血小板在激活劑作用下會快速活化并釋放具有高促凝活性的血小板膜微粒（PMPs），進而誘發出凝血功能障礙，但 PMPs 的形成機制有待明確。探針跳躍式離子電導顯微鏡（HPICM）具有在生理環境下對活體細胞進行非接觸式實時高分辨率成像的技術優勢。本文運用 HPICM 技術實時監測血小板在胞內鈣離子誘導劑 A23187 和細胞松弛素 D 作用下活化及 PMPs 形成的過程，證明了胞內鈣離子濃度和細胞骨架蛋白在血小板活化及 PMPs 形成中發揮了重要作用；并發現與扁平型血小板相比，突起型血小板對 A23187 和細胞松弛素 D 更為敏感，這對利用 HPICM 技術研究血小板活化與出凝血功能調節之間的關系具有指導意義。
引用本文： 劉曉, 羅玉福, 張彥軍. 利用探針跳躍式離子電導顯微鏡研究活體血小板膜結構及其膜微粒的形成. 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(5): 767-771. doi: 10.7507/1001-5515.201611004 復制
引言
有研究表明，血小板在促凝血酶原激酶及血小板活化因子等激活劑作用下，會快速活化并發生形變、血小板膜蛋白磷酸化以及細胞骨架重排，從而使部分血小板膜脫落而形成直徑為 10～500 nm 的微小膜性囊泡，即血小板膜微粒（platelet micropar-ticles，PMPs）[1-3]。研究報道，在腦卒中及外傷性顱腦損傷患者的腦脊液和血液中血小板活化并生成大量促凝的 PMPs[4-5]；PMPs 膜上富含磷脂酰絲氨酸，其促凝活性是活化血小板的 50～100 倍[6]；PMPs 能夠進一步促進血小板活化并形成更多 PMPs，進而可誘發出凝血功能障礙，但這些具有高度促凝活性的 PMPs 的形成機制至今尚不明確[1-2, 7]。
PMPs 體積小于正常的血小板但具有完整的膜結構，由于 PMPs 膜來源于血小板膜，故活化后血小板膜上的多數標志物均可在 PMPs 膜上表達[8]。利用 PMPs 的特異性標志物（如：GPⅡb/Ⅲa 復合物、GPⅠb/ⅢX 復合物、P-選擇素、磷脂酰絲氨酸等）借助于流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測 PMPs 的形成。然而，盡管借助于價格昂貴的熒光抗體，但目前可探測的 PMPs 依然局限在直徑大于 100 nm 的范圍，無法探測小于 100 nm 的 PMPs[3]。
由于血小板具有柔軟而復雜的膜結構，且極易受機械或化學刺激而迅速活化并改變形貌，要實時跟蹤活體血小板的活化及其納米級 PMPs 的動態形成過程，需要一種無創、非接觸且高分辨率的新型顯微鏡技術[3]。近年來，廣泛應用于生物醫學研究的原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）被初步用于血小板的活化[9]及 PMPs 的形貌[10]研究，但即使在對生物樣品影響較小的輕敲操作模式下，掃描成像過程中探針針尖與生物樣品間的輕微接觸也不可避免[11]，這些微弱的機械作用力不僅會損傷血小板柔軟的膜結構[12]，會人為激活血小板活化而改變形貌，還會人為促使 PMPs 的形成而造成測試的假陽性，因此高分辨率的 AFM 也不能滿足實時動態研究血小板活化及 PMPs 形成機制的需要。
探針跳躍式離子電導顯微鏡技術（hopping probe ion conductance microscopy，HPICM）可以使活細胞非接觸掃描成像達到橫向 10 nm、縱向 5 nm 的高分辨率[13-15]。與其它生物樣品顯微鏡探測技術相比，非接觸式的 HPICM 更適合在生理液態環境條件下對柔軟活體細胞進行非侵入式的高分辨率掃描成像[16]，其具有明顯技術優勢：① 非接觸式探測生物樣品；② 樣品制備簡單；③ 可在生理環境條件下對活體細胞表面微觀結構進行連續掃描成像；④ 高分辨率地實時探測。我們[12, 17]已利用 HPICM 技術在生理液態條件下高分辨率地研究了活體血小板的形貌，本文中我們進一步運用 HPICM 技術實時監控血小板在激活劑作用下活化及 PMPs 的動態形成過程。
