為了研究機械牽拉與前列腺素 E2（PGE2）對賴氨酰氧化酶（LOXs）家族基因表達的影響，本文對體外培養的正常人及圓錐角膜患者角膜成纖維細胞給予 PGE2 處理，并進行幅度為 12%、頻率為 0.1 Hz 的周期性機械牽拉 12 h，采用熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測 LOXs 家族基因的表達情況。研究結果顯示，圓錐角膜患者的角膜成纖維細胞 LOXs 家族基因表達量普遍低于正常角膜；與靜態培養組比較，單獨機械牽拉使正常組的賴氨酰氧化酶樣蛋白（LOXL）中的 LOXL-2 和 LOXL-4 基因表達上調，并使得圓錐角膜組的 LOXL-3 和 LOXL-4 基因表達下調；機械牽拉與 PGE2 聯合作用則使正常組的 LOXL-4 以及圓錐角膜組除 LOXL-1 之外的所有 LOXs 基因表達均下調。根據以上研究結果可提示，以機械牽拉和 PGE2 同時作用，將下調圓錐角膜患者角膜成纖維細胞的 LOXs 家族基因表達，這將可能導致角膜膠原交聯受阻，使膠原纖維之間的黏附力下降，膠原板層之間產生相對滑動，影響角膜結構穩定性，促進角膜發生圓錐膨隆。本文通過探討研究力學刺激與炎性因子對 LOXs 家族基因表達的影響，有助于更好地理解圓錐角膜發生發展的可能機理，為圓錐角膜預防及治療提供參考。
引用本文： 蘭偉偉, 李曉娜, 陳維毅, 劉晨, 容爍, 賀瑞. 機械牽拉與前列腺素 E2 聯合作用下調圓錐角膜成纖維細胞賴氨酰氧化酶家族基因表達 . 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(2): 239-245. doi: 10.7507/1001-5515.201608052 復制
引言
圓錐角膜是一種以角膜擴張為特征，致角膜中央部向前凸出呈圓錐形及產生高度不規則近視散光和不同視力損害的角膜變性疾病。目前普遍認為圓錐角膜的發生發展是多因素共同作用的結果，可能與遺傳、環境（接觸鏡的佩戴、揉眼等）、過敏等因素有關[1]，其病因至今尚不明確。
賴氨酰氧化酶（lysyl oxidases, LOXs）是銅依賴性單胺氧化酶，其家族成員主要有賴氨酰氧化酶蛋白（LOX）和 4 種賴氨酰氧化酶樣蛋白（lysyl oxidase like, LOXL）：LOXL-1、LOXL-2、LOXL-3、LOXL-4。LOXs 在細胞內以尚不具活性的酶原形式合成，由前膠原羧基末端內切酶剪切后轉變為具有活性的酶[2]。作為膠原蛋白和彈性蛋白的交聯劑，LOXs 在胚胎發育、組織損傷修復以及腫瘤發生與轉移等方面發揮著重要的作用[3]。
Ⅰ型膠原是角膜基質中主要的膠原蛋白，富含賴氨酸和羥賴氨酸殘基，可在 LOXs 的作用下形成共價交聯，交織成穩定的網狀結構。這不僅賦予了角膜組織良好的力學特性，而且增強了角膜抵抗非特異性蛋白水解酶降解的能力。鑒于 LOXs 具有使膠原蛋白和彈性蛋白交聯的功能，因此被認為可能與圓錐角膜的發生發展有關，例如：圓錐角膜的膠原纖維平均直徑減小、且大小不均一，以及膠原纖維之間的空間距離變窄等[4]。而給大鼠喂食氨基乙腈（LOXs 抑制劑）可以誘導牙周膜韌帶膠原纖維發生與文獻[4]報道的圓錐角膜病變類似的變化[5]，提示 LOXs 功能障礙可能導致角膜膠原形態結構及交聯發生異常。此外，采用單核苷酸多態性 （single nucleotide polymorphisms, SNP）分析對伊朗 112 名圓錐角膜患者和 150 名正常健康人進行研究發現，圓錐角膜患者的 LOX 基因 rs1800449 堿基發生變異，進而從分子生物學水平闡明圓錐角膜發生可能與 LOX 基因突變有關[6]。
LOXs 在正常角膜上皮、基質及內皮各層中均有表達，而在圓錐角膜組織中 LOX 表達明顯降低，尤其在基質層的表達量下降較為明顯[7]，而 LOXL-2 和 LOXL-3 的表達較正常角膜組織也明顯減少[8]。有研究指出，圓錐角膜患者淚液中 LOX 活性降低與圓錐角膜病變嚴重程度相關[9]。此外，一些體外培養的圓錐角膜上皮細胞及角膜成纖維細胞的 LOX 基因表達量或活性均明顯低于正常組織相應的表達量及活性[7,9]。
