重復經顱磁刺激（rTMS）能對刺激腦區及與其相連接的遠端腦區產生影響。本文將從大腦功能連接、腦區之間相互協調工作狀態改變的角度，研究低頻 rTMS 刺激腦初級運動皮層對大腦的影響作用。募集了 10 名健康受試者，采用 1 Hz rTMS 刺激腦初級運動皮層 20 min，采集刺激前后 1 min 閉目靜息狀態下的腦電（EEG）數據。對 EEG 進行相位同步分析，建立腦功能網絡，并計算腦功能網絡特征參數。最后使用符號秩和檢驗進行統計學分析。結果表明，低頻 rTMS 刺激使大腦 alpha 頻段全局相位同步指數顯著降低（P<0.05）。兩兩腦區分析表現為刺激側的運動皮層與額葉皮層和頂葉皮層、非刺激側頂葉皮層與雙側額葉皮層之間 alpha 頻段相位同步顯著降低。alpha 頻段腦功能網絡的平均度、全局效率降低（P<0.05），平均最短路徑長度顯著增加（P<0.05）。表明低頻 rTMS 使腦功能網絡的信息傳輸變慢，傳輸效率變低。本文從大腦功能連接性的角度上證明了低頻 rTMS 對大腦活動的抑制作用，說明低頻 rTMS 能夠對刺激腦區及與刺激腦區相連接的遠端腦區產生影響。本研究有望為低頻 rTMS 應用于臨床疾病的治療提供一定的指導。
引用本文： 靳靜娜, 金芳, 王欣, 劉志朋, 殷濤. 低頻重復經顱磁刺激刺激初級運動皮層對大腦功能連接影響的研究. 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(4): 493-499. doi: 10.7507/1001-5515.201607043 復制
引言
1985 年，英國謝菲爾德大學的 Barker 等[1]利用磁刺激器刺激大腦運動皮層，在對側手部肌肉上成功記錄到了運動誘發電位（motor evoked poten-tials，MEP），引起了世界各國研究者的關注。該項技術被命名為經顱磁刺激（transcranial magnetic stimulation，TMS）。重復經顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）是 TMS 刺激方式的一種。它是采用 TMS 刺激器以一定頻率、一定間隔重復輸出多個脈沖序列，并施加于大腦的特定腦區，可以對大腦神經活動產生干擾，改變大腦神經元的興奮性[2]。研究結果表明，rTMS 對大腦的刺激效果在刺激結束后仍能持續一段時間。目前，rTMS 已經廣泛應用于臨床上神經障礙和精神障礙的治療，包括抑郁癥、阿爾茨海默病、強迫癥等，取得了令人滿意的效果[3-5]。
在 rTMS 技術發展之初，研究者通過記錄外周肌肉的 MEP 間接評估 rTMS 對大腦運動皮層興奮性的影響作用[6]。隨著各種影像技術的發展，功能磁共振成像（functional magnetic resonance ima-ging，fMRI）、腦電（electroencephalography，EEG）等影像技術也開始用于評估 rTMS 對大腦神經活動的調控作用[7-9]。然而，已有的研究主要關注了 rTMS 對局部腦皮層興奮性的作用，而忽略了對腦區之間相互作用、協同工作狀態的影響。2002 年，研究者使用 EEG 評估了 rTMS 對不同腦區之間的調控作用，但是該研究僅僅探討了 rTMS 對左右兩個大腦半球運動腦區之間的調控作用，未考慮對更多腦區之間協同工作狀態的影響[7]。
對于某一特定任務，需要大腦多個腦區之間的協同工作才能完成，因此，不同腦區之間的協同工作狀態、腦區之間的連接特征已成為腦功能研究領域的研究熱點[10]。目前，研究腦區之間相互連接關系廣泛使用的方法是基于圖論的復雜網絡分析方法，即使用圖論理論繪制腦區之間相互連接關系的拓撲圖，稱之為腦網絡連接圖[11]。圖論將一個網絡描述為由節點和邊構成的圖，在基于圖論的 EEG 腦功能網絡分析中，將 EEG 電極作為腦功能網絡的節點，兩兩電極之間的相互關系作為腦功能網絡的邊，通過計算兩兩電極所得 EEG 信號之間的互相關、頻率相干或相位同步等關系特征，設定閾值將 EEG 信號之間的關系二值化，從而確定兩兩電極之間是否存在功能連接性，獲得腦功能網絡的拓撲圖。
本文擬通過記錄可以直接反映神經興奮性的 EEG 信號，分析 1 Hz 低頻 rTMS 刺激大腦初級運動皮層時各腦區之間神經電信號相位同步性的變化。采用基于圖論的腦功能連接方法，從腦功能連接、腦區之間協同工作狀態改變的角度研究 1 Hz rTMS 刺激對大腦功能活動的影響。
1 方法
1.1 實驗條件建立
募集了 10 名健康男性受試者，年齡 21～26 歲，均為在校大學生，無神經或精神系統疾病病史及家族史，MRI 檢測未發現顱內病變。使用愛丁堡利手判定準則，測定所有受試者均為右利手。所有受試者在實驗前 48 h 內沒有服用咖啡、白酒等刺激性飲品，實驗前保證了充足的睡眠。受試者均簽署了知情同意書，自愿參加實驗。