1 材料與方法
1.1 藥品與儀器
L15 培養基購自美國 Gibco 公司，人纖維蛋白原購自北京博奧森公司，胞內鈣離子誘導劑 A23187 和細胞松弛素 D（cytochalasin D, CD）購自美國 Sigma 公司。掃描成像用玻璃微探針為硼硅酸鹽微電極玻璃毛細管（外徑 1.00 mm，內徑 0.59 mm，長度 90 mm），購自武漢濱川科學儀器有限公司。掃描離子電導顯微鏡（ICnano SICM）購自英國 Ionscope 有限公司，MultiClamp 700B、Digidata 1440A 購自美國 Axon 公司，TiU 倒置顯微鏡購自日本 Nikon 公司，P-2000/G 型程控水平激光微電極拉制儀購自美國 Sutter Instrument 公司。
1.2 富血小板血漿的制備及活體血小板體外貼壁黏附方法的建立
血液樣品的采集：隨機抽取年齡為 20～40 歲的健康男性（兩周內未服用抗凝及抗血小板藥物、無心腦血管疾病的健康人）空腹肘靜脈血樣 33 例，采血 2 mL 置于一次性真空采血管（檸檬酸鈉 9∶1）中備用；其中 15 例血樣用于在生理液態環境中對體外活體血小板的掃描成像（對照組），8 例血樣在相同掃描過程中加入 1 μmol/L A23187（A23187 組），10 例血樣在相同掃描過程中加入 10 μmol/L 細胞松弛素 D（CD 組）。
標本收集嚴格遵守相關的倫理學原則，在受試者知情同意的前提下進行。
富血小板血漿的制備：室溫 150 × g 離心 15 min， 取上清液獲得富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP），保存于氣浴恒溫 37℃ 振蕩器中，所有試驗均在 PRP 制備后 3 h 內完成。
活體血小板的體外貼壁黏附方法：在 35 mm 培養皿底部以 1 mg/mL 人纖維蛋白原鋪備基底，于 4℃ 過夜保存；使用前將該皿于室溫溫育約 30 min 后用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）溶液洗滌，將 PRP 滴入皿內室溫靜置 30 min；依次用無菌 PBS 溶液、L15 培養基輕柔洗滌，以去除未貼壁黏附的血小板，此后置于 2 mL L15 培養基中用于 HPICM 掃描成像實驗。
1.3 利用 HPICM 技術對活體血小板進行掃描成像
本實驗室的 HPICM 技術平臺是在掃描離子電導顯微鏡系統（ICnano SICM）基礎上改進而成，主要由精密掃描頭、掃描控制器、商用膜片鉗系統及裝有操控及圖像采集軟件的個人電腦組成[18]。掃描控制器以 20 kHz 的高速采樣頻率實時監測流入玻璃微探針的電流變化，利用 MultiClamp 700B 膜片鉗放大器給玻璃微探針提供 + 200 mV 的電壓。運用 HPICM 技術對血小板進行掃描成像時，50 μm ×50 μm 掃描范圍的成像時間為 7～9 min，10 μm ×10 μm 與 15 μm × 15 μm 掃描范圍的成像視樣品表面復雜程度不同所需時間為 5～7 min。所得圖像利用 HPICM Image Viewer 軟件進行圖像處理與分析。
本實驗所使用的玻璃微探針為硼硅酸鹽微電極玻璃毛細管，經 P-2000/G 程控水平激光微電極拉制儀拉制而成，探針尖端內半徑約為 20 nm。將探針內充灌電極內液（L15 培養基），通過商用膜片鉗技術測得探針電阻值約為 140 MΩ[19]。
HPICM 成像實驗分別對對照組、A23187 組和 CD 組隨機選取 50 μm × 50 μm 區域的體外貼壁的活體血小板進行連續掃描。A23187 組和 CD 組在加入藥物時，為避免污染及損傷玻璃探針的針尖和細胞樣品，輕抬玻璃探針遠離樣品表面但針尖部分仍浸于 L15 培養基的液體環境，分別加入 A23187 和細胞松弛素 D，待藥品擴散混勻后控制探針緩慢接近樣品表面，從而對同一區域內的血小板進行連續掃描成像。本實驗中所有 HPICM 掃描成像實驗均在室溫（23±2）℃ 條件下進行。