角膜屬承載組織，在角膜組織變薄、力學性能下降，如進行準分子激光近視手術(laser-in situ kera-tomileusis, LASIK)或發生圓錐角膜、眼內壓增高的情況下，角膜會受到更大的力學載荷作用。本課題組前期的研究結果表明，機械牽拉作用會影響角膜成纖維細胞基質金屬蛋白酶（matrix metallopro-teinases, MMPs）、基質金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs）及 Ⅰ型膠原蛋白的表達調節[10-12]。另有研究發現，圓錐角膜發生常伴有慢性炎癥反應[13-14]，且圓錐角膜基質細胞中前列腺素 E2（prostaglandin E2, PGE2）表達量約是正常角膜的 10 倍左右[15]。此外也有研究證實，一些細胞因子如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、轉化生長因子-β（trans-forming growth factor-β, TGF-β）、PGE2 等，能夠影響 LOXs 的表達[16-18]，其中 PGE2 可使肺和羊膜成纖維細胞的 LOX 表達下降[17-18]。另一方面，應力損傷和 PGE2 可通過介導后交叉韌帶成纖維細胞 LOXs 的表達，影響后交叉韌帶的自我修復[19]。而 PGE2 與力學刺激對圓錐角膜 LOXs 家族表達的影響尚未見報道。本文通過對體外培養的正常人及圓錐角膜患者角膜成纖維細胞給予 PGE2 處理，并進行周期性機械牽拉，探討了力學刺激與炎性因子對 LOXs 家族基因表達的影響，這將有助于更好地理解圓錐角膜發生發展的可能機理，為圓錐角膜預防及治療提供參考。
1 實驗材料和方法
1.1 主要試劑
改良 Eagle（Dulbecco's modification of Eagle's medium Dulbecco, DMEM）/F12 培養基（Hyclone）、胎牛血清（Gibico）、胰蛋白酶（Gibico）、Ⅱ型膠原酶（Sigma）、PGE2（Sigma），TRIZOL 及 Prime-ScriptTM RT RNA 檢測試劑[寶生物工程（大連）有限公司]。
1.2 人角膜成纖維細胞的提取及培養
正常角膜組織及圓錐角膜組織取自山西省眼科醫院，均為角膜移植術后的廢棄組織。用含慶大霉素的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）溶液清洗后，機械剝離角膜上皮和內皮層，再用 PBS 溶液反復清洗后，用含 1 mg/mL II 型膠原酶的培養基消化，直至組織塊完全消失，鏡下可見單個細胞時終止消化。2 000 r/min 離心 5 min，棄上清，加入含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12，并置于 37 ℃、5%CO2 孵箱內培養，本實驗采用傳至 3～5 代的細胞進行后續實驗。
1.3 PGE2 對 LOXs 基因表達的影響
首先收集不同時間點（0 h、6 h、12 h）正常組及圓錐角膜組細胞，TRIZOL 裂解細胞，檢測 LOXs mRNA 隨時間變化情況。然后選取 12 h 時間點，采用不同濃度(1、10、50 ng/mL)的 PGE2 處理細胞，以未加 PGE2 的正常組細胞作為對照。TRIZOL 裂解細胞，檢測不同濃度的 PGE2 對 LOXs mRNA 表達的影響。
1.4 細胞力學加載實驗
采用柔性基底拉伸系統 Flexcell 4000（Flexcell 公司，美國）對第 3～5 代的角膜成纖維細胞施加力學載荷。首先，將細胞接種于裱襯有 I 型膠原蛋白的 6 孔培養板上（BioFlex@，Flexcell 公司，美國），置于 37 ℃、5%CO2 孵箱內培養 24 h，當細胞融合率達到 80% 后，施以頻率 0.1 Hz、幅度 12% 的周期性機械牽拉 12 h，同時添加 10 ng/mL PGE2。正常角膜組和圓錐角膜組分別做以下處理：單純牽拉、PGE2 處理、PGE2+牽拉處理，以未加 PGE2 的靜態培養為對照組。卸載力學載荷后，以 TRIZOL 裂解細胞。
1.5 熒光實時定量 PCR 檢測 LOXs 基因表達
收集細胞裂解液，提取總 RNA，使用 Prime-ScriptTM RT 試劑盒進行反轉錄獲得 cDNA。采用熒光實時定量 PCR（Applied Biosystems Step-One，美國）檢測 LOX 及 LOXL-1-LOXL-4 的 mRNA 表達，并以管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceral-dehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）作為內參。引物設計如表 1所示。PCR 反應條件為：95 ℃ 預變性 30 s，1 個循環；95 ℃ 變性 5 s，60 ℃ 退火、延伸 30 s，35 個循環。采用 2-ΔΔCT 法對基因表達進行相對定量分析。
表1
目標基因引物序列
Table1.
