本文用放射性核素標記以及單光子發射型計算機斷層（SPECT）γ 顯像的方法，進行 E-選擇素蛋白分子位點密度測定，以探討其實用價值。采用 Indogen 法對 E-選擇素蛋白分子抗體進行 125I 標記，標記產物經 G25 葡聚糖凝膠層析柱分離純化，對分離出的樣品排列在塑膠試管架上，用 SPECT 進行平面顯像并定量分析。制備不同濃度的 E-選擇素標準溶液，將放射性計數換算為位點密度，作蛋白量位點密度標準曲線。標記產物經 SPECT 定量分析，E-選擇素抗體標記率為 78%；不同濃度樣品飽和曲線顯示，當濃度在 0～1 mg/mL 濃度范圍時，得標準曲線為 y=6 045.7x—51.166，決定系數 R2=0.997 9。研究結果表明，γ 顯像在放射性標記產物分析及位點密度測定時有一定實用價值。
引用本文： 張金赫, 李趣歡, 凌穎琛, 鐘建秋, 尹吉林, 徐浩. γ 顯像在層析分離及蛋白分子位點密度測定中的應用. 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(3): 445-448. doi: 10.7507/1001-5515.201609035 復制
引言
在炎癥反應的過程中，由 E-選擇素介導的白細胞對內皮細胞的黏附是關鍵步驟[1]。人們常用平行平板流動腔（parallel plat flow chamber，PPFC）實驗來模擬體外循環的白細胞黏附過程[2]。因此準確測定 PPFC 表面 E-選擇素的位點密度，是在分子水平上研究 E-選擇素介導機制的關鍵。
放射性同位素 125I 標記示蹤法具有較高的靈敏度，在位點密度的測定中受到廣泛應用[3]。在測定標記率時，傳統的方法是將標記樣品上柱純化后，得到分離樣品，通常為多個試管，然后用 γ 計數器檢測每管溶液的放射性計數，得到分離曲線，以計算標記率[4]。這樣不僅耗時，而且會因放射性的衰減造成誤差，尤其對于短半衰期核素更為明顯。計算位點密度時制作標準曲線，同樣要測定不同樣品的放射性，也存在相同的問題。本研究采用單光子發射型計算機斷層（single photon emission com-puted tomography，SPECT）進行單光子發射掃描，可對樣品進行批量檢測，有利于減少誤差，同時可借助 SPECT 本身軟件，進行半自動定量分析，提高檢測精度及檢測效率。
1 材料與方法
1.1 儀器與材料
單光子發射型計算機斷層設備為美國 GE 公司的 Infinia Hawkeye 4；重組人類 E-選擇素（R&D）、抗人類 E-選擇素抗體（R&D）、聚苯乙烯 48 孔板（Corning Inc，NY）、預涂層碘化管（Pre-Coated Iodination Tube）由美國 Pierce 公司提供；125I 由中國同輻有限公司提供；Tris 緩沖液為實驗室自行配制；終止反應溶液為含 10 mg/mL 酪氨酸的 Tris 緩沖液，由實驗室自行配制；層析柱為 10 mL 玻璃柱，用 G25 葡聚糖凝膠自行填充，使用前用 20～30 mL Tris 緩沖液平衡。
1.2 方法
1.2.1 125I 標記抗人類 E-選擇素抗體 在預涂層碘化管中加入 1 mL Tris 緩沖液，潤濕后倒掉；將 100 μL 高濃度 Tris 緩沖液直接加入預涂層碘化管的底部，注意避免溶液接觸試管管壁；加入 10 μL（1.0 mCi）Na125I 溶液，讓碘化物活化 6 min，每 30 s 旋轉試管一次；將活化后的碘化物加入到 25 μg E-選擇素抗體蛋白溶液中混合，反應 9 min，每 30 s 輕輕晃動試管一次；然后加入 50 μL 終止反應溶液，混勻并孵育 5 min。
1.2.2 層析過柱 將產物加入到 10 mL 層析柱中，將 0.5 mL Tris 緩沖液加入到樣品管中，以溶解剩余蛋白，并加入到層析柱中；用 Tris 緩沖液對層析柱進行洗脫，每 0.5～0.8 mL（18 滴左右）收集一管，共收集 30 管。
1.2.3 對收集樣品的試管進行 γ 顯像 標記抗體過柱后，試管收集，將樣品順序排列在塑膠試管架上，用 SPECT 進行平面 γ 顯像，并用自帶軟件進行定量分析。SPECT 顯像采用低能通用準直器，能峰（36±3.6）keV，矩陣 128×128，放大倍數 1.0，采集時間根據放射性計數，可采集 10～30 min。
1.2.4 放射密度檢測 將柱分離得到的標記樣品，也就是第一個峰收集到的幾管溶液混合，測定總放射量和總蛋白量，計算放射量/分子數比值，為下一步將放射性定量轉化為位點密度做好準備。