2 結果與分析
2.1 利用 HPICM 技術在體外對正常人活體血小板進行掃描成像
我們利用 HPICM 技術在生理液態培養條件下對體外靜息狀態的活體血小板的三維形貌進行了掃描成像（對照組，見圖 1）。在 50 μm × 50 μm 尺度范圍的成像中可以清晰地觀察到活體貼壁的血小板呈現出兩種不同表型：扁平型（low density spread shape，LDSS， 圖 1a 實線箭頭所示）和突起型（high density bubble shape，HDBS，圖 1a 虛線箭頭所示）。對 15 例對照組血小板掃描數據中的扁平型和突起型血小板分別進行統計顯示：扁平型血小板的直徑為 4.6～8.7 μm，中心高度為 0.3～0.6 μm（n=56）；突起型血小板的直徑為 1.6～3.8 μm，中心高度為 1.1～3.3 μm（n=62）；此外還發現，健康人體外靜息狀態的活體血小板中扁平型和突起型血小板的比例保持在 1∶1 左右。為了對兩種不同表型血小板的形態特征進行高分辨率研究，我們利用 HPICM 的精確定位技術，隨機選取了扁平型（圖 1b）和突起型（圖 1c）血小板分別進行了 15 μm ×15 μm 和 10 μm×10 μm 的高分辨率放大掃描成像。扁平型細胞在人纖維蛋白原上充分鋪展，中心和邊緣的高度差較小，為 0.3～0.4 μm，并且細胞邊緣光滑完整；而突起型細胞中心和邊緣的高度差達 1.4～1.7 μm，其邊緣部分表現為樹枝狀不規則結構向周圍伸展。
圖1
健康人活體血小板的 HPICM 掃描成像
a. 活體血小板的 HPICM 成像，實線箭頭和虛線箭頭分別指示扁平型血小板和突起型血小板；b. 扁平型血小板的高分辨率掃描成像；c. 突起型血小板的高分辨率掃描成像
Figure1. Morphological imagings of live blood platelet in healthy subject using HPICMa. an image of live blood platelets, white solid arrows represent LDSS and white dotted arrows represent HDBS; b. a high-resolution image of single LDSS platelet; c. a high-resolution image of single HDBS platelet
2.2 利用 HPICM 技術實時動態研究胞內鈣離子在血小板活化及 PMPs 形成中的作用
血小板的活化功能與胞內鈣離子濃度密切相關，胞內鈣離子誘導劑 A23187 會誘發鈣離子迅速進入細胞內，我們用 A23187 處理血小板，并利用 HPICM 連續掃描成像，實時記錄體外活體貼壁血小板在胞內鈣離子濃度增加后其形貌的動態變化過程。此前的研究表明，在無外源藥物作用的生理液態環境中，黏附于人纖維蛋白原基底上的健康人體外活體血小板在 45 min HPICM 連續掃描成像過程中，扁平型血小板幾乎沒有形態變化，突起型血小板中一部分形態保持不變，另一部分則逐漸變成扁平型[12]。
在 A23187 作用下血小板的 HPICM 掃描成像結果顯示（見圖 2），血小板對 1 μmol/L A23187 的激活作用非常敏感，當把 A23187 加入到含有鈣離子的 L15 培養液 18 min 后即引起了掃描區域內所有血小板的急劇形變甚至破碎，同時還可以清晰地觀察到由虛線橢圓標識出的 PMPs 的產生與釋放。隨著 A23187 作用時間的延長（圖 2，34 min），兩型血小板的收縮形變都進一步加劇，同時部分突起型血小板發生凋亡、消失（圖 2，實線橢圓所示）。與扁平型血小板的形變（圖 2，實線箭頭所示）對比發現，突起型血小板對 A23187 的作用更敏感，更容易發生收縮、凋亡。
圖2
在 A23187 作用下同一區域內活體貼壁血小板的 HPICM 連續掃描成像
Figure2.