Primers sequence of target gene
1.6 數據統計分析
實驗結果以均值±標準差表示，采用 SPSS 13.0 統計分析軟件及t 檢驗分析數據，檢測兩組之間是否存在差異，P<0.05，認為差異具有統計學意義。
2 實驗結果
2.1 角膜成纖維細胞 LOXs mRNA 表達隨時間的變化
各組 mRNA 相對表達量均以正常組 0 h 的數據為參照，如圖 1 所示，除 0 h 和 6 h 的 LOX mRNA 以及 6 h 的 LOXL-2 mRNA 外，圓錐角膜組角膜成纖維細胞的 LOXs mRNA 整體表達水平均低于正常組。正常組 LOXL-4 mRNA 在 6 h 時明顯升高（約為 0 h 的 3.31 倍），其他各組 LOXs mRNA 總體隨時間變化幅度不大。
圖1
正常人及圓錐角膜患者角膜成纖維細胞 LOXs 家族基因表達隨時間變化情況
Figure1.
Changes of gene expression of LOXs family with time in corneal fibroblasts for healthy human and keratoconus patient
2.2 不同濃度 PGE2 對 LOXs mRNA 表達的影響
如圖 2 所示，各組 mRNA 相對表達量均以正常對照組為參照，PGE2 對正常組及圓錐角膜組 LOXs mRNA 表達無明顯的劑量依賴性。正常組和圓錐角膜組趨勢基本相同，1 ng/mL 的 PGE2 對 LOXs mRNA 表達具有一定促進作用；10 ng/mL 的 PGE2 有上調 LOXL-1 和 LOXL-4、下調 LOXL-2 和 LOXL-3 mRNA 表達的趨勢，而對 LOX mRNA 的表達無明顯影響；50 ng/mL 的 PGE2 對 LOXs 的表達無明顯影響。
圖2
PGE2 對正常人及圓錐角膜患者角膜成纖維細胞 LOXs 家族基因表達的影響*P<0.05，相應處理下，圓錐角膜組vs. 正常組；#P<0.05，vs. 正常對照組；&P<0.05，vs. 圓錐角膜未處理組
Figure2.
Effects of PGE2 on LOXs gene expression in corneal fibroblasts for healthy human and keratoconus patient*P<0.05, keratoconus groupvs. healthy group under corresponding treatment;#P<0.05,vs. healthy control;&P<0.05,vs. keratoconus group without treatment
2.3 機械牽拉與 PGE2 聯合作用對角膜成纖維細胞 LOXs mRNA 表達的影響
如圖 3 所示，單獨機械牽拉可上調正常組 LOXL-2 和 LOXL-4、下調圓錐角膜組 LOXL-3 和 LOXL-4 mRNA 的表達（P<0.05），對正常組的 LOX、LOXL-1 和 LOXL-3、圓錐角膜組的 LOX、LOXL-1 和 LOXL-2 無明顯影響（P<0.05）。機械牽拉與 PGE2 聯合作用僅上調正常組 LOXL-4（P<0.05），對正常組其他家族成員基因表達無明顯影響（P<0.05），但下調了圓錐角膜組除 LOXL-1 外所有 LOXs mRNA 的表達（P<0.05）。
圖3
機械牽拉和 PGE2 聯合作用對正常人及圓錐角膜患者角膜成纖維細胞 LOXs 家族基因表達的影響*P<0.05，與各自靜態對照組比較
Figure3.
