本文旨在研究中藥乳漿大戟抑制多藥耐藥人胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的作用，以及誘導細胞凋亡的作用及其作用通路。用不同濃度的乳漿大戟提取液處理人胃癌多藥耐藥 SGC7901/ADR 細胞，MTT 試驗觀察細胞增殖抑制情況，Hochest33528 染色熒光顯微鏡觀察凋亡細胞核形態并測定凋亡指數，流式細胞術測定細胞凋亡率，Transwell 法檢測細胞遷移能力和侵襲能力，分光光度法檢測 caspase-3 和 caspase-9 的酶活性表達，Western blotting 檢測細胞色素 c 的亞細胞分布。結果發現，乳漿大戟提取液對人胃癌多藥耐藥 SGC7901/ADR 細胞有明顯的增殖抑制作用，該作用具有時間和濃度依賴性。乳漿大戟提取液處理的人胃癌多藥耐藥 SGC7901/ADR 細胞，凋亡指數和凋亡率均比對照組顯著升高，并有時間和劑量依賴性；但添加了 caspase 酶抑制劑的細胞，凋亡指數沒有明顯上升。Transwell 法檢測顯示，乳漿大戟提取液處理后的 SGC7901/ADR 細胞，遷移能力和侵襲能力顯著下降。分光光度法檢測發現，乳漿大戟提取液處理后的 SGC7901/ADR 細胞中，caspase-3 和 caspase-9 表達均增加，與對照組有明顯差異。Western blotting 檢測顯示，細胞色素 c 在線粒體中的分布下降，在細胞質中的分布上升（即細胞色素 c 從線粒體向細胞質逸出）。研究表明，乳漿大戟提取液具有抑制人胃癌多藥耐藥 SGC7901/ADR 細胞增殖、抑制細胞遷移侵襲和誘導細胞凋亡的作用；乳漿大戟提取液誘導細胞凋亡的作用有細胞色素 c、caspase-9 和 caspase-3 的參與，提示內源性或線粒體凋亡通路。
引用本文： 郭賢利, 符兆英, 畢云, 鄭軍, 王磊, 賀小龍, 李飛, 雷星, 任清泉. 中藥乳漿大戟抑制人胃癌多藥耐藥細胞增殖遷移侵襲和誘導凋亡的研究. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(2): 244-251. doi: 10.7507/1001-5515.201609009 復制
引言
胃癌（gastric carcinoma）是全世界特別是東亞國家常見的一種惡性腫瘤，在我國其發病率近年分別為鄉村和城市所有惡性腫瘤發病率的第一和第二位[1-2]。早期胃癌的治療多以外科手術為主，手術后輔以化學藥物治療，而對進展期的胃癌或中晚期的胃癌，其治療措施以化學藥物治療為主[3]。但是因為胃癌細胞經常對化學治療藥物產生多藥耐藥（multiple drug resistance，MDR），從而影響了其治療效果[4-5]。所以，研究能夠拮抗或逆轉胃癌細胞多藥耐藥性的藥物對提高胃癌化學治療的療效有非常重要的意義。乳漿大戟（拉丁學名 Euphorbia esula Linn）亦稱乳漿草，是大戟科大戟屬的一種多年生草本植物，其地上部分可作為藥材，在多種中藥材書籍或文獻中有記載。文獻報道民間用乳漿大戟汁液涂抹治療皮膚疣和地上全草煎服輔助治療惡性腫瘤。研究已經發現，乳漿大戟的全草提取液能夠有效地抑制非耐藥的人胃癌細胞系 SGC7901 的增殖并誘導其發生顯著的凋亡[6]。本文研究了乳漿大戟提取物對人胃癌多藥耐藥細胞系 SGC7901/ADR 增殖、遷移和侵襲的抑制作用，并研究了乳漿大戟提取物對該細胞系的凋亡誘導作用及其基本作用途徑，旨在探尋一種可以拮抗或逆轉人胃癌多藥耐藥的天然藥物。
1 材料與方法
1.1 主要實驗材料
人胃癌多藥耐藥細胞株 SGC7901/ADR 由第四軍醫大學西京消化病醫院實驗室饋贈；乳漿大戟提取液由本實驗室自己制備；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自杭州四季青生物公司；RPMI-1640 細胞培養基和胰蛋白酶為 Gibco 公司產品；MTT 試劑、二甲基亞砜、Hochest33528 和碘化丙啶購自美國 Sigma 公司；Caspase 比色試劑盒為南京生物技術有限公司產品；細胞培養板（6 孔、96 孔）為丹麥 Cyclone 公司產品；流式細胞儀為美國 Beckman 公司產品；倒置熒光顯微鏡為日本 Olympus 公司產品；聚丙烯酰胺凝膠電泳分離與 Western blotting 電轉膜設備和酶標儀均為美國 Bio-Rad 公司產品。
1.2 細胞培養和耐藥性維持
人胃癌多藥耐藥細胞株 SGC7901/ADR 用含 100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素的 10% FBS RPMI-1640 培養液，在飽和濕度的無菌條件下 37℃ 與 5% CO2 常規培養；每隔 2 d 更換培養液 1 次；當細胞生長鋪滿瓶底接近 80% 時進行傳代。所有培養過程中均在培養液中加入終濃度為 0.1 μg/mL 的阿霉素以維持細胞的耐藥性。
1.3 細胞生長抑制實驗
乳漿大戟提取液用含 10% FBS 的 RPMI-1640 培養液配制成六個不同的濃度：20、40、80、160、320、640 μg/mL。將處于對數生長的多藥耐藥人胃癌 SGC7901/ADR 細胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化，用含 10% FBS 的 RPMI-1640 細胞培養液配成濃度為 1 × 104/mL 的單細胞懸液，接種 96 孔培養板，每孔 0.1 mL，37℃、5% CO2 孵育 24 h 后，棄去舊的培養液，將不同濃度的乳漿大戟提取液按每孔 0.2 mL 加入培養孔，每個濃度 6 個復孔，并設正常細胞對照 6 個復孔（不含乳漿大戟的 10% FBS RPMI-1640 細胞培養液），37℃、5% CO2 飽和濕度培養。培養 24 h 或 48 h 后，加入 5% MTT 溶液，20 μL/孔（終濃度 5 mg/mL），37℃、5% CO2 繼續培養 4 h，棄去各細胞孔的培養液，每孔加入 100 μL 二甲基亞砜，緩慢振蕩 10 min，充分溶解結晶，用酶標儀在 570 nm 波長處讀取吸光值（A 值）。用只含 10% FBS RPMI-1640 培養液的孔調零，計算 6 個復孔的算術平均值，并按以下公式計算細胞生長抑制率：抑制率 =（未加藥細胞對照孔的平均 A 值 — 乳漿大戟處理孔的平均 A 值）/未加藥細胞對照孔的平均 A 值 × 100%。