HPICM continuous scanning imagings of live platelets adherent to fibrinogen in the presence of A23187 in the same field
2.3 利用 HPICM 技術實時動態研究細胞骨架在血小板活化及 PMPs 形成中的作用
血小板變形是一種快速的血小板活化表現，其本質是血小板在活性物質作用下發生了骨架蛋白的收縮運動。因此，我們使用細胞松弛素 D，以期觀察到細胞骨架對血小板活化過程形貌變化以及 PMPs 形成的影響。
隨機選取體外活體貼壁的血小板群對其進行 50 μm × 50 μm 范圍的 HPICM 掃描成像，實時掃描觀測 10 μmol/L 細胞松弛素 D 持續作用下的同一區域內血小板的變化（見 圖 3）。結果顯示，當細胞松弛素 D 持續作用 19 min 時，突起型血小板變化明顯（圖 3，實線橢圓所示），約 50% 的突起型血小板破碎消失，其所在位置附近有明顯的 PMPs 產生和釋放（圖 3，虛線橢圓所示）；部分扁平型血小板出現較明顯的形貌變化。當細胞松弛素 D 持續作用 34 min 時，約 70% 的突起型血小板消失，扁平型血小板出現收縮隆起的跡象（圖 3，實線箭頭所示）。由此可見，突起型血小板對細胞松弛素 D 的作用更敏感，藥物反應更快更劇烈，更容易形成并釋放 PMPs。
圖3
在 CD 作用下同一區域內體外活體貼壁血小板的 HPICM 連續掃描成像
Figure3.
HPICM continuous scanning imagings of live platelets adherent to fibrinogen in the presence of CD in the same field
3 結論
本研究在納米尺度利用 HPICM 技術在生理活性條件下高分辨率地觀察到扁平型和突起型兩種血小板亞型；實時、動態、高分辨率地監測到扁平型和突起型血小板在 A23187 和細胞松弛素 D 作用下都呈現出收縮、變高的趨勢，并伴隨 PMPs 的產生釋放，直至血小板破碎、消失，這直接證明了胞內鈣離子濃度和細胞骨架蛋白在血小板活化及 PMPs 的形成中發揮了重要作用；同時發現，較之于扁平型血小板，突起型血小板對胞內鈣離子誘導劑 A23187 和細胞松弛素 D 更敏感，更容易被活化釋放 PMPs，這為研究凝血功能調節提供了新的方向。本研究填補了國內利用非接觸式掃描探針顯微鏡技術高分辨率研究血小板活化及 PMPs 形成的空白，對今后進一步利用該技術開展血小板活化與出凝血功能之間關系等相關研究具有示范及指導意義。
引言
有研究表明，血小板在促凝血酶原激酶及血小板活化因子等激活劑作用下，會快速活化并發生形變、血小板膜蛋白磷酸化以及細胞骨架重排，從而使部分血小板膜脫落而形成直徑為 10～500 nm 的微小膜性囊泡，即血小板膜微粒（platelet micropar-ticles，PMPs）[1-3]。研究報道，在腦卒中及外傷性顱腦損傷患者的腦脊液和血液中血小板活化并生成大量促凝的 PMPs[4-5]；PMPs 膜上富含磷脂酰絲氨酸，其促凝活性是活化血小板的 50～100 倍[6]；PMPs 能夠進一步促進血小板活化并形成更多 PMPs，進而可誘發出凝血功能障礙，但這些具有高度促凝活性的 PMPs 的形成機制至今尚不明確[1-2, 7]。
PMPs 體積小于正常的血小板但具有完整的膜結構，由于 PMPs 膜來源于血小板膜，故活化后血小板膜上的多數標志物均可在 PMPs 膜上表達[8]。利用 PMPs 的特異性標志物（如：GPⅡb/Ⅲa 復合物、GPⅠb/ⅢX 復合物、P-選擇素、磷脂酰絲氨酸等）借助于流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測 PMPs 的形成。然而，盡管借助于價格昂貴的熒光抗體，但目前可探測的 PMPs 依然局限在直徑大于 100 nm 的范圍，無法探測小于 100 nm 的 PMPs[3]。