Combined effects of mechanical stretching and PGE2 on the gene expression of LOXs family in corneal fibroblasts for healthy human and keratoconus patient*P<0.05,vs. their own static control
3 討論
細胞外基質的動態平衡及重塑受到多種因素的精準調控。其中，膠原蛋白和彈性蛋白交聯需要在 LOXs 的催化下完成。LOX 和 LOXL-1 表達異常可導致眼部疾病如青光眼、增生型糖尿病視網膜病變和孔源性視網膜脫離以及圓錐角膜等疾病的發生[21-22]。本課題組研究發現，圓錐角膜患者角膜成纖維細胞的 LOX、LOXL-1、LOXL-2、LOXL-3、LOXL-4 的 mRNA 表達均低于正常人。Dudakova 等[7-8] 也發現圓錐角膜成纖維細胞的 LOX 整體活性低于正常人，其研究小組的免疫組化染色結果也證實圓錐角膜基質中 LOX、LOXL-2 和 LOXL-3 的表達較正常角膜組織明顯減少。
近年的一些研究發現，圓錐角膜常伴有慢性炎癥，在患者淚液中檢出了 TNF-α、白介素（interleu-kin, IL）-1/-6 等促炎癥因子[13-14]；圓錐角膜成纖維細胞中 IL-6、PGE2 和 IL-1α受體的表達明顯高于正常人，添加 IL-1 培養圓錐角膜成纖維細胞可使 PGE2 表達量進一步增加[15,23]。還有研究表明，TNF-α可通過上調 IL-6 促進圓錐角膜成纖維細胞 MMP-1 的表達，促進 I 型膠原降解[24]。本研究發現，PGE2 對正常及圓錐角膜 LOXs mRNA 表達的影響無明顯的劑量依賴性，雖然不同劑量 PGE2 對 LOXs 基因表達影響不同，但對正常及圓錐角膜 LOXs 基因表達影響趨勢基本一致：低劑量（1 ng/mL）PGE2 對 LOXs 的基因表達具有一定促進作用；中劑量（10 ng/mL）PGE2 有上調 LOXL-1 和 LOXL-4、下調 LOXL-2 和 LOXL-3 mRNA 表達的趨勢，對 LOX mRNA 表達無明顯影響；而高劑量（50 ng/mL）PGE2 對 LOXs 表達均無明顯影響。他人研究也發現，不同劑量細胞因子通過不同信號通路影響 LOXs 的表達，如低劑量 TNF-α（1～5 ng/mL）可抑制心肌成纖維細胞 LOX 表達，高劑量 TNF-α（10～30 ng/mL）則通過磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶 B（phosphatidyl inositol-3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信號途徑促進 LOX 表達[16]。不同劑量 PGE2 通過何種信號通路影響角膜成纖維細胞 LOXs 的表達則有待進一步研究。
由于圓錐角膜組織結構完整性破壞、力學性能下降，在眼壓的作用下所受張應變增加，因此，我們探究了力學刺激和炎癥同時存在條件下 LOXs 的表達。發現單獨機械牽拉可上調正常組 LOXL-2、LOXL-4，下調圓錐角膜組 LOXL-3、LOXL-4 mRNA 的表達，說明單獨機械牽拉即可引起圓錐角膜組 LOXs 表達異常。而機械牽拉和 PGE2 聯合作用則更是下調了圓錐角膜組除 LOXL-1 外所有 LOXs mRNA 的表達。這些結果提示圓錐角膜角膜成纖維細胞在張應變和炎癥同時存在的條件下，可能通過下調 LOXs 的表達，引起角膜基質膠原交聯障礙，進而影響角膜組織結構完整性和力學性能的穩定性。在韌帶組織中也存在類似情況：12% 機械牽拉使共培養條件下的膝關節后交叉韌帶成纖維細胞和滑膜細胞中 LOXs 表達明顯降低；在共培養和應力損傷共同作用的基礎上，10 ng/mL 的 PGE2 進一步降低了兩種細胞中 LOXs 的表達。應力損傷和 PGE2 可能通過介導 LOXs 表達異常從而破壞細胞外基質的動態平衡，導致后交叉韌帶損傷后難以達到滿意的自身修復[19]。