rTMS 使用英國生產的 magstim rapid2 磁刺激器，刺激線圈使用與該磁刺激器匹配的 70 mm 八字線圈。試驗前掃描了所有受試者的頭部 MRI 影像，通過 brainsight 精密導航系統軟件重建個體化的立體頭模型，利用追蹤球將 TMS 刺激線圈與導航中的虛擬線圈進行配準，然后將受試者頭部與該頭模型進行配準，保證實驗過程中 rTMS 刺激時刺激位置和刺激方向的精確性與一致性。
為了確定各受試者 rTMS 刺激時的刺激強度，使用肌電記錄系統采集手部肌肉的肌電 MEP 來確定受試者個體的刺激閾值。本研究使用意大利 micromed 多通道生理信號記錄儀采集右手第一骨間背側肌的肌電信號，兩個肌電記錄電極相距 2 cm，地電極放置在右手豌豆骨上。肌電系統的采樣率為 32 768 Hz。EEG 采集使用美國 neuroscan 系統和 64 導 easycap EEG 帽，包括 62 導記錄電極、一個地電極及一個參考電極，其中 2 個記錄電極分別放置于眼睛下部和眼外眥處，用于采集垂直方向眼電和水平方向眼電，為后續 EEG 數據處理時眼電的去除提供數據支持。EEG 采集參數設置為 DC～200 Hz 的濾波，1 000 Hz 采樣率。
1.2 試驗設計與刺激參數
rTMS 對大腦興奮性的影響依賴于刺激頻率，低頻產生抑制神經活動的作用，高頻產生興奮神經活動的作用。1 Hz 低頻 rTMS 在臨床上已廣泛應用于皮層興奮性異常增加的患者[12]。rTMS 對腦的影響作用在刺激結束后持續一段時間，且持續時間與 rTMS 的刺激時間相關[13]。本研究采用 1 Hz rTMS 刺激腦運動區 20 min，通過分析 rTMS 前后的 EEG 信號，獲得 rTMS 對腦功能網絡拓撲特性的影響。
試驗前，首先使用單脈沖 TMS 確定受試者的個體運動閾值和手初級運動皮層。刺激線圈保持與頭皮相切，線圈把柄向后，并與大腦縱裂呈 45°。根據解剖學上大腦初級運動皮層的位置，以中央前回的“手結”為中心移動線圈，尋找以最小 TMS 輸出時，10 次 TMS 中至少存在 5 次肌電 MEP 幅值大于等于 50 μV 的皮層位置點，此時的 TMS 輸出強度為該受試者的靜息運動閾值（resting motor threshold，RMT），該皮層位置點為手初級運動皮層。
試驗中，rTMS 的刺激頻率為 1 Hz，刺激強度為 90% RMT，刺激靶點為右手對應的初級運動皮層，采用與確定 RMT 時相同的線圈放置方式，刺激時間為 20 min，共 1 200 個脈沖。分別在 rTMS 刺激前后采集 1 min 閉目靜息狀態的 EEG 信號。
1.3 相位同步分析
研究認為，神經網絡的同步振蕩可能是大腦對信息進行整合和處理的潛在機制。使用 EEG 檢測神經電信號活動，通過計算不同腦區神經電信號的同步關系，可以獲得大腦信息交流的狀態。EEG 相位同步是研究不同腦區之間同步關系的方法之一，其描述的是兩導 EEG 信號之間的相位關系。在使用中，通常將相位的同步關系歸一化，得到相位同步指數。EEG 相位同步在描述神經網絡和大尺度神經活動整合的同步結構中具有非常重要的作用。
本研究采用希爾伯特（Hilbert）變換提取不同電極 EEG 信號的相位信息，從而獲得不同頻段下兩兩電極之間的相位同步性。對時間連續的一導 EEG 信號 x（t），它的 Hilbert 變換為：
'/> |
又定義信號 x（t）的解析信號為：
 |
從而獲得該電極 EEG 信號的幅度信息
和相位信息
。對另一導 EEG 信號 y（t）做同樣處理，相應得到 y（t）的幅度信息
和相位信息
，假定 x 和 y 的相位鎖定比為 n:m（n、m 為整數，一般取 n=m=1），則定義兩個解析信號的相位差為：
 |
相位同步指數 γH[14]定義為：
 |
其中
表示時間平均。γH取值范圍為 [0，1]，當 γH=0 時，兩個信號無同步，當 γH=1 時，兩個信號具有穩定的相位差。
1.4 構建網絡及網絡特征
設定閾值，對兩兩電極之間的相位同步指數進行二值化處理，構建腦功能連接的二值矩陣，具體為：
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式中，T 為閾值。本文閾值的選取原則為使腦功能網絡滿足連通性的最大值。
為了獲得 1 Hz rTMS 對大腦功能網絡拓撲結構的影響，分析了大腦功能網絡的拓撲特征，包括平均度、平均最短路徑長度、全局效率、聚類系數四個網絡屬性度量指標。
節點度定義為與該節點相關聯的總邊數，即通過該節點的邊的數量，也等于該節點擁有的鄰節點個數。節點的度值越大，意味著該節點在網絡中的地位越重要。計算公式如式（6）所示。
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平均度為網絡中所有節點度的平均值，計算公式如式（7）所示。
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最短路徑是指網絡中某一節點的信息到達另一節點的最優路徑，描述了網絡的信息傳輸狀態，其長度越短，信息傳輸越快，網絡的效率越高。兩個節點 i、j 之間邊數最少的一條通路稱為這兩點之間的最短路徑，該路徑所經過的邊的數目即為節點 i、j 之間的最短路徑長度。整個網絡的平均最短路徑長度為任意兩個節點之間最短路徑長度的平均值，計算公式如式（8）所示。