1.2.5 E-選擇素位點密度測定標準曲線的制作 將 130 μL 特定濃度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL）的 E-選擇素溶液加入 48 孔聚苯乙烯板中（直徑 10.2 mm），聚苯乙烯板中的聚苯乙烯可以有效吸附 E-選擇素分子，形成不同位點密度的平面，每個濃度重復 4 次，每個樣品之間間隔至少一個空白孔，置 4℃ 冰箱中過夜，使其吸附牢固。加入 130 μL 標有 125I 的抗體分子溶液，室溫孵育 30 min，進行免疫結合。然后吸走多余抗體溶液，用 Tris 緩沖液清洗三次，最后再加入 130 μL Tris 緩沖液。用 SPECT 檢測 48 孔板中每個樣品的放射性，作蛋白量放射性標準曲線及蛋白量位點密度曲線。
1.2.6 統計方法 采用 SPECT 自帶軟件 Xerise Functional Imaging Workstation 進行半定量分析，采用 SPSS 17.0 進行標準曲線繪制及回歸方程計算。
2 結果
2.1 標記結果
標記抗體過柱后，試管收集，共 30 管，順序置于塑料試管架上，進行 SPECT 掃描。結果見圖 1。
圖1
過柱后收集管的 SPECT 顯像圖
Figure1.
SPECT imaging of the collection tube
用 SPECT 自帶軟件對每一管放射性進行定量測定，并做出直方圖，因 1～5 管為空白，故從第 5 管開始計算，見圖 2。各收集管的放射量出現兩個峰，第一峰為標有 125I 的抗體峰，第二峰為游離的 125I 峰，經計算，抗體標記率達 78%，其中第 6～10 管樣品已占抗體標記物 99%，收集并保存于 4℃ 冰箱備用。
圖2
過柱后收集管放射性計數定量直方圖
Figure2.
Quantitative histogram of radioactivity counts of the collection tube
2.2 放射性計數與位點密度的定量關系
根據 1 min 標記物的總放射性計數和標記物的質量，可計算出 1 min 每分子標記物的放射性計數頻率為 1.08×10–11，已知 48 孔聚苯乙烯板每孔直徑為 10.2 mm，所以測得每孔一定時間放射性計數，即可求得標記分子數量及其在平板的密度。
2.3 E-選擇素位點密度測定標準曲線
將制作好的 48 孔板用 SPECT 進行采集顯像，采用低能通用準直器，采集 10 min，結果見圖 3。
圖3
不同濃度 E-選擇素與一定量 125I 標記抗體結合后的 SPECT 顯像圖
Figure3.
SPECT imaging of different concentrations of E-selectin combined with a certain amount of 125I-labeled antibody
用 SPECT 自帶軟件對圖像進行定量計算，得到每一培養孔的 125I 總計數，根據上一步計算的結果，換算成單位面積的分子的位點密度，做出位點密度和溶液濃度的標準曲線，見圖 4。
圖4
不同濃度 E-選擇素的位點密度曲線
Figure4.
Site density curve of different concentrations of E-selectin
當濃度為 0～1 μg/mL 時，濃度與位點密度近似直線關系，對這一范圍進行線性回歸，得到回歸方程 y=6 045.7x–51.166（x 為 E-選擇素濃度，y 為位點密度），兩者的相關系數（R2）達 0.997 9。
3 討論
E-選擇素是選擇素家族的一員，它是一個分子量為 107～115 kD 的細胞表面糖蛋白，在健康和病變組織中均有表達。它可以介導炎癥發生時白細胞向血管壁的趨附，在體內參與多種病理過程[5]。位點密度的測定在細胞黏附病理機制方面的研究具有重要作用，因而有必要建立精確可行的測定方法。
對于 E-選擇素位點密度的測定有不同的方法，如 Snook 等[6]曾用 E-選擇素的動力學變化，經復雜計算來測定，過程相對較繁雜。而同位素示蹤法相對直觀，靈敏度高，是一種重要的測定方法。
層析分離是放射性標記后分離純化的常用方法，目前已發展為自動化[7]。但對于許多實驗室仍用傳統的柱層析分離，分離產物用 γ 計數器進行定量分析。傳統柱層析的優點在于可根據不同分離物選擇不同填料、裝備簡單等，缺點在于步驟多、測量效率低等[8]。
本文對傳統柱層析方法進行了改進，用 SPECT 代替 γ 計數器，對樣品進行單光子發射掃描，可對樣品進行批量檢測，有利于減少誤差，同時可借助 SPECT 本身軟件半自動定量分析，明顯提高了檢測精度及檢測效率。同時使測量結果可視化，更直觀。
分子的位點密度與濃度在一定范圍內成正比[9]。本文在對 E-選擇素位點密度的實測中，證明了 E-選擇素的濃度在 0～1 μg/mL 時，與位點密度直線相關，與文獻一致。