目前為止，本研究尚具有一定的局限性。首先，正常人及圓錐角膜患者角膜樣本來源有限；此外，采用柔性基底拉伸系統 Flexcell 4000 牽拉系統，僅在一定程度上模擬了圓錐角膜組織的在體環境。而圓錐角膜成纖維細胞所處的真實力學微環境遠比此復雜，有多種細胞因子和蛋白酶等參與了圓錐角膜的發生發展。這些因素如何共同作用影響圓錐角膜的發生發展及其分子調控機制，還有待深入探討。我們的研究結果進一步說明圓錐角膜的發生發展可能與 LOXs 的表達降低有關；此外，角膜張應變增加和炎癥共同作用可能會進一步降低圓錐角膜 LOXs 的表達。鑒于 LOXs 可通過促進膠原交聯來增加角膜結構的力學穩定性，因此，改善 LOXs 的表達可能成為圓錐角膜疾病治療的新靶點。
引言
圓錐角膜是一種以角膜擴張為特征，致角膜中央部向前凸出呈圓錐形及產生高度不規則近視散光和不同視力損害的角膜變性疾病。目前普遍認為圓錐角膜的發生發展是多因素共同作用的結果，可能與遺傳、環境（接觸鏡的佩戴、揉眼等）、過敏等因素有關[1]，其病因至今尚不明確。
賴氨酰氧化酶（lysyl oxidases, LOXs）是銅依賴性單胺氧化酶，其家族成員主要有賴氨酰氧化酶蛋白（LOX）和 4 種賴氨酰氧化酶樣蛋白（lysyl oxidase like, LOXL）：LOXL-1、LOXL-2、LOXL-3、LOXL-4。LOXs 在細胞內以尚不具活性的酶原形式合成，由前膠原羧基末端內切酶剪切后轉變為具有活性的酶[2]。作為膠原蛋白和彈性蛋白的交聯劑，LOXs 在胚胎發育、組織損傷修復以及腫瘤發生與轉移等方面發揮著重要的作用[3]。
Ⅰ型膠原是角膜基質中主要的膠原蛋白，富含賴氨酸和羥賴氨酸殘基，可在 LOXs 的作用下形成共價交聯，交織成穩定的網狀結構。這不僅賦予了角膜組織良好的力學特性，而且增強了角膜抵抗非特異性蛋白水解酶降解的能力。鑒于 LOXs 具有使膠原蛋白和彈性蛋白交聯的功能，因此被認為可能與圓錐角膜的發生發展有關，例如：圓錐角膜的膠原纖維平均直徑減小、且大小不均一，以及膠原纖維之間的空間距離變窄等[4]。而給大鼠喂食氨基乙腈（LOXs 抑制劑）可以誘導牙周膜韌帶膠原纖維發生與文獻[4]報道的圓錐角膜病變類似的變化[5]，提示 LOXs 功能障礙可能導致角膜膠原形態結構及交聯發生異常。此外，采用單核苷酸多態性 （single nucleotide polymorphisms, SNP）分析對伊朗 112 名圓錐角膜患者和 150 名正常健康人進行研究發現，圓錐角膜患者的 LOX 基因 rs1800449 堿基發生變異，進而從分子生物學水平闡明圓錐角膜發生可能與 LOX 基因突變有關[6]。
LOXs 在正常角膜上皮、基質及內皮各層中均有表達，而在圓錐角膜組織中 LOX 表達明顯降低，尤其在基質層的表達量下降較為明顯[7]，而 LOXL-2 和 LOXL-3 的表達較正常角膜組織也明顯減少[8]。有研究指出，圓錐角膜患者淚液中 LOX 活性降低與圓錐角膜病變嚴重程度相關[9]。此外，一些體外培養的圓錐角膜上皮細胞及角膜成纖維細胞的 LOX 基因表達量或活性均明顯低于正常組織相應的表達量及活性[7,9]。
角膜屬承載組織，在角膜組織變薄、力學性能下降，如進行準分子激光近視手術(laser-in situ kera-tomileusis, LASIK)或發生圓錐角膜、眼內壓增高的情況下，角膜會受到更大的力學載荷作用。本課題組前期的研究結果表明，機械牽拉作用會影響角膜成纖維細胞基質金屬蛋白酶（matrix metallopro-teinases, MMPs）、基質金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs）及 Ⅰ型膠原蛋白的表達調節[10-12]。另有研究發現，圓錐角膜發生常伴有慢性炎癥反應[13-14]，且圓錐角膜基質細胞中前列腺素 E2（prostaglandin E2, PGE2）表達量約是正常角膜的 10 倍左右[15]。