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節點效率是指網絡中某一節點與其他節點之間最短路徑長度倒數的平均值，是衡量信息在網絡中傳遞快慢的綜合指標，網絡的節點效率越大，則信息傳遞效果越強。全局效率則是整個網絡最短路徑長度倒數的平均值，計算公式如式（9）所示。
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聚類系數是衡量網絡集團化程度的一個重要參數，表示某一個節點 i 的鄰居間互為鄰居的可能，計算公式如式（10）所示。
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1.5 數據處理
使用 Matlab 及其工具包 EEGLAB 對采集的 EEG 信號進行分析。首先對數據進行預處理，包括變參考為雙耳乳突，手動去除干擾大的 EEG 信號段，降采樣到 250 Hz，進行[1 Hz，100 Hz]的帶通濾波及 50 Hz 陷波，采用獨立分量分析去除眼動干擾，從而獲得干凈的 EEG 信號。
選取 50 s 干凈的 EEG 信號進行后續處理。通過帶通濾波提取 EEG 信號的不同頻段，包括 delta（1～4 Hz）、theta（4～8 Hz）、alpha（8～13 Hz）、beta（13～30 Hz）、gamma1（30～45 Hz）和 gamma2（55～100 Hz）。然后，對所有電極進行兩兩電極之間相位同步指數的計算，設定閾值，獲得大腦相位同步指數的二值化矩陣，構建腦功能網絡并計算網絡特征。最后使用符號秩和檢驗進行統計學分析，P<0.05 認為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 全局相位同步指數
為了評價 1 Hz rTMS 對大腦不同頻段神經節律信號相位同步特征的影響，使用相位同步方法計算 rTMS 前后兩兩電極之間的相位同步指數。將所有電極之間的相位同步指數加和平均，得到全局相位同步（global phase synchronization，GPS）指數，如圖 1 所示。
圖1
1 Hz rTMS 對全局相位同步指數的影響
*
*
從圖 1 可以看出，1 Hz rTMS 刺激初級運動皮層使 delta、alpha、gamma1 和 gamma2 頻段的 GPS 呈降低趨勢。符號秩和檢驗結果顯示，alpha 頻段的 GPS 變化具有統計學意義（P<0.05）。表明 1 Hz rTMS 刺激初級運動皮層對 alpha 頻段腦節律振蕩的同步性有顯著的影響，使 alpha 頻段的相位同步顯著降低。
2.2 腦區之間相位同步性的變化
結合以上結果，對 1 Hz rTMS 影響顯著的 alpha 頻段 EEG 信號進一步分析，獲得 1 Hz rTMS 對各腦區之間相位同步程度的影響。首先將大腦劃分為 18 個區域，如圖 2a 所示。使用符號秩和檢驗對 1 Hz rTMS 前后 18 個腦區之間相位同步指數進行統計學檢驗，差異具有統計學意義（P<0.05）的腦區如圖 2b 所示。
從圖 2b 可以看到，1 Hz rTMS 刺激腦初級運動皮層對多個腦區 alpha 頻段節律振蕩的相位同步產生了影響，呈彌散分布。表現為刺激側大腦半球內 alpha 頻段相位同步顯著降低（P<0.05），包括運動區（CL）與額葉（AFL、FL、FCL）、頂葉（CPL、PL）之間。非刺激側大腦半球的頂葉皮層（CPR）與雙側額葉皮層（AFL、FPL、FPR）之間 alpha 頻段相位同步也顯著降低（P<0.05）。
圖2
1 Hz rTMS 對各腦區之間相位同步性的影響
a. 腦區的劃分；b. 相位同步性變化具有統計學意義的腦區
Figure2. The effects of 1 Hz rTMS on phase synchronization among brain regionsa. division of brain regions; b. the brain regions between which the phase synchronization was altered significantly
2.3 腦功能拓撲網絡特性
為了研究 1 Hz rTMS 對相位同步特征構建的大腦功能網絡特性的影響，將 alpha 頻段兩兩電極之間的相位同步指數二值化，獲得大腦功能網絡的拓撲連接。使用平均度、平均最短路徑長度、全局效率及聚類系數評價腦功能連接網絡的全局網絡特征變化，結果如表 1 所示。
從表 1 可以看出，20 min、1 Hz rTMS 刺激初級運動皮層使大腦功能連接網絡的平均度、全局效率、聚類系數降低，平均最短路徑長度增加。統計學檢驗結果顯示，刺激前后腦功能連接網絡的平均度、全局效率、平均最短路徑長度變化具有統計學意義（P<0.05）。
表1
1 Hz rTMS 對 alpha 頻段腦功能網絡特性的影響
Table1.
