組織細胞特別是位于骨陷窩內的骨細胞來說，其生存及功能實現需要充足的營養液供應、自身分泌物的交換以及代謝廢物的排放，而簡單的分子擴散并不能滿足這樣的要求。一個合理的解釋是力學刺激主導了骨陷窩里的液體流動，從而為骨細胞的生存提供了充足營養供應及代謝物排放途徑。
目前骨內液體流動的在體檢測技術主要基于染色劑的示蹤灌注技術，例如利用雙硫藍（disul-phine blue）、普施安紅（procion red）、過氧化物酶等。最近有人利用激光共聚焦顯微鏡結合熒光示蹤技術，研究了不同分子量的熒光染料在骨膜處的滲透性，發現 40 kD 以下的染料都可滲透通過骨膜[22]。有人將異硫氰酸熒光素（fluorescein iso-thiocyanate，FITC）標記的牛血清白蛋白注入大鼠脛骨中，施加動態力學刺激后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光染料在骨陷窩-骨小管系統中的運動，發現力學刺激作用下標記有示蹤粒子的骨細胞個數增加，骨質疏松骨內其增加更為顯著，說明骨質疏松會影響力學刺激下的骨內液體流動[23]。骨內的水主要呈現兩種形態，即在孔隙內自由流動或結合在基質上，有學者利用1H 核磁共振技術測量了骨內兩種形態水的比例，發現 70 歲以上人體骨內結合水少而自由水多，并且高體積比的自由水通常對應較低的骨強度，表明骨髓退化導致自由水體積增加[24]。
2005 年 Wang 等[25] 基于熒光漂白恢復（fluore-scence recovery after photobleaching，FRAP）技術發展了一項新的在體測量方法，從而可以實時獲得骨陷窩-骨小管系統中的滲透率。他們構建了在體骨加載模型，然后使用激光共聚焦顯微鏡對骨膜內的密質骨成像，再使用一束高強激光使某個骨陷窩中的熒光染料淬滅，并實時測量了相鄰骨陷窩或骨小管中液體重新擴散到此骨陷窩的動態過程，最后利用對流擴散方程計算滲透率。如果沒有外載，則這種方法可以得到熒光染料的擴散系數，并確定胞外基質的孔隙尺度。通過這一技術，他們測量了不同的幅度、頻率載荷下，骨內液體流動的擴散增強系數及溶質流速[26]。結果發現隨著加載幅度的增加骨內的液體傳輸及溶質速度也相應增強，但是當加載頻率增加時其液體傳輸在一定程度上減弱了。
由于骨細胞主要位于骨骼內部的骨陷窩中，導致很難觀測在體情況下骨細胞周圍的液體流動。即使前述的 FRAP 技術，也由于激光光束穿透深度有限而不易觀察靠近骨髓腔特別是松質骨區域的液體流動。因此，未來有必要進一步發展新的技術手段，如可伸入骨骼內部的微探頭、高分辨率超聲成像、骨骼透明化處理等，從而可以更加準確地測量骨組織細胞周圍的力學微環境。
4 骨內液體流動的理論和數值模擬研究
受限于在體測量實驗技術的缺乏，理論預測和數值模擬成為研究骨內液體流動的有效方法[27-28]。20 世紀 90 年代之前，骨內液體流動的理論模型都只考慮單一尺度的骨孔隙結構（骨單位或骨陷窩-骨小管結構），沒有考慮不同尺度孔隙結構之間的相互影響。1999 年 Wang 等[29] 提出了一個計算模型，同時考慮了骨單位中的血管和骨陷窩系統中的液體流動，用來解釋 Starkebaum 等在 1979 年實驗觀察到的準靜態和動態加載時具有不同應變電勢的現象，并且證明了骨內的液體流動主要通過血管通道來衰減。Wang 等研究結果的意義在于考慮到骨內兩級孔隙結構的孔隙尺度并不相同，即血管通道比骨陷窩-骨小管系統大 2 到 3 個數量級，并證明了血管通道具有更低的壓力，以及同時考慮兩級孔隙結構對于準確計算動載作用下骨內液體流動的重要性。鑒于測量小尺度孔隙內的滲透率較為困難，最近 Benalla 等[30] 建立了一個新的理論模型并應用該模型對實驗結果進行分析，可以準確地測量得到人密質骨內骨陷窩-骨小管系統的滲透率，其量級為 10–22 m2，且隨載荷頻率的增加而線性遞減。