SPECT 可以準確、快速地測定黏附表面的放射性計數，進而推算 PPFC 的位點密度。通過標記蛋白分子或其抗體，可精準測算蛋白分子的位點密度，或者與抗體結合的位點密度，對于研究細胞黏附機制、炎癥反應、血栓疾病和腫瘤轉移等是一個有力工具。
引言
在炎癥反應的過程中，由 E-選擇素介導的白細胞對內皮細胞的黏附是關鍵步驟[1]。人們常用平行平板流動腔（parallel plat flow chamber，PPFC）實驗來模擬體外循環的白細胞黏附過程[2]。因此準確測定 PPFC 表面 E-選擇素的位點密度，是在分子水平上研究 E-選擇素介導機制的關鍵。
放射性同位素 125I 標記示蹤法具有較高的靈敏度，在位點密度的測定中受到廣泛應用[3]。在測定標記率時，傳統的方法是將標記樣品上柱純化后，得到分離樣品，通常為多個試管，然后用 γ 計數器檢測每管溶液的放射性計數，得到分離曲線，以計算標記率[4]。這樣不僅耗時，而且會因放射性的衰減造成誤差，尤其對于短半衰期核素更為明顯。計算位點密度時制作標準曲線，同樣要測定不同樣品的放射性，也存在相同的問題。本研究采用單光子發射型計算機斷層（single photon emission com-puted tomography，SPECT）進行單光子發射掃描，可對樣品進行批量檢測，有利于減少誤差，同時可借助 SPECT 本身軟件，進行半自動定量分析，提高檢測精度及檢測效率。
1 材料與方法
1.1 儀器與材料
單光子發射型計算機斷層設備為美國 GE 公司的 Infinia Hawkeye 4；重組人類 E-選擇素（R&D）、抗人類 E-選擇素抗體（R&D）、聚苯乙烯 48 孔板（Corning Inc，NY）、預涂層碘化管（Pre-Coated Iodination Tube）由美國 Pierce 公司提供；125I 由中國同輻有限公司提供；Tris 緩沖液為實驗室自行配制；終止反應溶液為含 10 mg/mL 酪氨酸的 Tris 緩沖液，由實驗室自行配制；層析柱為 10 mL 玻璃柱，用 G25 葡聚糖凝膠自行填充，使用前用 20～30 mL Tris 緩沖液平衡。
1.2 方法
1.2.1 125I 標記抗人類 E-選擇素抗體 在預涂層碘化管中加入 1 mL Tris 緩沖液，潤濕后倒掉；將 100 μL 高濃度 Tris 緩沖液直接加入預涂層碘化管的底部，注意避免溶液接觸試管管壁；加入 10 μL（1.0 mCi）Na125I 溶液，讓碘化物活化 6 min，每 30 s 旋轉試管一次；將活化后的碘化物加入到 25 μg E-選擇素抗體蛋白溶液中混合，反應 9 min，每 30 s 輕輕晃動試管一次；然后加入 50 μL 終止反應溶液，混勻并孵育 5 min。
1.2.2 層析過柱 將產物加入到 10 mL 層析柱中，將 0.5 mL Tris 緩沖液加入到樣品管中，以溶解剩余蛋白，并加入到層析柱中；用 Tris 緩沖液對層析柱進行洗脫，每 0.5～0.8 mL（18 滴左右）收集一管，共收集 30 管。
1.2.3 對收集樣品的試管進行 γ 顯像 標記抗體過柱后，試管收集，將樣品順序排列在塑膠試管架上，用 SPECT 進行平面 γ 顯像，并用自帶軟件進行定量分析。SPECT 顯像采用低能通用準直器，能峰（36±3.6）keV，矩陣 128×128，放大倍數 1.0，采集時間根據放射性計數，可采集 10～30 min。
1.2.4 放射密度檢測 將柱分離得到的標記樣品，也就是第一個峰收集到的幾管溶液混合，測定總放射量和總蛋白量，計算放射量/分子數比值，為下一步將放射性定量轉化為位點密度做好準備。
1.2.5 E-選擇素位點密度測定標準曲線的制作 將 130 μL 特定濃度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL）的 E-選擇素溶液加入 48 孔聚苯乙烯板中（直徑 10.2 mm），聚苯乙烯板中的聚苯乙烯可以有效吸附 E-選擇素分子，形成不同位點密度的平面，每個濃度重復 4 次，每個樣品之間間隔至少一個空白孔，置 4℃ 冰箱中過夜，使其吸附牢固。加入 130 μL 標有 125I 的抗體分子溶液，室溫孵育 30 min，進行免疫結合。然后吸走多余抗體溶液，用 Tris 緩沖液清洗三次，最后再加入 130 μL Tris 緩沖液。用 SPECT 檢測 48 孔板中每個樣品的放射性，作蛋白量放射性標準曲線及蛋白量位點密度曲線。
1.2.6 統計方法 采用 SPECT 自帶軟件 Xerise Functional Imaging Workstation 進行半定量分析，采用 SPSS 17.0 進行標準曲線繪制及回歸方程計算。
2 結果
2.1 標記結果
標記抗體過柱后，試管收集，共 30 管，順序置于塑料試管架上，進行 SPECT 掃描。結果見圖 1。
圖1
過柱后收集管的 SPECT 顯像圖
Figure1.