The effects of 1 Hz rTMS on properties of brain functional network in alpha frequency band
針對表 1 所示的全局網絡特征中差異具有統計學意義的三個網絡拓撲特征，進一步研究 1 Hz rTMS 對腦功能連接網絡中單個節點特性的影響。采用了節點度、最短路徑長度和節點效率進行評價，結果如圖 3 所示。從圖 3 可以看出，1 Hz rTMS 使額葉、運動區及后頂葉腦區的節點度和節點效率降低，最短路徑長度增加。
圖3
1 Hz rTMS 刺激對腦功能網絡各節點特性的影響（“○”代表 P<0.05）
Figure3.
The effects of 1 Hz rTMS on the nodes properties of brain network (“○” indicates P<0.05)
3 討論與結論
本文從腦功能連接、腦區協同工作狀態的角度研究 1 Hz 低頻 rTMS 刺激初級運動皮層時對大腦的影響。研究結果顯示，1 Hz 低頻 rTMS 刺激使 alpha 頻段 EEG 神經節律振蕩的全局相位同步指數顯著降低，使腦功能網絡的平均度、全局效率顯著降低，平均最短路徑長度顯著增加，影響的腦區主要為前額葉、運動區及部分頂葉腦區。
本文使用閉眼靜息態 EEG 探討 1 Hz rTMS 對大腦的影響作用。閉眼靜息態是人體處于安靜清醒時的基線狀態，研究該狀態下的神經活動對了解大腦的神經生理機制及大腦對外界刺激的響應有非常重要的意義。alpha 頻段神經振蕩節律是靜息態 EEG 信號的主要節律，其在認知、感覺、運動、心理感情以及生理過程中扮演著重要的角色。本文研究結果顯示，1 Hz rTMS 刺激初級運動皮層對靜息態 alpha 頻段節律振蕩產生了顯著的影響，使該頻段相位同步指數構建的腦功能網絡平均度和全局效率降低，平均最短路徑長度增加。提示 1 Hz rTMS 使 alpha 頻段網絡的連接性變弱，信息傳輸狀態變差，傳遞效率降低。
已有研究結果表明，rTMS 對大腦的作用依賴于刺激頻率：低頻（≤1 Hz）rTMS 抑制大腦神經活動，高頻（>5 Hz）rTMS 則興奮大腦神經活動[15]。然而，該結果是采用 rTMS 刺激初級運動皮層時，通過分析外周肌肉記錄的 MEP 改變獲得的。MEP 是一個復合指標，反映了皮質脊髓束的興奮性，即不僅包括皮層興奮性，也包括脊髓興奮性，是測量 rTMS 對大腦神經活動影響的間接指標[1]。2014 年，Casula 等[16]使用 TMS-EEG 研究了低頻 rTMS 對大腦 TMS 誘發電位（TMS evoked potentials，TEP）產生的影響。結果顯示低頻 rTMS 使 TEP 的 N100 成分的幅度顯著增加，使用 EEG 直接指標證明了低頻 rTMS 對大腦的抑制作用。本研究從腦功能網絡連接、不同腦區之間協同工作狀態改變的角度進一步證實了低頻 rTMS 對大腦神經活動的抑制作用。
功能解剖學提示：大腦皮層與運動相關的區域從前到后包括前額葉皮層（prefrontal cortex，PFC）、輔助運動區（supplementary motor area，SMA）、前運動區（premotor area，PMA）、初級運動區（primary motor area，M1）、軀體感覺區（somato-sensory area，S1）及后頂葉皮層（posterior parietal cortex，PPC）[17]。前額葉皮層接受導致運動的感覺信號；前運動皮層參與了運動的預備過程，在運動的執行過程中也有一定的參與；后頂葉區負責獲悉身體與外部環境相對位置信息的技能；前額葉皮層、前運動區和輔助運動區參與運動計劃的實施過程，向初級運動皮層發出信息，初級運動皮層產生興奮通過皮質脊髓束傳導到外周肌肉，從而產生運動。本文研究結果表明，1 Hz rTMS 刺激初級運動皮層對大腦神經活動有廣泛的影響，表現在額葉（包括前運動區和輔助運動區）、頂葉皮層及主運動區等多個腦區。因此，低頻 rTMS 可能對運動過程中的空間定位、準備及執行等多個環節產生影響。
神經障礙和精神障礙患者的大腦神經興奮性、各腦區之間的協同工作狀態與健康人存在顯著差異。因此，越來越多的臨床醫生將 rTMS 應用于腦神經活動異常的疾病治療中，將其作為輔助治療手段來改善患者的臨床癥狀。由于高頻 rTMS 具有誘發癲癇等潛在的副作用，低頻 rTMS 成為了較優的選擇。針對目前低頻 rTMS 對大腦活動調控作用研究的不足，本文研究了低頻 rTMS 對腦區之間協同工作狀態的影響，對 rTMS 應用于臨床疾病治療具有潛在的指導意義。
本研究仍有很多不足之處。首先，樣本量較少，本研究結果仍需要進行大樣本的驗證；其次，本研究中受試者均為男性，不能說明性別差異對結果的影響，將來需要募集女性受試者，更加全面地證實 1 Hz 低頻 rTMS 對大腦活動的調控作用；再次，缺乏偽-rTMS 對照組，本文研究了真實-rTMS 對大腦神經活動的影響，未來需要設置偽-rTMS 使實驗更加完善，結果更加可靠；最后，本文研究了 1 Hz 低頻 rTMS 對靜息狀態下的腦神經興奮性的影響，未來需要研究多種腦狀態下對大腦活動的影響作用，為更加準確、全面地了解 1 Hz 低頻 rTMS 對大腦活動的調節作用提供廣泛的實驗數據。
