利用核酸擴增系統完成聚合酶鏈式反應（PCR）是特定基因片段進行擴增的主要途徑。核酸擴增系統在升降溫過程中反應樣本與系統熱源溫度之間存在著較大延遲，這導致擴增過程中樣本到達指定溫度需要較長時間，降低了整體的反應速率；而且由于擴增過程易產生非特異性產物，樣本溫度長時間未到指定溫度會增大非特異性產物生成率，降低反應的擴增效率。本文根據氣浴式核酸擴增系統工作原理和Smart-cycler PCR儀特性設計了微型化氣浴式核酸擴增系統，分析系統熱量傳遞過程并計算樣本空氣熱量傳遞時間，對實際擴增中樣本與空氣溫度進行實時測量擬合溫度曲線。依據測量和計算結果選擇系統加熱時間并通過改變空氣溫度記錄不同溫度下樣本溫度曲線，選擇最優的樣本溫度曲線優化系統延遲。優化后擴增過程所需時間縮短為原來的50%，通過對單增李斯特菌進行擴增實驗顯示系統可在4 min內完成3個擴增循環，擴增效果良好。優化樣本與空氣的溫度延遲可以有效提高擴增速度和擴增效果。
引用本文： 吳金龍, 杜耀華, 陳鋒, 喬龍學, 韋婧, 吳太虎. 基于氣浴式核酸擴增的系統樣本與空氣溫度延遲分析和優化. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(6): 1067-1074. doi: 10.7507/1001-5515.20160171 復制
引言
聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)[1-3]是20世紀末分子生物學領域的重大成果，通過94 ℃變性、55 ℃退火和72 ℃延伸三個不同階段的溫度循環，特定DNA片段呈鏈式反應般復制生成大量產物。由于PCR技術對樣本純度要求低且具有反應速度快、特異性強等優點，在遺傳疾病檢測[4-6]、食品安全檢測以及生物反恐[7-8]等領域得到了廣泛的應用。核酸擴增系統是完成PCR的核心部分，通過控制系統內部溫度變化，進而完成擴增所需變性、退火和延伸三個步驟的不斷循環，促使PCR的進行。作為主流核酸擴增系統之一，氣浴式核酸擴增系統因其升降溫速度快、溫度均勻性好以及易維護等優點被廣泛應用于實驗室研究、病原體檢測等場合。
氣浴式核酸擴增系統主要工作原理如下(見圖 1)：系統利用風機將冷空氣導入反應腔，當冷空氣流過熱源時被加熱為高溫熱空氣。反應腔內部的離心攪拌裝置工作，促使熱空氣均勻地與周圍的反應管進行強制對流換熱，系統通過改變熱源的功率實現樣本溫度的變化從而完成變性、退火和延伸三個反應階段[9]。
圖1
氣浴式核酸擴增系統原理圖
Figure1.
Schematic diagram of nucleic acid amplification system heated by air
核酸擴增系統發展多年，快速化一直是研究熱點。以氣浴式核酸擴增系統為例，提高擴增速度的常規方法主要有2類：① 改變系統結構；② 提高系統功率。改變系統結構主要通過優化空氣流動方式，降低其在系統內部流動的能量損失以保證空氣與反應管對流換熱強度，提高整體換熱系數進而提高擴增速度；提高系統功率主要通過增大熱源或者風機功率直接提高空氣與反應管的對流換熱強度進而改善擴增速度。上述解決方案均能夠提升系統的擴增速度，但是擴增中因反應樣本與熱源存在較大溫度延遲而導致的額外擴增時間過大的問題一直未能解決(見圖 2)，這導致樣本擴增仍然需要浪費較長時間到達指定溫度，降低了整個擴增過程的速度。樣本在擴增過程中不可避免地會產生非特異性產物，長時間未到達指定溫度還會導致擴增過程中非特異性產物的產生率升高，降低了整體擴增效率[10]。
圖2
樣本、熱源溫度延遲示意圖
Figure2.