1.4 凋亡核形態觀察和凋亡指數測定
將人胃癌多藥耐藥細胞 SGC7901/ADR 在 10% FBS RPMI-1640 培養液中 37℃、5% CO2 培養至對數生長期，用 0.25% 胰蛋白酶消化細胞后配成濃度 1 × 104/mL 的單細胞懸液，將細胞接種于 6 孔板，每孔接種 2 mL，5% CO2、37℃ 培養 24 h，棄去舊的培養液，分成 3 組進行試驗：乳漿大戟組加入用 10% FBS RPMI-1640 細胞培養基稀釋的 80 μg/mL 的乳漿大戟提取液，caspase 酶抑制組在乳漿大戟組的基礎上加入終濃度為 15 μmol/L 的 Z-VAD-FMK，對照組只加 10% FBS RPMI-1640 細胞培養液，每孔均加 4 mL，5% CO2、37℃ 飽和濕度培養。在第 24、48、72 小時三個時間點收集細胞，以 4% 甲醛溶液固定，用 Hochest33528 染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞核形態并計數凋亡細胞數。細胞核縮小、濃染、染色質出現凝聚（染色不均勻）者為凋亡細胞。取 5 個隨機視野，每個視野總共計數 400 個細胞并計數其中的凋亡細胞數。按公式計算細胞凋亡指數：細胞凋亡指數 =（凋亡細胞數/細胞總數）× 100%。
1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率
對數生長期的人胃癌多藥耐藥細胞 SGC7901/ADR，以 0.25% 胰蛋白酶消化，用含 10% FBS 的 RPMI-1640 細胞培養液配制成 1 × 104/mL 的單細胞懸液，接種于 6 孔板，每孔 2 mL，37℃、5% CO2 培養 24 h，觀察細胞生長良好，棄去原培養液，加入用 10% FBS RPMI-1640 細胞培養液稀釋的不同濃度（40、80、160 μg/mL）的乳漿大戟提取液，每孔加 4 mL，并以不含乳漿大戟的 10% FBS RPMI-1640 培養液作對照組。繼續培養 24、48 和 72 h 后，每孔分別收集 1 × 106個細胞，以 1 000 r/min 離心 7 min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌 2 次。加入在 4℃ 預冷的 500 μL 70% 乙醇，4℃ 下固定 1 h，1 000 r/min 離心 7 min，棄去上清液，再用 PBS 洗滌 2 次后用 3 mL PBS 重懸細胞。每管加碘化丙啶溶液 1 mL，充分混勻后室溫下避光靜置 30 min，用流式細胞儀進行檢測。每組 3 個樣本，每個樣本檢測 10 000 個細胞，取平均值計算細胞凋亡率：細胞凋亡率 = 凋亡細胞數/（凋亡細胞數十非凋亡細胞數）× 100%。
1.6 Transwell 法檢測細胞遷移能力和侵襲能力
收集不同濃度（40、80、160 μg/mL）的乳漿大戟稀釋液處理 24 h 后的人胃癌多藥耐藥 SGC7901/ADR 細胞，用不含血清的 RPMI-1640 細胞培養基配置成 1 × 105/mL 的細胞懸液，同樣方法配制未用藥物處理的細胞作為對照。將細胞懸液 100 μL 加入 Transwell 的上室，并向 Transwell 的下室加入 600 μL 含 10% FBS 的 RPMI-1640 細胞培養基。37℃、5% CO2 飽和濕度下培養 24 h 后取出 Transwell，用棉簽輕輕擦去上室中的細胞，遷移至下室的細胞用 4% 多聚甲醛溶液室溫固定 30 min，加 0.1% 結晶紫染液 2 mL 染色 10 min。在 200 倍光學顯微鏡下隨機選 5 個視野，計數每個視野的細胞數目（遷移細胞數），取平均值比較乳漿大戟稀釋液對 SGC7901/ADR 細胞遷移的抑制情況。
將 Matrigel 膠與無血清 RPMI-1640 培養基按 1∶4 稀釋并混勻，取 50 μL 加入 Transwell 小室的膜上，置 37℃ 培養箱中 3 h 使其固態化。按上述方法準備細胞和對照，在有 Matrigel 膠的 Transwell 上室中加入細胞懸液 200 μL，并向下室加入 600 μL 含 10% FBS 的 RPMI-1640 培養基，37℃、5% CO2、飽和濕度培養 48 h。取出 Transwell，用棉簽拭去上室中的 Matrigel 膠和細胞，侵襲入下室細胞用 4% 多聚甲醛溶液室溫固定 30 min，加 0.1% 結晶紫染液 2 mL 染色 10 min。在 200 倍光學顯微鏡下隨機選取 5 個視野，計數每個視野的細胞數目（侵襲細胞數），取平均值比較乳漿大戟稀釋液對 SGC7901/ADR 細胞侵襲的抑制情況。
1.7 分光光度法檢測 caspase-3 和 caspase-9 活性
人胃癌多藥耐藥 SGC7901/ADR 細胞在 37℃、5% CO2 的飽和濕度條件下常規培養，細胞增殖至對數生長期時以 80 mg/L 乳漿大戟提取液進行處理，48 h 后收集細胞，用預冷的 PBS 洗 2 遍，去掉上清，加預冷的細胞裂解緩沖液（Caspase 比色試劑盒，南京生物技術有限公司），每 2 × 106 細胞加 50 μL，置冰浴 30 min，期間輕搖 3 次，每次 10 s。裂解產物以 12 000 r/min、4℃ 離心 20 min，取上清放入新的離心管，并置冰上。按照 Caspase 比色試劑盒說明書立即測定 caspase-3 和 caspase-9 活性。酶標儀讀