近些年來越來越多的研究使用真實骨結構代替理想的骨模型，并使用流固耦合數值模擬方法來評價骨內的液體流動[31]。2013 年 Birmingham 等[32] 構建了一個包含骨小梁孔隙結構的理想松質骨模型，使用流固耦合數值模擬方法計算了其中的液體流動、壓力分布和流體剪切力。2015 年 Metzger 等[28] 使用微計算機斷層掃描技術（microcomputed tomography，Micro-CT）掃描豬的股骨，通過三維重建得到其真實的松質骨幾何模型。隨后使用流固耦合數值模擬方法對該模型進行計算，研究了豬股骨部位真實松質骨骨小梁孔隙結構中的流體剪切力、壓力分布和流速，并分析了骨髓的不同粘度系數對骨小梁孔隙液體流動的影響。他們的計算結果發現流體剪切力的峰值為 10 Pa，流體剪切力的峰值出現在狹窄區域的流-固交界面上。最近 Fan 等[33] 利用一段小鼠脛骨的 Micro-CT 圖像構建了三維有限元模型，并采用雙相多孔彈性模型來模擬骨的材料力學性質，數值模擬結果顯示靠近髓腔的骨內孔隙流壓力小于靠近骨膜側。
Verbruggen 等[34] 為了評價骨陷窩-骨小管內液體的流動情況，通過對大鼠脛骨中段切片進行熒光染色，再使用熒光共聚焦顯微鏡掃描，經三維重構得到單個骨陷窩-骨小管的真實幾何模型，然后使用流固耦合方法計算了單個骨陷窩-骨小管結構中的液體流動速度、骨細胞膜表面流體剪切力及細胞應變分布，并分析了骨細胞突觸與骨小管壁連接造成的流體剪切力放大現象。計算得到骨陷窩-骨小管內流體剪切力的峰值約為 12 Pa，主要分布于骨細胞突觸與小管連接處，且細胞膜表面流體剪切力均大于 0.8 Pa，高于細胞培養實驗中可導致骨細胞響應的力學刺激閾值。Vaughan 等[35] 的另一工作通過對單個骨陷窩進行流固耦合數值計算，得到了骨陷窩內部骨細胞的應力、應變、流體剪切力的分布情況，討論了骨細胞的原纖毛及整合素蛋白作為細胞力傳感器的潛在可能性。與多孔介質理論比較，盡管這些數值模擬研究中所使用的邊界條件還需進一步討論，但它們能夠更直觀、更細致地反映骨內孔隙中的液體流動情況。
5 總結與展望
由于骨骼內部存在多級孔隙結構，例如密質骨內的哈弗氏系統和骨陷窩-骨小管系統或松質骨內的骨小梁結構和骨陷窩-骨小管結構等，外部載荷作用會引起骨基質變形，進而導致液體部分存在壓力梯度，最終驅動液體發生流動。而液體流動會顯著地影響骨組織細胞的生物學響應，并調控成骨細胞主導的骨形成和破骨細胞主導的骨吸收過程，這也是目前骨生物力學領域公認的調控力致骨重建的主要機制。由本文綜述的相關研究成果可以看出，近年來人們已經在理論、實驗、數值模擬等不同方面取得了大量重要進展，對骨內液體流動的形式及其生物學作用的刻畫也愈來愈清晰。盡管如此，該領域仍然存在一些重要問題尚未解決。
首先，盡管有許多研究通過理論建模試圖闡明骨內液體流動的機制[25]，但是這些研究通常采用理想化的幾何模型，并且對邊界條件作了一定的簡化，實際上這樣的理論預測結果并不能精準地反映骨內液體流動情況。其次，在利用數值模擬方法來探索外力引起的骨內液體流動時，有的研究通過 Biot 滲流理論等多孔彈性介質模型來計算受外力作用時骨內的液體流速、壓力梯度、流體剪切力等參數[7]，但是此種模型并不能反映真實的骨結構，不能準確獲得骨內具體微觀結構（如骨小梁、骨陷窩-骨小管系統）的局部液體流動信息。另外，有人使用流體動力學模型來數值模擬骨內液體流動，并將骨基質假設為剛體，其實并不能準確反映外力作用下骨組織變形導致的流-固耦合現象。近幾年也有人使用流固耦合數值模擬方法計算了松質骨中骨小梁孔隙內和骨陷窩-骨小管內的流體剪切力[28,32,34-35]，但其所使用的邊界條件的合理性仍需要進一步討論，且這些研究中均未考慮不同尺度的孔隙結構之間的相互影響及其流體刺激的量級是否有差異。最后，作為骨重建最活躍的區域，松質骨越來越受到骨生物力學研究人員的關注，但與密質骨相關研究比較，松質骨內兩級孔隙結構中液體流動的研究仍較少。因此，有必要在考慮流固耦合作用的條件下深入研究松質骨兩級孔隙結構中的液體流動。
闡明骨內液體流動的具體形式及生物學調控機制，將促進人們對力致骨重建過程的深入理解，最終有助于解決長期臥床、廢用及宇航員長期空間飛行等由于缺少力學刺激引起的骨流失甚至骨質疏松癥等健康問題。