由于血小板具有柔軟而復雜的膜結構，且極易受機械或化學刺激而迅速活化并改變形貌，要實時跟蹤活體血小板的活化及其納米級 PMPs 的動態形成過程，需要一種無創、非接觸且高分辨率的新型顯微鏡技術[3]。近年來，廣泛應用于生物醫學研究的原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）被初步用于血小板的活化[9]及 PMPs 的形貌[10]研究，但即使在對生物樣品影響較小的輕敲操作模式下，掃描成像過程中探針針尖與生物樣品間的輕微接觸也不可避免[11]，這些微弱的機械作用力不僅會損傷血小板柔軟的膜結構[12]，會人為激活血小板活化而改變形貌，還會人為促使 PMPs 的形成而造成測試的假陽性，因此高分辨率的 AFM 也不能滿足實時動態研究血小板活化及 PMPs 形成機制的需要。
探針跳躍式離子電導顯微鏡技術（hopping probe ion conductance microscopy，HPICM）可以使活細胞非接觸掃描成像達到橫向 10 nm、縱向 5 nm 的高分辨率[13-15]。與其它生物樣品顯微鏡探測技術相比，非接觸式的 HPICM 更適合在生理液態環境條件下對柔軟活體細胞進行非侵入式的高分辨率掃描成像[16]，其具有明顯技術優勢：① 非接觸式探測生物樣品；② 樣品制備簡單；③ 可在生理環境條件下對活體細胞表面微觀結構進行連續掃描成像；④ 高分辨率地實時探測。我們[12, 17]已利用 HPICM 技術在生理液態條件下高分辨率地研究了活體血小板的形貌，本文中我們進一步運用 HPICM 技術實時監控血小板在激活劑作用下活化及 PMPs 的動態形成過程。
1 材料與方法
1.1 藥品與儀器
L15 培養基購自美國 Gibco 公司，人纖維蛋白原購自北京博奧森公司，胞內鈣離子誘導劑 A23187 和細胞松弛素 D（cytochalasin D, CD）購自美國 Sigma 公司。掃描成像用玻璃微探針為硼硅酸鹽微電極玻璃毛細管（外徑 1.00 mm，內徑 0.59 mm，長度 90 mm），購自武漢濱川科學儀器有限公司。掃描離子電導顯微鏡（ICnano SICM）購自英國 Ionscope 有限公司，MultiClamp 700B、Digidata 1440A 購自美國 Axon 公司，TiU 倒置顯微鏡購自日本 Nikon 公司，P-2000/G 型程控水平激光微電極拉制儀購自美國 Sutter Instrument 公司。
1.2 富血小板血漿的制備及活體血小板體外貼壁黏附方法的建立
血液樣品的采集：隨機抽取年齡為 20～40 歲的健康男性（兩周內未服用抗凝及抗血小板藥物、無心腦血管疾病的健康人）空腹肘靜脈血樣 33 例，采血 2 mL 置于一次性真空采血管（檸檬酸鈉 9∶1）中備用；其中 15 例血樣用于在生理液態環境中對體外活體血小板的掃描成像（對照組），8 例血樣在相同掃描過程中加入 1 μmol/L A23187（A23187 組），10 例血樣在相同掃描過程中加入 10 μmol/L 細胞松弛素 D（CD 組）。
標本收集嚴格遵守相關的倫理學原則，在受試者知情同意的前提下進行。
富血小板血漿的制備：室溫 150 × g 離心 15 min， 取上清液獲得富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP），保存于氣浴恒溫 37℃ 振蕩器中，所有試驗均在 PRP 制備后 3 h 內完成。
活體血小板的體外貼壁黏附方法：在 35 mm 培養皿底部以 1 mg/mL 人纖維蛋白原鋪備基底，于 4℃ 過夜保存；使用前將該皿于室溫溫育約 30 min 后用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）溶液洗滌，將 PRP 滴入皿內室溫靜置 30 min；依次用無菌 PBS 溶液、L15 培養基輕柔洗滌，以去除未貼壁黏附的血小板，此后置于 2 mL L15 培養基中用于 HPICM 掃描成像實驗。
1.3 利用 HPICM 技術對活體血小板進行掃描成像