= 405 nm 處的 A 值。以未用乳漿大戟處理的 SGC7901/ADR 細胞做陰性對照。
1.8 Western blotting 檢測細胞色素 c 的亞細胞分布情況
收集用 80 μg/mL 的乳漿大戟稀釋液處理 24 h 后的人胃癌多藥耐藥 SGC7901/ADR 細胞，用預冷的 PBS，1 200 r/min、7 min 離心洗 3 遍，棄上清，用預冷的細胞漿提取緩沖液重懸細胞沉淀，用超聲波破碎儀裂解細胞，1 500 r/min 離心 10 min，收集上清，10 000 r/min、4℃ 離心 30 min，收集上清液（為細胞漿成分，不含細胞器和線粒體），并用線粒體提取緩沖液重懸沉淀（含線粒體），渦旋混勻器混勻 10 s。用 BCA 法對樣品進行蛋白定量，上樣做 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用 5% 脫脂奶粉封閉 1 h，PBS 漂洗 3 次，加一抗（兔抗人細胞色素 c 單克隆抗體），4℃ 孵育過夜，PBS 漂洗 3 次，加二抗（HPR 標記的羊抗兔抗體）室溫孵育 1 h，洗膜后加入顯色劑顯色觀察條帶。以電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion channels，VDAC）蛋白作為線粒體蛋白的內參照，以 β-actin 作為細胞質蛋白的內參照，以未用乳漿大戟稀釋液處理的 SGC7901/ADR 細胞做陰性對照。
1.9 統計學分析
數據以均數±標準差形式表示，用 SPSS19.0 統計軟件做統計學分析，兩組數據間的比較用 t 檢驗，多組數據比較用單因素方差分析，率的比較用 χ2 檢驗。P < 0.05 表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 MTT 實驗顯示乳漿大戟對細胞的增殖有抑制作用
不同稀釋度的乳漿大戟提取液處理人胃癌多藥耐藥細胞 SGC7901/ADR 后，MTT 檢測結果顯示，乳漿大戟稀釋液明顯地抑制了多藥耐藥人胃癌 SGC7901/ADR 細胞的增殖活性，與不加藥的對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）；而且隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制作用呈現逐漸增強的趨勢，并有統計學意義（ P < 0.05）。具體結果見 表 1。
表1
乳漿大戟對 SGC7901/ADR 細胞增殖的抑制作用（n = 6）
Table1.
Inhibition of SGC7901/ADR cell proliferation by Euphorbia esula extract (n = 6)
2.2 乳漿大戟處理細胞后熒光顯微鏡檢測顯示凋亡指數升高
乳漿大戟稀釋液處理后的人胃癌多藥耐藥細胞 SGC7901/ADR，經 Hochest33528 染色后在熒光顯微鏡下觀察，可見細胞核體積縮小、形狀不規則、熒光染色增強和染色不均勻（染色體凝聚化）等細胞凋亡的形態學改變。凋亡細胞計數和凋亡指數計算的結果顯示，乳漿大戟處理后的 SGC7901/ADR 細胞凋亡指數顯著升高，與對照組比較差異有統計學意義（P < 0.01）；但是，在乳漿大戟處理同時加了 caspase 酶抑制劑的細胞（caspase 抑制組），凋亡指數上升不明顯，與對照組比較差異沒有統計學意義（ P > 0.05）。具體結果見 表 2。
表2
人胃癌多藥耐藥細胞 SGC7901/ADR 經乳漿大戟處理后的凋亡指數
Table2.
The apoptotic index of SGC7901/ADR cells treated by Euphorbia esula extract
2.3 流式細胞術檢測顯示乳漿大戟處理后細胞凋亡率上升
人胃癌多藥耐藥細胞 SGC7901/ADR 經梯度稀釋的乳漿大戟提取液處理 24、48、72 h 后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，可以看到各藥物濃度組 SGC7901/ADR 細胞的凋亡率顯著上升，與未加藥的對照組比較有明顯差異（P < 0.01），并可見細胞凋亡率隨藥物濃度增加和作用時間延長而升高，且有統計學意義（ P < 0.05）。具體結果見 表 3。
表3
人胃癌多藥耐藥細胞 SGC7901/ADR 經乳漿大戟處理后 的凋亡率（n = 3）
Table3.
The apoptotic rate of SGC7901/ADR cells treated by Euphorbia esula extract (n = 3)
2.4 Transwell 法檢測顯示乳漿大戟可抑制細胞遷移和侵襲
Transwell 法檢測遷移能力的結果顯示，乳漿大戟提取液處理后的人胃癌多藥耐藥 SGC7901/ADR 細胞的遷移能力顯著下降，與對照組比較差異有統計學意義（P < 0.05）；而且，隨著藥物濃度的增加抑制效果更加明顯，差異亦有統計學意義（ P < 0.05）。具體結果見 圖 1、圖 2。
Transwell 法檢測細胞侵襲能力的結果顯示，乳漿大戟提取液能抑制人胃癌多藥耐藥 SGC7901/ADR 細胞的侵襲能力，不同濃度的乳漿大戟稀釋液與對照組比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；而且，該抑制作用呈現劑量依賴性，不同濃度乳漿大戟組間對細胞侵襲力的抑制效果有明顯差異，且有統計學意義（ P < 0.05）。具體結果見 圖 1、圖 2。
圖1
乳漿大戟處理 SGC7901/ADR 后的細胞遷移和細胞侵襲（200 ×）
Figure1.