引言
1985 年，英國謝菲爾德大學的 Barker 等[1]利用磁刺激器刺激大腦運動皮層，在對側手部肌肉上成功記錄到了運動誘發電位（motor evoked poten-tials，MEP），引起了世界各國研究者的關注。該項技術被命名為經顱磁刺激（transcranial magnetic stimulation，TMS）。重復經顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）是 TMS 刺激方式的一種。它是采用 TMS 刺激器以一定頻率、一定間隔重復輸出多個脈沖序列，并施加于大腦的特定腦區，可以對大腦神經活動產生干擾，改變大腦神經元的興奮性[2]。研究結果表明，rTMS 對大腦的刺激效果在刺激結束后仍能持續一段時間。目前，rTMS 已經廣泛應用于臨床上神經障礙和精神障礙的治療，包括抑郁癥、阿爾茨海默病、強迫癥等，取得了令人滿意的效果[3-5]。
在 rTMS 技術發展之初，研究者通過記錄外周肌肉的 MEP 間接評估 rTMS 對大腦運動皮層興奮性的影響作用[6]。隨著各種影像技術的發展，功能磁共振成像（functional magnetic resonance ima-ging，fMRI）、腦電（electroencephalography，EEG）等影像技術也開始用于評估 rTMS 對大腦神經活動的調控作用[7-9]。然而，已有的研究主要關注了 rTMS 對局部腦皮層興奮性的作用，而忽略了對腦區之間相互作用、協同工作狀態的影響。2002 年，研究者使用 EEG 評估了 rTMS 對不同腦區之間的調控作用，但是該研究僅僅探討了 rTMS 對左右兩個大腦半球運動腦區之間的調控作用，未考慮對更多腦區之間協同工作狀態的影響[7]。
對于某一特定任務，需要大腦多個腦區之間的協同工作才能完成，因此，不同腦區之間的協同工作狀態、腦區之間的連接特征已成為腦功能研究領域的研究熱點[10]。目前，研究腦區之間相互連接關系廣泛使用的方法是基于圖論的復雜網絡分析方法，即使用圖論理論繪制腦區之間相互連接關系的拓撲圖，稱之為腦網絡連接圖[11]。圖論將一個網絡描述為由節點和邊構成的圖，在基于圖論的 EEG 腦功能網絡分析中，將 EEG 電極作為腦功能網絡的節點，兩兩電極之間的相互關系作為腦功能網絡的邊，通過計算兩兩電極所得 EEG 信號之間的互相關、頻率相干或相位同步等關系特征，設定閾值將 EEG 信號之間的關系二值化，從而確定兩兩電極之間是否存在功能連接性，獲得腦功能網絡的拓撲圖。
本文擬通過記錄可以直接反映神經興奮性的 EEG 信號，分析 1 Hz 低頻 rTMS 刺激大腦初級運動皮層時各腦區之間神經電信號相位同步性的變化。采用基于圖論的腦功能連接方法，從腦功能連接、腦區之間協同工作狀態改變的角度研究 1 Hz rTMS 刺激對大腦功能活動的影響。
1 方法
1.1 實驗條件建立
募集了 10 名健康男性受試者，年齡 21～26 歲，均為在校大學生，無神經或精神系統疾病病史及家族史，MRI 檢測未發現顱內病變。使用愛丁堡利手判定準則，測定所有受試者均為右利手。所有受試者在實驗前 48 h 內沒有服用咖啡、白酒等刺激性飲品，實驗前保證了充足的睡眠。受試者均簽署了知情同意書，自愿參加實驗。
rTMS 使用英國生產的 magstim rapid2 磁刺激器，刺激線圈使用與該磁刺激器匹配的 70 mm 八字線圈。試驗前掃描了所有受試者的頭部 MRI 影像，通過 brainsight 精密導航系統軟件重建個體化的立體頭模型，利用追蹤球將 TMS 刺激線圈與導航中的虛擬線圈進行配準，然后將受試者頭部與該頭模型進行配準，保證實驗過程中 rTMS 刺激時刺激位置和刺激方向的精確性與一致性。
為了確定各受試者 rTMS 刺激時的刺激強度，使用肌電記錄系統采集手部肌肉的肌電 MEP 來確定受試者個體的刺激閾值。本研究使用意大利 micromed 多通道生理信號記錄儀采集右手第一骨間背側肌的肌電信號，兩個肌電記錄電極相距 2 cm，地電極放置在右手豌豆骨上。肌電系統的采樣率為 32 768 Hz。EEG 采集使用美國 neuroscan 系統和 64 導 easycap EEG 帽，包括 62 導記錄電極、一個地電極及一個參考電極，其中 2 個記錄電極分別放置于眼睛下部和眼外眥處，用于采集垂直方向眼電和水平方向眼電，為后續 EEG 數據處理時眼電的去除提供數據支持。EEG 采集參數設置為 DC～200 Hz 的濾波，1 000 Hz 采樣率。
1.2 試驗設計與刺激參數
rTMS 對大腦興奮性的影響依賴于刺激頻率，低頻產生抑制神經活動的作用，高頻產生興奮神經活動的作用。1 Hz 低頻 rTMS 在臨床上已廣泛應用于皮層興奮性異常增加的患者[12]。rTMS 對腦的影響作用在刺激結束后持續一段時間，且持續時間與 rTMS 的刺激時間相關[13]。本研究采用 1 Hz rTMS 刺激腦運動區 20 min，通過分析 rTMS 前后的 EEG 信號，獲得 rTMS 對腦功能網絡拓撲特性的影響。