Schematic diagram of temperature delay between sample and air
針對系統樣本與熱源溫度延遲的問題，本文對系統樣本與熱源換熱過程進行分析，總結樣本與熱源溫度延遲與系統各參數的關系，計算熱量傳遞時間常數；設計微型模塊化氣浴式核酸擴增系統對系統樣本與熱源的溫度延遲進行實際測量，根據理論分析和實際測量結果對熱空氣加熱時間和熱空氣溫度進行優化，降低樣本與熱源的溫度延遲，提高擴增速度和擴增效率。
1 系統換熱過程分析和計算
氣浴式核酸擴增系統內部熱量轉換主要包括空氣與電熱絲的強制對流換熱，加熱后空氣與反應管壁在攪拌風機的作用下的強制對流換熱，反應管外壁與內壁的導熱以及樣本與反應管內壁的自然對流換熱。在冷空氣經電熱絲加熱后到與反應管換熱前空氣會損失部分無法計算的熱能和動能，且在核酸擴增系統中溫度反饋為熱空氣溫度值，因此忽略這部分換熱過程的計算，僅對對熱空氣與樣本之間的換熱過程進行分析，優化樣本與空氣的溫度延遲。根據換熱強化與削弱理論，強化換熱需從對流換熱和輻射換熱著手，而削弱傳熱需通過導熱進行，因此本研究主要對空氣與反應管外壁以及反應管內壁與樣本對流換熱這兩種能量傳遞過程進行分析并計算換熱時間常數τ。
1.1 空氣與反應管外壁換熱時間常數分析
令熱空氣溫度為tw1，工作環境溫度為tf1，依據流體橫掠管模型[11]對反應管與熱空氣之間的換熱進行分析。反應管當量直徑有：
| $d=\frac{4A}{P}$ |
式中A為反應管截面積，P為潤濕周長。定性溫度tm1為：
| ${{t}_{m1}}=\frac{{{t}_{f1}}+{{t}_{w1}}}{2}$ |
依據定性溫度查詢標準大氣壓下干空氣的物性參數有導熱系數λ1、運動黏度υ1、普朗特準則Pr1。通道內部氣流速度u則有：
| $R{{e}_{1}}=\frac{ud}{{{\upsilon }_{1}}}$ |
對本文對流換熱模型Nu數進行計算：
| $N{{u}_{1}}=0.3+\frac{0.62R{{e}^{1/2}}P{{r}^{1/3}}}{{{[1+{{(0.4/Pr)}^{2/3}}]}^{1/4}}}\left[ 1+{{\left( {{\frac{Re}{28200}}^{5/8}} \right)}^{4/5}} \right]$ |
根據Nu數求取熱空氣橫掠反應管的對流換熱系數h1：
| ${{h}_{1}}=\frac{N{{u}_{1}}\cdot {{\lambda }_{1}}}{d}$ |
查詢石英玻璃的導熱系數有λ0，由于擴增的升降溫過程中溫度大部分時間不斷變化，可將這階段核酸擴增系統視作非穩態導熱。對熱空氣與反應管壁傳熱過程畢渥數(Bi)進行計算：
| $B{{i}_{1}}=\frac{{{h}_{1}}{{\delta }_{1}}}{{{\lambda }_{0}}}$ |
式中δ1為反應管管壁厚度。
若Bi1＜0.1，可使用集中參數法對其導熱過程時間常數進行計算：
| $\frac{{{h}_{1}}A}{\rho CV}\tau =B{{i}_{1}}\cdot F{{o}_{1}}$ |
| $\frac{\theta }{{{\theta }_{0}}}=exp(-B{{i}_{1}}\cdot F{{o}_{1}})$ |
式中ρ為石英反應管密度，C為反應管比熱容，A和V分別代表熱空氣接觸反應管管壁面積和體積，Fo1為傅里葉數。對其傳熱時間進行計算：
| $\frac{\theta }{{{\theta }_{0}}}=\frac{{{t}_{1}}-{{t}_{w1}}}{{{t}_{f1}}-{{t}_{w1}}}$ |
式中t1為管壁加熱后溫度，則有
| $\frac{\theta }{{{\theta }_{0}}}=exp(-\frac{{{h}_{1}}A}{\rho CV}{{\tau }_{1}})$ |
可知空氣將熱量傳遞至反應管的時間常數τ1。
若Bi1＞0.1，可采用圖線法進行求解。反應管壁可視作平板模型，根據式(9)求得無量綱過余溫度，依據無量綱過余溫度和Bi數求得Fo。查詢該定性溫度下空氣運動粘度a1。根據
| ${{\tau }_{1}}=Fo\frac{{{\delta }_{1}}}{a_{1}^{2}}$ |
可知空氣將熱量傳遞至反應管壁的時間常數τ1。
1.2 反應管內壁與樣本換熱時間常數分析