SGC7901/ADR cell migration and invasion after Euphorbia esula extract treatment (200 ×)
圖2
乳漿大戟處理 SGC7901/ADR 后的細胞遷移數和細胞侵襲數
*乳漿大戟提取液各濃度組與對照組比較，
*each testing group compared to the control group,
2.5 分光光度法檢測顯示乳漿大戟處理后細胞中 caspase 酶活性升高
分光光度法 caspase 活力測定結果顯示：以 80 mg/L 的乳漿大戟提取液處理人胃癌多藥耐藥 SGC7901/ADR 細胞后，表示 caspase-3 酶活力的 A 值在對照組和藥物組分別為 0.275 和 0.782，二者差異有統計學意義（P < 0.01）；表示 caspase-9 酶活力的 A 值在對照組和藥物組分別為 0.166 和 0.327，二者差異亦有統計學意義（ P < 0.01）。具體結果見 圖 3。說明乳漿大戟提取液處理 SGC7901/ADR 細胞后，參與內源性凋亡通路的 caspase-9 以及細胞中的凋亡執行蛋白 caspase-3 被活化。
圖3
乳漿大戟提取液處理后 SGC7901/ADR 細胞中 caspase-3 和 caspase-9 的相對表達活性
*與對照組比較，
*compared to the control group,
2.6 Western blot 顯示乳漿大戟處理后細胞色素 c 從線粒體向細胞質逸出
Western blotting 檢測分析發現，未用乳漿大戟提取液處理的 SGC7901/ADR 細胞對照，細胞色素 c 主要分布于線粒體內，細胞質內含量很少。經 80 μg/mL 的乳漿大戟提取液處理 24 h 后的 SGC7901/ADR 細胞，線粒體內細胞色素 c 含量明顯減少，細胞質中的細胞色素 c 含量明顯增加，表示經乳漿大戟提取液處理后，SGC7901/ADR 細胞中的細胞色素 c 從線粒體逸出到細胞質。具體結果見圖 4。
圖4
乳漿大戟提取液處理后 SGC7901/ADR 細胞中細胞色素 c 亞細胞分布改變
Figure4.
The sub-cellular distribution of cytochrome c in Euphorbia esula extract treated-SGC7901/ADR cells
3 討論
腫瘤的發生是由于各種致瘤因素的作用導致細胞的正常調控機制發生異常使細胞增殖和細胞凋亡失去平衡的結果；誘導細胞凋亡并抑制其增殖，是多年來國際上對惡性腫瘤預防和治療的一個非常重要的研究領域。在我國，從中藥材中尋找選擇能夠抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡的有效或活性成分，是多年來抗腫瘤研究的一個重點[7-8]。特別是這幾年來因中藥研究獲得了國際性的大獎，對中藥抗癌的研究更加受到重視。
腫瘤多藥耐藥這個術語指的是腫瘤一旦對一種化學治療藥物產生了耐藥性，就會對許多種化學結構不同和作用機制不同的化學治療藥物出現交叉性耐藥的一種現象。腫瘤形成多藥耐藥的方式有多種，包括細胞膜上 ABC 轉運蛋白超家族的 P-糖蛋白（亦稱多藥耐藥蛋白 1）表達上調使腫瘤細胞對進入細胞內的藥物向胞外的排出增加、腫瘤細胞抑制或逃避細胞凋亡（比如影響 bcl-2 和 Bax 等的表達）、藥物在腫瘤細胞內被氧化降解或滅活的速度增快，以及腫瘤細胞通過改變代謝而增強 DNA 修復能力或減低藥物的毒性等[9-14]。多年來，對腫瘤多藥耐藥的研究在國內外一直受到重視，但這一問題至今仍未能夠解決。逆轉或拮抗腫瘤多藥耐藥目前仍然是國際上腫瘤治療研究的重點和熱點之一；而中藥因毒副作用比較小和作用靶點比較多等特點，在逆轉或拮抗腫瘤多藥耐藥方面具有一定甚至是明顯的優勢[15-17]。
乳漿大戟在中國和歐洲國家均有分布，在我國它是大戟屬植物分布最廣泛的一個種。乳漿大戟的變異幅度比較大，常因生長環境的不同而產生多種多樣的變異，包括植株大小、葉型和苞葉形狀等的明顯不同。和乳漿大戟非常相似的一種植物叫貓眼草，這兩種植物在外觀上很難區分，最新出版的《中國植物志》將二者合并為一種植物并保留了乳漿大戟這個名稱[18]。在中藥材書籍和文獻中乳漿大戟被描述為歸胃、肺等經脈，味苦而性寒涼，有微毒，有散結、消腫以及拔毒等作用[19]。近年來國內多項研究顯示，乳漿大戟和大戟科的另外一些種的植物提取物具有很好的誘導多種惡性腫瘤細胞凋亡和抑制多種惡性腫瘤細胞增殖的作用[20-29]。
本文探討了乳漿大戟全草提取物對多藥耐藥人胃癌 SGC7901/ADR 細胞系增殖、遷移以及侵襲的抑制現象，研究了乳漿大戟全草提取物對 SGC7901/ADR 細胞凋亡的誘導作用及其基本機制。具體包括：用 MTT 研究了乳漿大戟對 SGC7901/ADR 細胞系的增殖抑制作用，用 Hochest33528 染色熒光顯微鏡觀察研究了乳漿大戟處理 SGC7901/ADR 細胞后細胞核形態的改變及其對細胞凋亡指數的影響（同時設 caspase 酶抑制劑對照和不加藥細胞對照），用流式細胞儀分析了乳漿大戟處理 SGC7901/ADR 細胞后細胞凋亡率的改變，用 Transwell 法研究了乳漿大戟對 SGC7901/ADR 細胞的遷移和侵襲能力的抑制作用，用分光光度法研究了 SGC7901/ADR 細胞內 caspase-3 和 caspase-9 酶活性升高的情況，用 Western blotting 檢測了 SGC7901/ADR 細胞內細胞色素 c 在線粒體和細胞質的分布情況。