本實驗室的 HPICM 技術平臺是在掃描離子電導顯微鏡系統（ICnano SICM）基礎上改進而成，主要由精密掃描頭、掃描控制器、商用膜片鉗系統及裝有操控及圖像采集軟件的個人電腦組成[18]。掃描控制器以 20 kHz 的高速采樣頻率實時監測流入玻璃微探針的電流變化，利用 MultiClamp 700B 膜片鉗放大器給玻璃微探針提供 + 200 mV 的電壓。運用 HPICM 技術對血小板進行掃描成像時，50 μm ×50 μm 掃描范圍的成像時間為 7～9 min，10 μm ×10 μm 與 15 μm × 15 μm 掃描范圍的成像視樣品表面復雜程度不同所需時間為 5～7 min。所得圖像利用 HPICM Image Viewer 軟件進行圖像處理與分析。
本實驗所使用的玻璃微探針為硼硅酸鹽微電極玻璃毛細管，經 P-2000/G 程控水平激光微電極拉制儀拉制而成，探針尖端內半徑約為 20 nm。將探針內充灌電極內液（L15 培養基），通過商用膜片鉗技術測得探針電阻值約為 140 MΩ[19]。
HPICM 成像實驗分別對對照組、A23187 組和 CD 組隨機選取 50 μm × 50 μm 區域的體外貼壁的活體血小板進行連續掃描。A23187 組和 CD 組在加入藥物時，為避免污染及損傷玻璃探針的針尖和細胞樣品，輕抬玻璃探針遠離樣品表面但針尖部分仍浸于 L15 培養基的液體環境，分別加入 A23187 和細胞松弛素 D，待藥品擴散混勻后控制探針緩慢接近樣品表面，從而對同一區域內的血小板進行連續掃描成像。本實驗中所有 HPICM 掃描成像實驗均在室溫（23±2）℃ 條件下進行。
2 結果與分析
2.1 利用 HPICM 技術在體外對正常人活體血小板進行掃描成像
我們利用 HPICM 技術在生理液態培養條件下對體外靜息狀態的活體血小板的三維形貌進行了掃描成像（對照組，見圖 1）。在 50 μm × 50 μm 尺度范圍的成像中可以清晰地觀察到活體貼壁的血小板呈現出兩種不同表型：扁平型（low density spread shape，LDSS， 圖 1a 實線箭頭所示）和突起型（high density bubble shape，HDBS，圖 1a 虛線箭頭所示）。對 15 例對照組血小板掃描數據中的扁平型和突起型血小板分別進行統計顯示：扁平型血小板的直徑為 4.6～8.7 μm，中心高度為 0.3～0.6 μm（n=56）；突起型血小板的直徑為 1.6～3.8 μm，中心高度為 1.1～3.3 μm（n=62）；此外還發現，健康人體外靜息狀態的活體血小板中扁平型和突起型血小板的比例保持在 1∶1 左右。為了對兩種不同表型血小板的形態特征進行高分辨率研究，我們利用 HPICM 的精確定位技術，隨機選取了扁平型（圖 1b）和突起型（圖 1c）血小板分別進行了 15 μm ×15 μm 和 10 μm×10 μm 的高分辨率放大掃描成像。扁平型細胞在人纖維蛋白原上充分鋪展，中心和邊緣的高度差較小，為 0.3～0.4 μm，并且細胞邊緣光滑完整；而突起型細胞中心和邊緣的高度差達 1.4～1.7 μm，其邊緣部分表現為樹枝狀不規則結構向周圍伸展。
圖1
健康人活體血小板的 HPICM 掃描成像
a. 活體血小板的 HPICM 成像，實線箭頭和虛線箭頭分別指示扁平型血小板和突起型血小板；b. 扁平型血小板的高分辨率掃描成像；c. 突起型血小板的高分辨率掃描成像
Figure1. Morphological imagings of live blood platelet in healthy subject using HPICMa. an image of live blood platelets, white solid arrows represent LDSS and white dotted arrows represent HDBS; b. a high-resolution image of single LDSS platelet; c. a high-resolution image of single HDBS platelet