試驗前，首先使用單脈沖 TMS 確定受試者的個體運動閾值和手初級運動皮層。刺激線圈保持與頭皮相切，線圈把柄向后，并與大腦縱裂呈 45°。根據解剖學上大腦初級運動皮層的位置，以中央前回的“手結”為中心移動線圈，尋找以最小 TMS 輸出時，10 次 TMS 中至少存在 5 次肌電 MEP 幅值大于等于 50 μV 的皮層位置點，此時的 TMS 輸出強度為該受試者的靜息運動閾值（resting motor threshold，RMT），該皮層位置點為手初級運動皮層。
試驗中，rTMS 的刺激頻率為 1 Hz，刺激強度為 90% RMT，刺激靶點為右手對應的初級運動皮層，采用與確定 RMT 時相同的線圈放置方式，刺激時間為 20 min，共 1 200 個脈沖。分別在 rTMS 刺激前后采集 1 min 閉目靜息狀態的 EEG 信號。
1.3 相位同步分析
研究認為，神經網絡的同步振蕩可能是大腦對信息進行整合和處理的潛在機制。使用 EEG 檢測神經電信號活動，通過計算不同腦區神經電信號的同步關系，可以獲得大腦信息交流的狀態。EEG 相位同步是研究不同腦區之間同步關系的方法之一，其描述的是兩導 EEG 信號之間的相位關系。在使用中，通常將相位的同步關系歸一化，得到相位同步指數。EEG 相位同步在描述神經網絡和大尺度神經活動整合的同步結構中具有非常重要的作用。
本研究采用希爾伯特（Hilbert）變換提取不同電極 EEG 信號的相位信息，從而獲得不同頻段下兩兩電極之間的相位同步性。對時間連續的一導 EEG 信號 x（t），它的 Hilbert 變換為：
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又定義信號 x（t）的解析信號為：
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從而獲得該電極 EEG 信號的幅度信息
和相位信息
。對另一導 EEG 信號 y（t）做同樣處理，相應得到 y（t）的幅度信息
和相位信息
，假定 x 和 y 的相位鎖定比為 n:m（n、m 為整數，一般取 n=m=1），則定義兩個解析信號的相位差為：
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相位同步指數 γH[14]定義為：
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其中
表示時間平均。γH取值范圍為 [0，1]，當 γH=0 時，兩個信號無同步，當 γH=1 時，兩個信號具有穩定的相位差。
1.4 構建網絡及網絡特征
設定閾值，對兩兩電極之間的相位同步指數進行二值化處理，構建腦功能連接的二值矩陣，具體為：
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式中，T 為閾值。本文閾值的選取原則為使腦功能網絡滿足連通性的最大值。
為了獲得 1 Hz rTMS 對大腦功能網絡拓撲結構的影響，分析了大腦功能網絡的拓撲特征，包括平均度、平均最短路徑長度、全局效率、聚類系數四個網絡屬性度量指標。
節點度定義為與該節點相關聯的總邊數，即通過該節點的邊的數量，也等于該節點擁有的鄰節點個數。節點的度值越大，意味著該節點在網絡中的地位越重要。計算公式如式（6）所示。
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平均度為網絡中所有節點度的平均值，計算公式如式（7）所示。
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最短路徑是指網絡中某一節點的信息到達另一節點的最優路徑，描述了網絡的信息傳輸狀態，其長度越短，信息傳輸越快，網絡的效率越高。兩個節點 i、j 之間邊數最少的一條通路稱為這兩點之間的最短路徑，該路徑所經過的邊的數目即為節點 i、j 之間的最短路徑長度。整個網絡的平均最短路徑長度為任意兩個節點之間最短路徑長度的平均值，計算公式如式（8）所示。
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節點效率是指網絡中某一節點與其他節點之間最短路徑長度倒數的平均值，是衡量信息在網絡中傳遞快慢的綜合指標，網絡的節點效率越大，則信息傳遞效果越強。全局效率則是整個網絡最短路徑長度倒數的平均值，計算公式如式（9）所示。
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聚類系數是衡量網絡集團化程度的一個重要參數，表示某一個節點 i 的鄰居間互為鄰居的可能，計算公式如式（10）所示。
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1.5 數據處理