此外也有研究證實，一些細胞因子如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、轉化生長因子-β（trans-forming growth factor-β, TGF-β）、PGE2 等，能夠影響 LOXs 的表達[16-18]，其中 PGE2 可使肺和羊膜成纖維細胞的 LOX 表達下降[17-18]。另一方面，應力損傷和 PGE2 可通過介導后交叉韌帶成纖維細胞 LOXs 的表達，影響后交叉韌帶的自我修復[19]。而 PGE2 與力學刺激對圓錐角膜 LOXs 家族表達的影響尚未見報道。本文通過對體外培養的正常人及圓錐角膜患者角膜成纖維細胞給予 PGE2 處理，并進行周期性機械牽拉，探討了力學刺激與炎性因子對 LOXs 家族基因表達的影響，這將有助于更好地理解圓錐角膜發生發展的可能機理，為圓錐角膜預防及治療提供參考。
1 實驗材料和方法
1.1 主要試劑
改良 Eagle（Dulbecco's modification of Eagle's medium Dulbecco, DMEM）/F12 培養基（Hyclone）、胎牛血清（Gibico）、胰蛋白酶（Gibico）、Ⅱ型膠原酶（Sigma）、PGE2（Sigma），TRIZOL 及 Prime-ScriptTM RT RNA 檢測試劑[寶生物工程（大連）有限公司]。
1.2 人角膜成纖維細胞的提取及培養
正常角膜組織及圓錐角膜組織取自山西省眼科醫院，均為角膜移植術后的廢棄組織。用含慶大霉素的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）溶液清洗后，機械剝離角膜上皮和內皮層，再用 PBS 溶液反復清洗后，用含 1 mg/mL II 型膠原酶的培養基消化，直至組織塊完全消失，鏡下可見單個細胞時終止消化。2 000 r/min 離心 5 min，棄上清，加入含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12，并置于 37 ℃、5%CO2 孵箱內培養，本實驗采用傳至 3～5 代的細胞進行后續實驗。
1.3 PGE2 對 LOXs 基因表達的影響
首先收集不同時間點（0 h、6 h、12 h）正常組及圓錐角膜組細胞，TRIZOL 裂解細胞，檢測 LOXs mRNA 隨時間變化情況。然后選取 12 h 時間點，采用不同濃度(1、10、50 ng/mL)的 PGE2 處理細胞，以未加 PGE2 的正常組細胞作為對照。TRIZOL 裂解細胞，檢測不同濃度的 PGE2 對 LOXs mRNA 表達的影響。
1.4 細胞力學加載實驗
采用柔性基底拉伸系統 Flexcell 4000（Flexcell 公司，美國）對第 3～5 代的角膜成纖維細胞施加力學載荷。首先，將細胞接種于裱襯有 I 型膠原蛋白的 6 孔培養板上（BioFlex@，Flexcell 公司，美國），置于 37 ℃、5%CO2 孵箱內培養 24 h，當細胞融合率達到 80% 后，施以頻率 0.1 Hz、幅度 12% 的周期性機械牽拉 12 h，同時添加 10 ng/mL PGE2。正常角膜組和圓錐角膜組分別做以下處理：單純牽拉、PGE2 處理、PGE2+牽拉處理，以未加 PGE2 的靜態培養為對照組。卸載力學載荷后，以 TRIZOL 裂解細胞。
1.5 熒光實時定量 PCR 檢測 LOXs 基因表達
收集細胞裂解液，提取總 RNA，使用 Prime-ScriptTM RT 試劑盒進行反轉錄獲得 cDNA。采用熒光實時定量 PCR（Applied Biosystems Step-One，美國）檢測 LOX 及 LOXL-1-LOXL-4 的 mRNA 表達，并以管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceral-dehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）作為內參。引物設計如表 1所示。PCR 反應條件為：95 ℃ 預變性 30 s，1 個循環；95 ℃ 變性 5 s，60 ℃ 退火、延伸 30 s，35 個循環。采用 2-ΔΔCT 法對基因表達進行相對定量分析。
表1
目標基因引物序列
Table1.