結果發現，乳漿大戟對多藥耐藥的 SGC7901/ADR 細胞具有明顯的抑制細胞增殖、抑制細胞遷移侵襲和誘導細胞凋亡的作用；經乳漿大戟作用后的 SGC7901/ADR 細胞，caspase-3 和 caspase-9 兩種凋亡蛋白活性升高，但在乳漿大戟處理細胞的同時如加入 caspase 酶抑制劑，則細胞凋亡指數沒有明顯上升；乳漿大戟作用后的 SGC7901/ADR 細胞，細胞色素 c 部分地從線粒體逸出而分布于細胞質。以上結果提示，乳漿大戟誘導 SGC7901/ADR 細胞凋亡的機制可能屬于內源性或線粒體途徑。這項研究為利用中藥乳漿大戟對抗或逆轉胃癌多藥耐藥性從而進行胃癌或其他癌癥的輔助治療奠定了一定的基礎。
引言
胃癌（gastric carcinoma）是全世界特別是東亞國家常見的一種惡性腫瘤，在我國其發病率近年分別為鄉村和城市所有惡性腫瘤發病率的第一和第二位[1-2]。早期胃癌的治療多以外科手術為主，手術后輔以化學藥物治療，而對進展期的胃癌或中晚期的胃癌，其治療措施以化學藥物治療為主[3]。但是因為胃癌細胞經常對化學治療藥物產生多藥耐藥（multiple drug resistance，MDR），從而影響了其治療效果[4-5]。所以，研究能夠拮抗或逆轉胃癌細胞多藥耐藥性的藥物對提高胃癌化學治療的療效有非常重要的意義。乳漿大戟（拉丁學名 Euphorbia esula Linn）亦稱乳漿草，是大戟科大戟屬的一種多年生草本植物，其地上部分可作為藥材，在多種中藥材書籍或文獻中有記載。文獻報道民間用乳漿大戟汁液涂抹治療皮膚疣和地上全草煎服輔助治療惡性腫瘤。研究已經發現，乳漿大戟的全草提取液能夠有效地抑制非耐藥的人胃癌細胞系 SGC7901 的增殖并誘導其發生顯著的凋亡[6]。本文研究了乳漿大戟提取物對人胃癌多藥耐藥細胞系 SGC7901/ADR 增殖、遷移和侵襲的抑制作用，并研究了乳漿大戟提取物對該細胞系的凋亡誘導作用及其基本作用途徑，旨在探尋一種可以拮抗或逆轉人胃癌多藥耐藥的天然藥物。
1 材料與方法
1.1 主要實驗材料
人胃癌多藥耐藥細胞株 SGC7901/ADR 由第四軍醫大學西京消化病醫院實驗室饋贈；乳漿大戟提取液由本實驗室自己制備；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自杭州四季青生物公司；RPMI-1640 細胞培養基和胰蛋白酶為 Gibco 公司產品；MTT 試劑、二甲基亞砜、Hochest33528 和碘化丙啶購自美國 Sigma 公司；Caspase 比色試劑盒為南京生物技術有限公司產品；細胞培養板（6 孔、96 孔）為丹麥 Cyclone 公司產品；流式細胞儀為美國 Beckman 公司產品；倒置熒光顯微鏡為日本 Olympus 公司產品；聚丙烯酰胺凝膠電泳分離與 Western blotting 電轉膜設備和酶標儀均為美國 Bio-Rad 公司產品。
1.2 細胞培養和耐藥性維持
人胃癌多藥耐藥細胞株 SGC7901/ADR 用含 100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素的 10% FBS RPMI-1640 培養液，在飽和濕度的無菌條件下 37℃ 與 5% CO2 常規培養；每隔 2 d 更換培養液 1 次；當細胞生長鋪滿瓶底接近 80% 時進行傳代。所有培養過程中均在培養液中加入終濃度為 0.1 μg/mL 的阿霉素以維持細胞的耐藥性。
1.3 細胞生長抑制實驗
乳漿大戟提取液用含 10% FBS 的 RPMI-1640 培養液配制成六個不同的濃度：20、40、80、160、320、640 μg/mL。將處于對數生長的多藥耐藥人胃癌 SGC7901/ADR 細胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化，用含 10% FBS 的 RPMI-1640 細胞培養液配成濃度為 1 × 104/mL 的單細胞懸液，接種 96 孔培養板，每孔 0.1 mL，37℃、5% CO2 孵育 24 h 后，棄去舊的培養液，將不同濃度的乳漿大戟提取液按每孔 0.2 mL 加入培養孔，每個濃度 6 個復孔，并設正常細胞對照 6 個復孔（不含乳漿大戟的 10% FBS RPMI-1640 細胞培養液），37℃、5% CO2 飽和濕度培養。培養 24 h 或 48 h 后，加入 5% MTT 溶液，20 μL/孔（終濃度 5 mg/mL），37℃、5% CO2 繼續培養 4 h，棄去各細胞孔的培養液，每孔加入 100 μL 二甲基亞砜，緩慢振蕩 10 min，充分溶解結晶，用酶標儀在 570 nm 波長處讀取吸光值（A 值）。用只含 10% FBS RPMI-1640 培養液的孔調零，計算 6 個復孔的算術平均值，并按以下公式計算細胞生長抑制率：抑制率 =（未加藥細胞對照孔的平均 A 值 — 乳漿大戟處理孔的平均 A 值）/未加藥細胞對照孔的平均 A 值 × 100%。
1.4 凋亡核形態觀察和凋亡指數測定