對反應管與樣本傳熱時間進行分析，試管內部可將其傳熱模型視作有限空間內自然對流換熱，取反應管壁溫度tw2，樣本溫度tf2，可設定性溫度為：
| $~{{t}_{m2}}=\frac{{{t}_{w2}}+{{t}_{f2}}}{2}$ |
查詢標準大氣壓下飽和水物性參數有導熱系數λ2、運動黏度υ2、普朗特準則Pr2，反應管夾層厚為1 mm，根據格拉曉夫數(Gr)計算準則：
| $Gr=\frac{g{{\alpha }_{V}}\Delta t\delta _{2}^{3}}{\upsilon _{2}^{2}}$ |
根據Gr數計算豎夾層下有限空間自然對流Nu數：
| $N{{u}_{2}}=0.179{{(GrP{{r}_{2}})}^{0.25}}{{\left( \frac{H}{{{\delta }_{2}}} \right)}^{-1/9}}$ |
計算反應樣本與反應管壁對流換熱系數h2：
| ${{h}_{2}}=\frac{N{{u}_{2}}{{\lambda }_{2}}}{{{\delta }_{2}}}$ |
對反應管壁與樣本傳熱過程Bi數進行計算：
| $B{{i}_{2}}=\frac{{{h}_{2}}{{\delta }_{1}}}{{{\lambda }_{0}}}$ |
若Bi2＜0.1，用集中參數法求取傳熱過程時間常數：
| $\frac{{{h}_{2}}A}{\rho CV}\tau =B{{i}_{2}}\cdot F{{o}_{2}}$ |
| $\frac{\theta }{{{\theta }_{0}}}=exp(-B{{i}_{2}}\cdot F{{o}_{2}})$ |
| $\frac{\theta }{{{\theta }_{0}}}=\frac{{{t}_{2}}-{{t}_{w2}}}{{{t}_{f2}}-{{t}_{w2}}}$ |
式中t2為樣本加熱后溫度，則有：
| $\frac{\theta }{{{\theta }_{0}}}=exp(-\frac{{{h}_{2}}A}{\rho CV}{{\tau }_{2}})$ |
可知管壁將熱量傳遞至樣本的時間常數τ2。
若Bi2＞0.1，可采用圖線法進行求解。根據式(18)求得無量綱過余溫度，依據無量綱過余溫度和Bi2求得Fo2。查詢該定性溫度下飽和水運動粘度a2，則有：
| ${{\tau }_{2}}=Fo\frac{{{\delta }_{1}}}{a_{2}^{2}}$ |
可知反應管壁將熱量傳遞至樣本的時間常數τ2。
實際擴增中，空氣溫度通過改變熱源功率進行控制，其溫度隨時間逐步上升，因此計算核酸擴增系統中熱量傳遞時間可采用微分離散方法，分別計算不同溫差下熱量傳遞時間。對運行的氣浴式核酸擴增系統空氣與樣本溫度進行測量得出溫差與時間曲線，記錄空氣變化時間，擬合樣本與空氣的溫度時間變化關系式并代入到時間常數計算中，通過積分即可估算出熱量傳遞時間。綜上可知，氣浴式核酸擴增系統熱量傳遞時間t無論是利用集中參數法還是圖解法都與無量綱過余溫度有關，即空氣與樣本的溫差越大，樣本與熱源之間溫度延遲越低。此外，τ還與對流換熱系數、反應管與空氣接觸面積體積比有關，但改善對流換熱系數或反應管與空氣的面積體積比均需要對結構進行優化，而結構的改變會引起諸如流體壓降變化、能量耗損的變化等其他情況，而改變溫差僅需要改變控制程序即可實現。因此本文選用增大空氣與樣本溫差的方法降低兩者之間的延遲，優化整個擴增過程。
2 實驗平臺搭建
根據氣浴式核酸擴增系統工作原理[12]和Cephid公司的Smart-cycler工作特點[13]，本文設計了微型模塊化氣浴式核酸擴增系統。以單個模塊(見圖 3)為實驗對象，主要部件包括80 mm×20 mm×40 mm(長×寬×高)矩形反應腔，高寬比為2:1有利于降低空氣流動的摩擦壓降[14]；規格為30 mm×30 mm×15 mm(高×寬×厚)的軸流風機作為空氣動力源；20 W鐵烙鋁電熱絲作為系統熱源，置于反應腔中部；20 mm×40 mm×3 mm(寬×高×厚)的泡沫銅網[15-16]置于反應腔后半部使熱空氣均勻流向1.2 mm×1.2 mm×30 mm(長×寬×高)石英反應管。該模塊工作原理如下：軸流風機啟動，冷空氣流入至反應腔與鐵烙鋁電熱絲進行強制對流換熱，加熱后的空氣經過泡沫銅網后均勻流向反應管。改變電熱絲的功率可以間接完成樣本變性、退火和延伸三個過程。
圖3
單模塊氣浴式核酸擴增系統
Figure3.