使用 Matlab 及其工具包 EEGLAB 對采集的 EEG 信號進行分析。首先對數據進行預處理，包括變參考為雙耳乳突，手動去除干擾大的 EEG 信號段，降采樣到 250 Hz，進行[1 Hz，100 Hz]的帶通濾波及 50 Hz 陷波，采用獨立分量分析去除眼動干擾，從而獲得干凈的 EEG 信號。
選取 50 s 干凈的 EEG 信號進行后續處理。通過帶通濾波提取 EEG 信號的不同頻段，包括 delta（1～4 Hz）、theta（4～8 Hz）、alpha（8～13 Hz）、beta（13～30 Hz）、gamma1（30～45 Hz）和 gamma2（55～100 Hz）。然后，對所有電極進行兩兩電極之間相位同步指數的計算，設定閾值，獲得大腦相位同步指數的二值化矩陣，構建腦功能網絡并計算網絡特征。最后使用符號秩和檢驗進行統計學分析，P<0.05 認為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 全局相位同步指數
為了評價 1 Hz rTMS 對大腦不同頻段神經節律信號相位同步特征的影響，使用相位同步方法計算 rTMS 前后兩兩電極之間的相位同步指數。將所有電極之間的相位同步指數加和平均，得到全局相位同步（global phase synchronization，GPS）指數，如圖 1 所示。
圖1
1 Hz rTMS 對全局相位同步指數的影響
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從圖 1 可以看出，1 Hz rTMS 刺激初級運動皮層使 delta、alpha、gamma1 和 gamma2 頻段的 GPS 呈降低趨勢。符號秩和檢驗結果顯示，alpha 頻段的 GPS 變化具有統計學意義（P<0.05）。表明 1 Hz rTMS 刺激初級運動皮層對 alpha 頻段腦節律振蕩的同步性有顯著的影響，使 alpha 頻段的相位同步顯著降低。
2.2 腦區之間相位同步性的變化
結合以上結果，對 1 Hz rTMS 影響顯著的 alpha 頻段 EEG 信號進一步分析，獲得 1 Hz rTMS 對各腦區之間相位同步程度的影響。首先將大腦劃分為 18 個區域，如圖 2a 所示。使用符號秩和檢驗對 1 Hz rTMS 前后 18 個腦區之間相位同步指數進行統計學檢驗，差異具有統計學意義（P<0.05）的腦區如圖 2b 所示。
從圖 2b 可以看到，1 Hz rTMS 刺激腦初級運動皮層對多個腦區 alpha 頻段節律振蕩的相位同步產生了影響，呈彌散分布。表現為刺激側大腦半球內 alpha 頻段相位同步顯著降低（P<0.05），包括運動區（CL）與額葉（AFL、FL、FCL）、頂葉（CPL、PL）之間。非刺激側大腦半球的頂葉皮層（CPR）與雙側額葉皮層（AFL、FPL、FPR）之間 alpha 頻段相位同步也顯著降低（P<0.05）。
圖2
1 Hz rTMS 對各腦區之間相位同步性的影響
a. 腦區的劃分；b. 相位同步性變化具有統計學意義的腦區
Figure2. The effects of 1 Hz rTMS on phase synchronization among brain regionsa. division of brain regions; b. the brain regions between which the phase synchronization was altered significantly
2.3 腦功能拓撲網絡特性
為了研究 1 Hz rTMS 對相位同步特征構建的大腦功能網絡特性的影響，將 alpha 頻段兩兩電極之間的相位同步指數二值化，獲得大腦功能網絡的拓撲連接。使用平均度、平均最短路徑長度、全局效率及聚類系數評價腦功能連接網絡的全局網絡特征變化，結果如表 1 所示。
從表 1 可以看出，20 min、1 Hz rTMS 刺激初級運動皮層使大腦功能連接網絡的平均度、全局效率、聚類系數降低，平均最短路徑長度增加。統計學檢驗結果顯示，刺激前后腦功能連接網絡的平均度、全局效率、平均最短路徑長度變化具有統計學意義（P<0.05）。
表1
1 Hz rTMS 對 alpha 頻段腦功能網絡特性的影響
Table1.
The effects of 1 Hz rTMS on properties of brain functional network in alpha frequency band
針對表 1 所示的全局網絡特征中差異具有統計學意義的三個網絡拓撲特征，進一步研究 1 Hz rTMS 對腦功能連接網絡中單個節點特性的影響。采用了節點度、最短路徑長度和節點效率進行評價，結果如圖 3 所示。從圖 3 可以看出，1 Hz rTMS 使額葉、運動區及后頂葉腦區的節點度和節點效率降低，最短路徑長度增加。
圖3
1 Hz rTMS 刺激對腦功能網絡各節點特性的影響（“○”代表 P<0.05）
Figure3.