Primers sequence of target gene
1.6 數據統計分析
實驗結果以均值±標準差表示，采用 SPSS 13.0 統計分析軟件及t 檢驗分析數據，檢測兩組之間是否存在差異，P<0.05，認為差異具有統計學意義。
2 實驗結果
2.1 角膜成纖維細胞 LOXs mRNA 表達隨時間的變化
各組 mRNA 相對表達量均以正常組 0 h 的數據為參照，如圖 1 所示，除 0 h 和 6 h 的 LOX mRNA 以及 6 h 的 LOXL-2 mRNA 外，圓錐角膜組角膜成纖維細胞的 LOXs mRNA 整體表達水平均低于正常組。正常組 LOXL-4 mRNA 在 6 h 時明顯升高（約為 0 h 的 3.31 倍），其他各組 LOXs mRNA 總體隨時間變化幅度不大。
圖1
正常人及圓錐角膜患者角膜成纖維細胞 LOXs 家族基因表達隨時間變化情況
Figure1.
Changes of gene expression of LOXs family with time in corneal fibroblasts for healthy human and keratoconus patient
2.2 不同濃度 PGE2 對 LOXs mRNA 表達的影響
如圖 2 所示，各組 mRNA 相對表達量均以正常對照組為參照，PGE2 對正常組及圓錐角膜組 LOXs mRNA 表達無明顯的劑量依賴性。正常組和圓錐角膜組趨勢基本相同，1 ng/mL 的 PGE2 對 LOXs mRNA 表達具有一定促進作用；10 ng/mL 的 PGE2 有上調 LOXL-1 和 LOXL-4、下調 LOXL-2 和 LOXL-3 mRNA 表達的趨勢，而對 LOX mRNA 的表達無明顯影響；50 ng/mL 的 PGE2 對 LOXs 的表達無明顯影響。
圖2
PGE2 對正常人及圓錐角膜患者角膜成纖維細胞 LOXs 家族基因表達的影響*P<0.05，相應處理下，圓錐角膜組vs. 正常組；#P<0.05，vs. 正常對照組；&P<0.05，vs. 圓錐角膜未處理組
Figure2.
Effects of PGE2 on LOXs gene expression in corneal fibroblasts for healthy human and keratoconus patient*P<0.05, keratoconus groupvs. healthy group under corresponding treatment;#P<0.05,vs. healthy control;&P<0.05,vs. keratoconus group without treatment
2.3 機械牽拉與 PGE2 聯合作用對角膜成纖維細胞 LOXs mRNA 表達的影響
如圖 3 所示，單獨機械牽拉可上調正常組 LOXL-2 和 LOXL-4、下調圓錐角膜組 LOXL-3 和 LOXL-4 mRNA 的表達（P<0.05），對正常組的 LOX、LOXL-1 和 LOXL-3、圓錐角膜組的 LOX、LOXL-1 和 LOXL-2 無明顯影響（P<0.05）。機械牽拉與 PGE2 聯合作用僅上調正常組 LOXL-4（P<0.05），對正常組其他家族成員基因表達無明顯影響（P<0.05），但下調了圓錐角膜組除 LOXL-1 外所有 LOXs mRNA 的表達（P<0.05）。
圖3
機械牽拉和 PGE2 聯合作用對正常人及圓錐角膜患者角膜成纖維細胞 LOXs 家族基因表達的影響*P<0.05，與各自靜態對照組比較
Figure3.