SPECT imaging of the collection tube
用 SPECT 自帶軟件對每一管放射性進行定量測定，并做出直方圖，因 1～5 管為空白，故從第 5 管開始計算，見圖 2。各收集管的放射量出現兩個峰，第一峰為標有 125I 的抗體峰，第二峰為游離的 125I 峰，經計算，抗體標記率達 78%，其中第 6～10 管樣品已占抗體標記物 99%，收集并保存于 4℃ 冰箱備用。
圖2
過柱后收集管放射性計數定量直方圖
Figure2.
Quantitative histogram of radioactivity counts of the collection tube
2.2 放射性計數與位點密度的定量關系
根據 1 min 標記物的總放射性計數和標記物的質量，可計算出 1 min 每分子標記物的放射性計數頻率為 1.08×10–11，已知 48 孔聚苯乙烯板每孔直徑為 10.2 mm，所以測得每孔一定時間放射性計數，即可求得標記分子數量及其在平板的密度。
2.3 E-選擇素位點密度測定標準曲線
將制作好的 48 孔板用 SPECT 進行采集顯像，采用低能通用準直器，采集 10 min，結果見圖 3。
圖3
不同濃度 E-選擇素與一定量 125I 標記抗體結合后的 SPECT 顯像圖
Figure3.
SPECT imaging of different concentrations of E-selectin combined with a certain amount of 125I-labeled antibody
用 SPECT 自帶軟件對圖像進行定量計算，得到每一培養孔的 125I 總計數，根據上一步計算的結果，換算成單位面積的分子的位點密度，做出位點密度和溶液濃度的標準曲線，見圖 4。
圖4
不同濃度 E-選擇素的位點密度曲線
Figure4.
Site density curve of different concentrations of E-selectin
當濃度為 0～1 μg/mL 時，濃度與位點密度近似直線關系，對這一范圍進行線性回歸，得到回歸方程 y=6 045.7x–51.166（x 為 E-選擇素濃度，y 為位點密度），兩者的相關系數（R2）達 0.997 9。
3 討論
E-選擇素是選擇素家族的一員，它是一個分子量為 107～115 kD 的細胞表面糖蛋白，在健康和病變組織中均有表達。它可以介導炎癥發生時白細胞向血管壁的趨附，在體內參與多種病理過程[5]。位點密度的測定在細胞黏附病理機制方面的研究具有重要作用，因而有必要建立精確可行的測定方法。
對于 E-選擇素位點密度的測定有不同的方法，如 Snook 等[6]曾用 E-選擇素的動力學變化，經復雜計算來測定，過程相對較繁雜。而同位素示蹤法相對直觀，靈敏度高，是一種重要的測定方法。
層析分離是放射性標記后分離純化的常用方法，目前已發展為自動化[7]。但對于許多實驗室仍用傳統的柱層析分離，分離產物用 γ 計數器進行定量分析。傳統柱層析的優點在于可根據不同分離物選擇不同填料、裝備簡單等，缺點在于步驟多、測量效率低等[8]。
本文對傳統柱層析方法進行了改進，用 SPECT 代替 γ 計數器，對樣品進行單光子發射掃描，可對樣品進行批量檢測，有利于減少誤差，同時可借助 SPECT 本身軟件半自動定量分析，明顯提高了檢測精度及檢測效率。同時使測量結果可視化，更直觀。
分子的位點密度與濃度在一定范圍內成正比[9]。本文在對 E-選擇素位點密度的實測中，證明了 E-選擇素的濃度在 0～1 μg/mL 時，與位點密度直線相關，與文獻一致。
SPECT 可以準確、快速地測定黏附表面的放射性計數，進而推算 PPFC 的位點密度。通過標記蛋白分子或其抗體，可精準測算蛋白分子的位點密度，或者與抗體結合的位點密度，對于研究細胞黏附機制、炎癥反應、血栓疾病和腫瘤轉移等是一個有力工具。