將人胃癌多藥耐藥細胞 SGC7901/ADR 在 10% FBS RPMI-1640 培養液中 37℃、5% CO2 培養至對數生長期，用 0.25% 胰蛋白酶消化細胞后配成濃度 1 × 104/mL 的單細胞懸液，將細胞接種于 6 孔板，每孔接種 2 mL，5% CO2、37℃ 培養 24 h，棄去舊的培養液，分成 3 組進行試驗：乳漿大戟組加入用 10% FBS RPMI-1640 細胞培養基稀釋的 80 μg/mL 的乳漿大戟提取液，caspase 酶抑制組在乳漿大戟組的基礎上加入終濃度為 15 μmol/L 的 Z-VAD-FMK，對照組只加 10% FBS RPMI-1640 細胞培養液，每孔均加 4 mL，5% CO2、37℃ 飽和濕度培養。在第 24、48、72 小時三個時間點收集細胞，以 4% 甲醛溶液固定，用 Hochest33528 染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞核形態并計數凋亡細胞數。細胞核縮小、濃染、染色質出現凝聚（染色不均勻）者為凋亡細胞。取 5 個隨機視野，每個視野總共計數 400 個細胞并計數其中的凋亡細胞數。按公式計算細胞凋亡指數：細胞凋亡指數 =（凋亡細胞數/細胞總數）× 100%。
1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率
對數生長期的人胃癌多藥耐藥細胞 SGC7901/ADR，以 0.25% 胰蛋白酶消化，用含 10% FBS 的 RPMI-1640 細胞培養液配制成 1 × 104/mL 的單細胞懸液，接種于 6 孔板，每孔 2 mL，37℃、5% CO2 培養 24 h，觀察細胞生長良好，棄去原培養液，加入用 10% FBS RPMI-1640 細胞培養液稀釋的不同濃度（40、80、160 μg/mL）的乳漿大戟提取液，每孔加 4 mL，并以不含乳漿大戟的 10% FBS RPMI-1640 培養液作對照組。繼續培養 24、48 和 72 h 后，每孔分別收集 1 × 106個細胞，以 1 000 r/min 離心 7 min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌 2 次。加入在 4℃ 預冷的 500 μL 70% 乙醇，4℃ 下固定 1 h，1 000 r/min 離心 7 min，棄去上清液，再用 PBS 洗滌 2 次后用 3 mL PBS 重懸細胞。每管加碘化丙啶溶液 1 mL，充分混勻后室溫下避光靜置 30 min，用流式細胞儀進行檢測。每組 3 個樣本，每個樣本檢測 10 000 個細胞，取平均值計算細胞凋亡率：細胞凋亡率 = 凋亡細胞數/（凋亡細胞數十非凋亡細胞數）× 100%。
1.6 Transwell 法檢測細胞遷移能力和侵襲能力
收集不同濃度（40、80、160 μg/mL）的乳漿大戟稀釋液處理 24 h 后的人胃癌多藥耐藥 SGC7901/ADR 細胞，用不含血清的 RPMI-1640 細胞培養基配置成 1 × 105/mL 的細胞懸液，同樣方法配制未用藥物處理的細胞作為對照。將細胞懸液 100 μL 加入 Transwell 的上室，并向 Transwell 的下室加入 600 μL 含 10% FBS 的 RPMI-1640 細胞培養基。37℃、5% CO2 飽和濕度下培養 24 h 后取出 Transwell，用棉簽輕輕擦去上室中的細胞，遷移至下室的細胞用 4% 多聚甲醛溶液室溫固定 30 min，加 0.1% 結晶紫染液 2 mL 染色 10 min。在 200 倍光學顯微鏡下隨機選 5 個視野，計數每個視野的細胞數目（遷移細胞數），取平均值比較乳漿大戟稀釋液對 SGC7901/ADR 細胞遷移的抑制情況。
將 Matrigel 膠與無血清 RPMI-1640 培養基按 1∶4 稀釋并混勻，取 50 μL 加入 Transwell 小室的膜上，置 37℃ 培養箱中 3 h 使其固態化。按上述方法準備細胞和對照，在有 Matrigel 膠的 Transwell 上室中加入細胞懸液 200 μL，并向下室加入 600 μL 含 10% FBS 的 RPMI-1640 培養基，37℃、5% CO2、飽和濕度培養 48 h。取出 Transwell，用棉簽拭去上室中的 Matrigel 膠和細胞，侵襲入下室細胞用 4% 多聚甲醛溶液室溫固定 30 min，加 0.1% 結晶紫染液 2 mL 染色 10 min。在 200 倍光學顯微鏡下隨機選取 5 個視野，計數每個視野的細胞數目（侵襲細胞數），取平均值比較乳漿大戟稀釋液對 SGC7901/ADR 細胞侵襲的抑制情況。
1.7 分光光度法檢測 caspase-3 和 caspase-9 活性
人胃癌多藥耐藥 SGC7901/ADR 細胞在 37℃、5% CO2 的飽和濕度條件下常規培養，細胞增殖至對數生長期時以 80 mg/L 乳漿大戟提取液進行處理，48 h 后收集細胞，用預冷的 PBS 洗 2 遍，去掉上清，加預冷的細胞裂解緩沖液（Caspase 比色試劑盒，南京生物技術有限公司），每 2 × 106 細胞加 50 μL，置冰浴 30 min，期間輕搖 3 次，每次 10 s。裂解產物以 12 000 r/min、4℃ 離心 20 min，取上清放入新的離心管，并置冰上。按照 Caspase 比色試劑盒說明書立即測定 caspase-3 和 caspase-9 活性。酶標儀讀
= 405 nm 處的 A 值。以未用乳漿大戟處理的 SGC7901/ADR 細胞做陰性對照。
1.8 Western blotting 檢測細胞色素 c 的亞細胞分布情況