Single module system of nucleic acid amplification heated by air
3 實驗結果與討論
3.1 加熱時間選擇
為了選擇合理的溫差改善單模塊氣浴式核酸擴增系統樣本與空氣溫度延遲的問題，實驗中需對加熱時間進行選擇。對核酸擴增系統內部反應管液體溫度和管附近空氣溫度進行實時測量，得出溫差與空氣溫度變化時間的關系式并記錄系統各階段樣本與空氣的實際溫度延遲[17-18]。令實際延遲為t延，實驗過程空氣持續加熱時間為t加。由于在理論計算中忽略能量損失，因此傳熱理論時間τ小于實際延遲t延；為了保證擴增過程樣本溫度過沖，加熱時間t加應小于實際延遲t延；為了保證樣本溫度可以到達各階段溫度點，加熱時間t加應大于傳熱理論時間τ，因此有τ＜t加＜t延。實驗中，利用與反應管平行放置的T型熱電偶實時測量熱空氣溫度，利用IT-23可植入微探針插入反應管實時測量樣本溫度[見圖 4(a)]，將測量數據導入至上位機利用ORIGIN作出樣本與熱空氣各階段的溫度曲線和樣本循環溫度曲線(見圖 5)。依據所測數據擬合升溫至變性、降溫至退火以及升溫至延伸三個階段樣本和空氣溫差與空氣溫度變化時間的關系式。
圖4
溫度測量示意圖
(a)可植入探針位置；(b)實驗平臺
Figure4. Schematic diagram of temperature measurement(a) probe location; (b) experimental platform
圖5
升降溫過程熱空氣與樣本液體溫度曲線
(a)升溫至變性；(b)降溫至退火；(c)升溫至延伸；(d)樣本循環
Figure5. Temperature retard between sample and air in the progress of heating and cooling(a) heating to denaturation; (b) cooling to annealing; (c) heating to extension; (d) sample cycling
由圖 5(a)可知，單模塊氣浴式核酸擴增系統在延伸升溫至變性階段，空氣溫度在4.2 s左右升至變性溫度，樣本溫度在16.2 s升至變性溫度，實際延遲約為12 s。空氣溫度T隨時間t變化關系式：
| $T=75.65+9.10t-1.53{{t}^{2}}+0.11{{t}^{3}}-0.003{{t}^{4}}$ |
樣本溫度T隨時間t變化關系式：
| $T=73.91-0.35t+0.43{{t}^{2}}-0.03{{t}^{3}}+0.0006{{t}^{4}}$ |
由圖 5(b)可知，單模塊氣浴式核酸擴增系統在變性降溫至退火階段，空氣溫度在8.1 s降至退火溫度，樣本在37.5 s左右降至退火溫度，實際延遲約為29.4 s。空氣溫度T隨時間t變化式為：
| $T=98.40-9.39t+0.68{{t}^{2}}-0.02{{t}^{3}}+0.0002{{t}^{4}}$ |
樣本溫度T隨時間t變化關系式：
| $T=94.39-2.83t+0.075{{t}^{2}}-0.000\text{ }8{{t}^{3}}$ |
由圖 5(c)可知，單模塊氣浴式核酸擴增系統在退火升溫至延伸階段，空氣溫度5.1 s達到延伸溫度，但是伴有1 ℃左右的過沖，樣本11.7 s達到延伸溫度，實際延遲約為6.6 s。空氣溫度T隨時間t變化式為：
| $T=55.63+4.35t-0.02{{t}^{2}}-0.06{{t}^{3}}+0.003\text{ }7{{t}^{4}}$ |
樣本溫度T隨時間t變化關系式：
| $T=55.65+5.02t-0.68{{t}^{2}}+0.044{{t}^{3}}-0.001{{t}^{4}}$ |
由圖 5(d)可知，在控制樣本溫度到達變性、退火和延伸溫度并根據擴增需求恒溫保持的情況下，完成一次擴增所需時間約為3 min。