The effects of 1 Hz rTMS on the nodes properties of brain network (“○” indicates P<0.05)
3 討論與結論
本文從腦功能連接、腦區協同工作狀態的角度研究 1 Hz 低頻 rTMS 刺激初級運動皮層時對大腦的影響。研究結果顯示，1 Hz 低頻 rTMS 刺激使 alpha 頻段 EEG 神經節律振蕩的全局相位同步指數顯著降低，使腦功能網絡的平均度、全局效率顯著降低，平均最短路徑長度顯著增加，影響的腦區主要為前額葉、運動區及部分頂葉腦區。
本文使用閉眼靜息態 EEG 探討 1 Hz rTMS 對大腦的影響作用。閉眼靜息態是人體處于安靜清醒時的基線狀態，研究該狀態下的神經活動對了解大腦的神經生理機制及大腦對外界刺激的響應有非常重要的意義。alpha 頻段神經振蕩節律是靜息態 EEG 信號的主要節律，其在認知、感覺、運動、心理感情以及生理過程中扮演著重要的角色。本文研究結果顯示，1 Hz rTMS 刺激初級運動皮層對靜息態 alpha 頻段節律振蕩產生了顯著的影響，使該頻段相位同步指數構建的腦功能網絡平均度和全局效率降低，平均最短路徑長度增加。提示 1 Hz rTMS 使 alpha 頻段網絡的連接性變弱，信息傳輸狀態變差，傳遞效率降低。
已有研究結果表明，rTMS 對大腦的作用依賴于刺激頻率：低頻（≤1 Hz）rTMS 抑制大腦神經活動，高頻（>5 Hz）rTMS 則興奮大腦神經活動[15]。然而，該結果是采用 rTMS 刺激初級運動皮層時，通過分析外周肌肉記錄的 MEP 改變獲得的。MEP 是一個復合指標，反映了皮質脊髓束的興奮性，即不僅包括皮層興奮性，也包括脊髓興奮性，是測量 rTMS 對大腦神經活動影響的間接指標[1]。2014 年，Casula 等[16]使用 TMS-EEG 研究了低頻 rTMS 對大腦 TMS 誘發電位（TMS evoked potentials，TEP）產生的影響。結果顯示低頻 rTMS 使 TEP 的 N100 成分的幅度顯著增加，使用 EEG 直接指標證明了低頻 rTMS 對大腦的抑制作用。本研究從腦功能網絡連接、不同腦區之間協同工作狀態改變的角度進一步證實了低頻 rTMS 對大腦神經活動的抑制作用。
功能解剖學提示：大腦皮層與運動相關的區域從前到后包括前額葉皮層（prefrontal cortex，PFC）、輔助運動區（supplementary motor area，SMA）、前運動區（premotor area，PMA）、初級運動區（primary motor area，M1）、軀體感覺區（somato-sensory area，S1）及后頂葉皮層（posterior parietal cortex，PPC）[17]。前額葉皮層接受導致運動的感覺信號；前運動皮層參與了運動的預備過程，在運動的執行過程中也有一定的參與；后頂葉區負責獲悉身體與外部環境相對位置信息的技能；前額葉皮層、前運動區和輔助運動區參與運動計劃的實施過程，向初級運動皮層發出信息，初級運動皮層產生興奮通過皮質脊髓束傳導到外周肌肉，從而產生運動。本文研究結果表明，1 Hz rTMS 刺激初級運動皮層對大腦神經活動有廣泛的影響，表現在額葉（包括前運動區和輔助運動區）、頂葉皮層及主運動區等多個腦區。因此，低頻 rTMS 可能對運動過程中的空間定位、準備及執行等多個環節產生影響。
神經障礙和精神障礙患者的大腦神經興奮性、各腦區之間的協同工作狀態與健康人存在顯著差異。因此，越來越多的臨床醫生將 rTMS 應用于腦神經活動異常的疾病治療中，將其作為輔助治療手段來改善患者的臨床癥狀。由于高頻 rTMS 具有誘發癲癇等潛在的副作用，低頻 rTMS 成為了較優的選擇。針對目前低頻 rTMS 對大腦活動調控作用研究的不足，本文研究了低頻 rTMS 對腦區之間協同工作狀態的影響，對 rTMS 應用于臨床疾病治療具有潛在的指導意義。
本研究仍有很多不足之處。首先，樣本量較少，本研究結果仍需要進行大樣本的驗證；其次，本研究中受試者均為男性，不能說明性別差異對結果的影響，將來需要募集女性受試者，更加全面地證實 1 Hz 低頻 rTMS 對大腦活動的調控作用；再次，缺乏偽-rTMS 對照組，本文研究了真實-rTMS 對大腦神經活動的影響，未來需要設置偽-rTMS 使實驗更加完善，結果更加可靠；最后，本文研究了 1 Hz 低頻 rTMS 對靜息狀態下的腦神經興奮性的影響，未來需要研究多種腦狀態下對大腦活動的影響作用，為更加準確、全面地了解 1 Hz 低頻 rTMS 對大腦活動的調節作用提供廣泛的實驗數據。