2.2 利用 HPICM 技術實時動態研究胞內鈣離子在血小板活化及 PMPs 形成中的作用
血小板的活化功能與胞內鈣離子濃度密切相關，胞內鈣離子誘導劑 A23187 會誘發鈣離子迅速進入細胞內，我們用 A23187 處理血小板，并利用 HPICM 連續掃描成像，實時記錄體外活體貼壁血小板在胞內鈣離子濃度增加后其形貌的動態變化過程。此前的研究表明，在無外源藥物作用的生理液態環境中，黏附于人纖維蛋白原基底上的健康人體外活體血小板在 45 min HPICM 連續掃描成像過程中，扁平型血小板幾乎沒有形態變化，突起型血小板中一部分形態保持不變，另一部分則逐漸變成扁平型[12]。
在 A23187 作用下血小板的 HPICM 掃描成像結果顯示（見圖 2），血小板對 1 μmol/L A23187 的激活作用非常敏感，當把 A23187 加入到含有鈣離子的 L15 培養液 18 min 后即引起了掃描區域內所有血小板的急劇形變甚至破碎，同時還可以清晰地觀察到由虛線橢圓標識出的 PMPs 的產生與釋放。隨著 A23187 作用時間的延長（圖 2，34 min），兩型血小板的收縮形變都進一步加劇，同時部分突起型血小板發生凋亡、消失（圖 2，實線橢圓所示）。與扁平型血小板的形變（圖 2，實線箭頭所示）對比發現，突起型血小板對 A23187 的作用更敏感，更容易發生收縮、凋亡。
圖2
在 A23187 作用下同一區域內活體貼壁血小板的 HPICM 連續掃描成像
Figure2.
HPICM continuous scanning imagings of live platelets adherent to fibrinogen in the presence of A23187 in the same field
2.3 利用 HPICM 技術實時動態研究細胞骨架在血小板活化及 PMPs 形成中的作用
血小板變形是一種快速的血小板活化表現，其本質是血小板在活性物質作用下發生了骨架蛋白的收縮運動。因此，我們使用細胞松弛素 D，以期觀察到細胞骨架對血小板活化過程形貌變化以及 PMPs 形成的影響。
隨機選取體外活體貼壁的血小板群對其進行 50 μm × 50 μm 范圍的 HPICM 掃描成像，實時掃描觀測 10 μmol/L 細胞松弛素 D 持續作用下的同一區域內血小板的變化（見 圖 3）。結果顯示，當細胞松弛素 D 持續作用 19 min 時，突起型血小板變化明顯（圖 3，實線橢圓所示），約 50% 的突起型血小板破碎消失，其所在位置附近有明顯的 PMPs 產生和釋放（圖 3，虛線橢圓所示）；部分扁平型血小板出現較明顯的形貌變化。當細胞松弛素 D 持續作用 34 min 時，約 70% 的突起型血小板消失，扁平型血小板出現收縮隆起的跡象（圖 3，實線箭頭所示）。由此可見，突起型血小板對細胞松弛素 D 的作用更敏感，藥物反應更快更劇烈，更容易形成并釋放 PMPs。
圖3
在 CD 作用下同一區域內體外活體貼壁血小板的 HPICM 連續掃描成像
Figure3.
HPICM continuous scanning imagings of live platelets adherent to fibrinogen in the presence of CD in the same field
3 結論
本研究在納米尺度利用 HPICM 技術在生理活性條件下高分辨率地觀察到扁平型和突起型兩種血小板亞型；實時、動態、高分辨率地監測到扁平型和突起型血小板在 A23187 和細胞松弛素 D 作用下都呈現出收縮、變高的趨勢，并伴隨 PMPs 的產生釋放，直至血小板破碎、消失，這直接證明了胞內鈣離子濃度和細胞骨架蛋白在血小板活化及 PMPs 的形成中發揮了重要作用；同時發現，較之于扁平型血小板，突起型血小板對胞內鈣離子誘導劑 A23187 和細胞松弛素 D 更敏感，更容易被活化釋放 PMPs，這為研究凝血功能調節提供了新的方向。本研究填補了國內利用非接觸式掃描探針顯微鏡技術高分辨率研究血小板活化及 PMPs 形成的空白，對今后進一步利用該技術開展血小板活化與出凝血功能之間關系等相關研究具有示范及指導意義。