收集用 80 μg/mL 的乳漿大戟稀釋液處理 24 h 后的人胃癌多藥耐藥 SGC7901/ADR 細胞，用預冷的 PBS，1 200 r/min、7 min 離心洗 3 遍，棄上清，用預冷的細胞漿提取緩沖液重懸細胞沉淀，用超聲波破碎儀裂解細胞，1 500 r/min 離心 10 min，收集上清，10 000 r/min、4℃ 離心 30 min，收集上清液（為細胞漿成分，不含細胞器和線粒體），并用線粒體提取緩沖液重懸沉淀（含線粒體），渦旋混勻器混勻 10 s。用 BCA 法對樣品進行蛋白定量，上樣做 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用 5% 脫脂奶粉封閉 1 h，PBS 漂洗 3 次，加一抗（兔抗人細胞色素 c 單克隆抗體），4℃ 孵育過夜，PBS 漂洗 3 次，加二抗（HPR 標記的羊抗兔抗體）室溫孵育 1 h，洗膜后加入顯色劑顯色觀察條帶。以電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion channels，VDAC）蛋白作為線粒體蛋白的內參照，以 β-actin 作為細胞質蛋白的內參照，以未用乳漿大戟稀釋液處理的 SGC7901/ADR 細胞做陰性對照。
1.9 統計學分析
數據以均數±標準差形式表示，用 SPSS19.0 統計軟件做統計學分析，兩組數據間的比較用 t 檢驗，多組數據比較用單因素方差分析，率的比較用 χ2 檢驗。P < 0.05 表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 MTT 實驗顯示乳漿大戟對細胞的增殖有抑制作用
不同稀釋度的乳漿大戟提取液處理人胃癌多藥耐藥細胞 SGC7901/ADR 后，MTT 檢測結果顯示，乳漿大戟稀釋液明顯地抑制了多藥耐藥人胃癌 SGC7901/ADR 細胞的增殖活性，與不加藥的對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）；而且隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制作用呈現逐漸增強的趨勢，并有統計學意義（ P < 0.05）。具體結果見 表 1。
表1
乳漿大戟對 SGC7901/ADR 細胞增殖的抑制作用（n = 6）
Table1.
Inhibition of SGC7901/ADR cell proliferation by Euphorbia esula extract (n = 6)
2.2 乳漿大戟處理細胞后熒光顯微鏡檢測顯示凋亡指數升高
乳漿大戟稀釋液處理后的人胃癌多藥耐藥細胞 SGC7901/ADR，經 Hochest33528 染色后在熒光顯微鏡下觀察，可見細胞核體積縮小、形狀不規則、熒光染色增強和染色不均勻（染色體凝聚化）等細胞凋亡的形態學改變。凋亡細胞計數和凋亡指數計算的結果顯示，乳漿大戟處理后的 SGC7901/ADR 細胞凋亡指數顯著升高，與對照組比較差異有統計學意義（P < 0.01）；但是，在乳漿大戟處理同時加了 caspase 酶抑制劑的細胞（caspase 抑制組），凋亡指數上升不明顯，與對照組比較差異沒有統計學意義（ P > 0.05）。具體結果見 表 2。
表2
人胃癌多藥耐藥細胞 SGC7901/ADR 經乳漿大戟處理后的凋亡指數
Table2.
The apoptotic index of SGC7901/ADR cells treated by Euphorbia esula extract
2.3 流式細胞術檢測顯示乳漿大戟處理后細胞凋亡率上升
人胃癌多藥耐藥細胞 SGC7901/ADR 經梯度稀釋的乳漿大戟提取液處理 24、48、72 h 后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，可以看到各藥物濃度組 SGC7901/ADR 細胞的凋亡率顯著上升，與未加藥的對照組比較有明顯差異（P < 0.01），并可見細胞凋亡率隨藥物濃度增加和作用時間延長而升高，且有統計學意義（ P < 0.05）。具體結果見 表 3。
表3
人胃癌多藥耐藥細胞 SGC7901/ADR 經乳漿大戟處理后 的凋亡率（n = 3）
Table3.
The apoptotic rate of SGC7901/ADR cells treated by Euphorbia esula extract (n = 3)
2.4 Transwell 法檢測顯示乳漿大戟可抑制細胞遷移和侵襲
Transwell 法檢測遷移能力的結果顯示，乳漿大戟提取液處理后的人胃癌多藥耐藥 SGC7901/ADR 細胞的遷移能力顯著下降，與對照組比較差異有統計學意義（P < 0.05）；而且，隨著藥物濃度的增加抑制效果更加明顯，差異亦有統計學意義（ P < 0.05）。具體結果見 圖 1、圖 2。
Transwell 法檢測細胞侵襲能力的結果顯示，乳漿大戟提取液能抑制人胃癌多藥耐藥 SGC7901/ADR 細胞的侵襲能力，不同濃度的乳漿大戟稀釋液與對照組比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；而且，該抑制作用呈現劑量依賴性，不同濃度乳漿大戟組間對細胞侵襲力的抑制效果有明顯差異，且有統計學意義（ P < 0.05）。具體結果見 圖 1、圖 2。
圖1
乳漿大戟處理 SGC7901/ADR 后的細胞遷移和細胞侵襲（200 ×）
Figure1.