Combined effects of mechanical stretching and PGE2 on the gene expression of LOXs family in corneal fibroblasts for healthy human and keratoconus patient*P<0.05,vs. their own static control
3 討論
細胞外基質的動態平衡及重塑受到多種因素的精準調控。其中，膠原蛋白和彈性蛋白交聯需要在 LOXs 的催化下完成。LOX 和 LOXL-1 表達異常可導致眼部疾病如青光眼、增生型糖尿病視網膜病變和孔源性視網膜脫離以及圓錐角膜等疾病的發生[21-22]。本課題組研究發現，圓錐角膜患者角膜成纖維細胞的 LOX、LOXL-1、LOXL-2、LOXL-3、LOXL-4 的 mRNA 表達均低于正常人。Dudakova 等[7-8] 也發現圓錐角膜成纖維細胞的 LOX 整體活性低于正常人，其研究小組的免疫組化染色結果也證實圓錐角膜基質中 LOX、LOXL-2 和 LOXL-3 的表達較正常角膜組織明顯減少。
近年的一些研究發現，圓錐角膜常伴有慢性炎癥，在患者淚液中檢出了 TNF-α、白介素（interleu-kin, IL）-1/-6 等促炎癥因子[13-14]；圓錐角膜成纖維細胞中 IL-6、PGE2 和 IL-1α受體的表達明顯高于正常人，添加 IL-1 培養圓錐角膜成纖維細胞可使 PGE2 表達量進一步增加[15,23]。還有研究表明，TNF-α可通過上調 IL-6 促進圓錐角膜成纖維細胞 MMP-1 的表達，促進 I 型膠原降解[24]。本研究發現，PGE2 對正常及圓錐角膜 LOXs mRNA 表達的影響無明顯的劑量依賴性，雖然不同劑量 PGE2 對 LOXs 基因表達影響不同，但對正常及圓錐角膜 LOXs 基因表達影響趨勢基本一致：低劑量（1 ng/mL）PGE2 對 LOXs 的基因表達具有一定促進作用；中劑量（10 ng/mL）PGE2 有上調 LOXL-1 和 LOXL-4、下調 LOXL-2 和 LOXL-3 mRNA 表達的趨勢，對 LOX mRNA 表達無明顯影響；而高劑量（50 ng/mL）PGE2 對 LOXs 表達均無明顯影響。他人研究也發現，不同劑量細胞因子通過不同信號通路影響 LOXs 的表達，如低劑量 TNF-α（1～5 ng/mL）可抑制心肌成纖維細胞 LOX 表達，高劑量 TNF-α（10～30 ng/mL）則通過磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶 B（phosphatidyl inositol-3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信號途徑促進 LOX 表達[16]。不同劑量 PGE2 通過何種信號通路影響角膜成纖維細胞 LOXs 的表達則有待進一步研究。
由于圓錐角膜組織結構完整性破壞、力學性能下降，在眼壓的作用下所受張應變增加，因此，我們探究了力學刺激和炎癥同時存在條件下 LOXs 的表達。發現單獨機械牽拉可上調正常組 LOXL-2、LOXL-4，下調圓錐角膜組 LOXL-3、LOXL-4 mRNA 的表達，說明單獨機械牽拉即可引起圓錐角膜組 LOXs 表達異常。而機械牽拉和 PGE2 聯合作用則更是下調了圓錐角膜組除 LOXL-1 外所有 LOXs mRNA 的表達。這些結果提示圓錐角膜角膜成纖維細胞在張應變和炎癥同時存在的條件下，可能通過下調 LOXs 的表達，引起角膜基質膠原交聯障礙，進而影響角膜組織結構完整性和力學性能的穩定性。在韌帶組織中也存在類似情況：12% 機械牽拉使共培養條件下的膝關節后交叉韌帶成纖維細胞和滑膜細胞中 LOXs 表達明顯降低；在共培養和應力損傷共同作用的基礎上，10 ng/mL 的 PGE2 進一步降低了兩種細胞中 LOXs 的表達。應力損傷和 PGE2 可能通過介導 LOXs 表達異常從而破壞細胞外基質的動態平衡，導致后交叉韌帶損傷后難以達到滿意的自身修復[19]。
目前為止，本研究尚具有一定的局限性。首先，正常人及圓錐角膜患者角膜樣本來源有限；此外，采用柔性基底拉伸系統 Flexcell 4000 牽拉系統，僅在一定程度上模擬了圓錐角膜組織的在體環境。而圓錐角膜成纖維細胞所處的真實力學微環境遠比此復雜，有多種細胞因子和蛋白酶等參與了圓錐角膜的發生發展。這些因素如何共同作用影響圓錐角膜的發生發展及其分子調控機制，還有待深入探討。我們的研究結果進一步說明圓錐角膜的發生發展可能與 LOXs 的表達降低有關；此外，角膜張應變增加和炎癥共同作用可能會進一步降低圓錐角膜 LOXs 的表達。鑒于 LOXs 可通過促進膠原交聯來增加角膜結構的力學穩定性，因此，改善 LOXs 的表達可能成為圓錐角膜疾病治療的新靶點。