SGC7901/ADR cell migration and invasion after Euphorbia esula extract treatment (200 ×)
圖2
乳漿大戟處理 SGC7901/ADR 后的細胞遷移數和細胞侵襲數
*乳漿大戟提取液各濃度組與對照組比較，
*each testing group compared to the control group,
2.5 分光光度法檢測顯示乳漿大戟處理后細胞中 caspase 酶活性升高
分光光度法 caspase 活力測定結果顯示：以 80 mg/L 的乳漿大戟提取液處理人胃癌多藥耐藥 SGC7901/ADR 細胞后，表示 caspase-3 酶活力的 A 值在對照組和藥物組分別為 0.275 和 0.782，二者差異有統計學意義（P < 0.01）；表示 caspase-9 酶活力的 A 值在對照組和藥物組分別為 0.166 和 0.327，二者差異亦有統計學意義（ P < 0.01）。具體結果見 圖 3。說明乳漿大戟提取液處理 SGC7901/ADR 細胞后，參與內源性凋亡通路的 caspase-9 以及細胞中的凋亡執行蛋白 caspase-3 被活化。
圖3
乳漿大戟提取液處理后 SGC7901/ADR 細胞中 caspase-3 和 caspase-9 的相對表達活性
*與對照組比較，
*compared to the control group,
2.6 Western blot 顯示乳漿大戟處理后細胞色素 c 從線粒體向細胞質逸出
Western blotting 檢測分析發現，未用乳漿大戟提取液處理的 SGC7901/ADR 細胞對照，細胞色素 c 主要分布于線粒體內，細胞質內含量很少。經 80 μg/mL 的乳漿大戟提取液處理 24 h 后的 SGC7901/ADR 細胞，線粒體內細胞色素 c 含量明顯減少，細胞質中的細胞色素 c 含量明顯增加，表示經乳漿大戟提取液處理后，SGC7901/ADR 細胞中的細胞色素 c 從線粒體逸出到細胞質。具體結果見圖 4。
圖4
乳漿大戟提取液處理后 SGC7901/ADR 細胞中細胞色素 c 亞細胞分布改變
Figure4.
The sub-cellular distribution of cytochrome c in Euphorbia esula extract treated-SGC7901/ADR cells
3 討論
腫瘤的發生是由于各種致瘤因素的作用導致細胞的正常調控機制發生異常使細胞增殖和細胞凋亡失去平衡的結果；誘導細胞凋亡并抑制其增殖，是多年來國際上對惡性腫瘤預防和治療的一個非常重要的研究領域。在我國，從中藥材中尋找選擇能夠抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡的有效或活性成分，是多年來抗腫瘤研究的一個重點[7-8]。特別是這幾年來因中藥研究獲得了國際性的大獎，對中藥抗癌的研究更加受到重視。
腫瘤多藥耐藥這個術語指的是腫瘤一旦對一種化學治療藥物產生了耐藥性，就會對許多種化學結構不同和作用機制不同的化學治療藥物出現交叉性耐藥的一種現象。腫瘤形成多藥耐藥的方式有多種，包括細胞膜上 ABC 轉運蛋白超家族的 P-糖蛋白（亦稱多藥耐藥蛋白 1）表達上調使腫瘤細胞對進入細胞內的藥物向胞外的排出增加、腫瘤細胞抑制或逃避細胞凋亡（比如影響 bcl-2 和 Bax 等的表達）、藥物在腫瘤細胞內被氧化降解或滅活的速度增快，以及腫瘤細胞通過改變代謝而增強 DNA 修復能力或減低藥物的毒性等[9-14]。多年來，對腫瘤多藥耐藥的研究在國內外一直受到重視，但這一問題至今仍未能夠解決。逆轉或拮抗腫瘤多藥耐藥目前仍然是國際上腫瘤治療研究的重點和熱點之一；而中藥因毒副作用比較小和作用靶點比較多等特點，在逆轉或拮抗腫瘤多藥耐藥方面具有一定甚至是明顯的優勢[15-17]。
乳漿大戟在中國和歐洲國家均有分布，在我國它是大戟屬植物分布最廣泛的一個種。乳漿大戟的變異幅度比較大，常因生長環境的不同而產生多種多樣的變異，包括植株大小、葉型和苞葉形狀等的明顯不同。和乳漿大戟非常相似的一種植物叫貓眼草，這兩種植物在外觀上很難區分，最新出版的《中國植物志》將二者合并為一種植物并保留了乳漿大戟這個名稱[18]。在中藥材書籍和文獻中乳漿大戟被描述為歸胃、肺等經脈，味苦而性寒涼，有微毒，有散結、消腫以及拔毒等作用[19]。近年來國內多項研究顯示，乳漿大戟和大戟科的另外一些種的植物提取物具有很好的誘導多種惡性腫瘤細胞凋亡和抑制多種惡性腫瘤細胞增殖的作用[20-29]。
本文探討了乳漿大戟全草提取物對多藥耐藥人胃癌 SGC7901/ADR 細胞系增殖、遷移以及侵襲的抑制現象，研究了乳漿大戟全草提取物對 SGC7901/ADR 細胞凋亡的誘導作用及其基本機制。具體包括：用 MTT 研究了乳漿大戟對 SGC7901/ADR 細胞系的增殖抑制作用，用 Hochest33528 染色熒光顯微鏡觀察研究了乳漿大戟處理 SGC7901/ADR 細胞后細胞核形態的改變及其對細胞凋亡指數的影響（同時設 caspase 酶抑制劑對照和不加藥細胞對照），用流式細胞儀分析了乳漿大戟處理 SGC7901/ADR 細胞后細胞凋亡率的改變，用 Transwell 法研究了乳漿大戟對 SGC7901/ADR 細胞的遷移和侵襲能力的抑制作用，用分光光度法研究了 SGC7901/ADR 細胞內 caspase-3 和 caspase-9 酶活性升高的情況，用 Western blotting 檢測了 SGC7901/ADR 細胞內細胞色素 c 在線粒體和細胞質的分布情況。結果發現，乳漿大戟對多藥耐藥的 SGC7901/ADR 細胞具有明顯的抑制細胞增殖、抑制細胞遷移侵襲和誘導細胞凋亡的作用；經乳漿大戟作用后的 SGC7901/ADR 細胞，caspase-3 和 caspase-9 兩種凋亡蛋白活性升高，但在乳漿大戟處理細胞的同時如加入 caspase 酶抑制劑，則細胞凋亡指數沒有明顯上升；乳漿大戟作用后的 SGC7901/ADR 細胞，細胞色素 c 部分地從線粒體逸出而分布于細胞質。以上結果提示，乳漿大戟誘導 SGC7901/ADR 細胞凋亡的機制可能屬于內源性或線粒體途徑。這項研究為利用中藥乳漿大戟對抗或逆轉胃癌多藥耐藥性從而進行胃癌或其他癌癥的輔助治療奠定了一定的基礎。