查詢風扇參數計算空氣流速有u為7.3 m/s，根據熱空氣溫度與實驗環境溫度選擇空氣物性參數，導熱系數λ1為2.912×10-2 W·m-1·K-1，運動黏度υ1為18.98×10-6 m2·s-1，普朗特準則Pr1為0.695 6。 水物性參數有λ2為65.9×10-2 W·m-1·K-1，運動黏度υ2為0.478×10-6 m2·s-1，普朗特準則Pr2為2.99，石英玻璃導熱系數λ為1.46 W·m-1·K-1。將各參數代入各求解式有h1為273.4 W·m-2·K-1，h2為1 041.22 W·m-2·K-1。對空氣傳熱至反應管壁以及反應管壁傳遞至樣本過程進行計算，可知Bi1、Bi2均小于0.1，因此用集中參數法進行計算。換熱時間有：
| ${{\tau }_{1}}=\frac{ln\left( \frac{{{t}_{1}}-{{t}_{w1}}}{{{t}_{f1}}-{{t}_{w1}}} \right)}{-1.85}$ |
| ${{\tau }_{1}}=\frac{ln\left( \frac{{{t}_{2}}-{{t}_{w2}}}{{{t}_{f2}}-{{t}_{w2}}} \right)}{-7.06}$ |
將式(22)~(27)分別代入到式(28)(29)，對空氣溫度變化時間進行積分可得從延伸升溫至變性階段τ1和τ2分別為4.6 s和1.2 s；退火升溫至延伸階段τ1和τ2分別為4.2 s和1.1 s。同理可以求得從變性降溫至退火階段τ1和τ2分別為17.8 s和4.7 s。 由于熱量從空氣傳遞至管壁與管壁傳遞至樣本在同時進行，因此選取同一變溫階段τ1、τ2較大值作為理論的熱量傳遞時間τ，可知降溫至退火為17.8 s，升溫至延伸為4.2 s，升溫至變性為4.6 s。由前述分析可知，τ＜t加＜t延，而為了保證同一加熱時間不引起樣本溫度過沖，t加應處于理論延遲最小值和實際延遲最小值之間，即4.2 s＜t加＜6.6 s。為了簡化實驗和數據處理過程，文中選擇t加=5 s對核酸擴增系統進行空氣溫度優化實驗。
3.2 空氣溫度優化
依據加熱時間的選擇，對系統溫度控制進行優化，不同擴增階段選擇不同溫度對單模塊氣浴式核酸擴增系統進行實驗，通過樣本溫度隨時間變化曲線選擇最優加熱或者冷卻溫度。在延伸升溫至變性階段，分別設置空氣溫度為100、105、115、120 ℃，利用可植入探針實時測量樣本溫度，根據測量數據得到變化曲線如圖 6所示。
圖6
變性階段過沖溫度測試
Figure6.
Temperature test in denaturation
由圖 6可知，樣本到達變性溫度所需時間隨著加熱溫度增大而縮短。在100、105、115、120 ℃時，樣本到達變性時間分別為9.8、8.9、6.4、5.4 s。在設定加熱空氣溫度為115 ℃時，樣本升溫較快且僅存在0.6 ℃過沖溫度；而當設定溫度為120 ℃時，樣本溫度曲線出現了約2.5 ℃過沖。因此選擇115 ℃為加熱溫度對延伸升溫至變性階段的樣本與空氣溫度的延遲進行優化。
從變性階段降溫至退火，分別設置冷卻溫度為50、45、40、35 ℃，樣本溫度隨時間變化曲線如圖 7所示。由圖 7可知，在不同冷卻溫度下樣本到達退火溫度所需時間分別為28.5、22.3、19.4、12.9 s。設定溫度為35 ℃時樣本降溫最快，但在此過程中樣本溫度出現了3 ℃左右的過沖，因此選擇40 ℃為冷卻溫度對變性降溫至退火過程樣本與空氣溫度的延遲進行優化。
圖7
退火階段過沖溫度測試
Figure7.
Temperature test in annealing
從退火階段升溫至延伸分別設置空氣溫度為75、80、85、90 ℃，樣本溫度隨時間變化曲線如圖 8所示。由圖 8可知，樣本到達延伸溫度所需時間分別為6.0、8.1、9.2、10.2 s，但是在設定溫度為90 ℃時，樣本出現了1 ℃左右的過沖。因此選擇85 ℃為加熱溫度對退火升溫至延伸階段樣本與空氣溫度的延遲進行優化。
圖8
延伸階段過沖溫度測試
Figure8.
Temperature test in extension
結合以上不同擴增階段過沖溫度測試結果可知：擴增過程中保持過沖時間為5 s，升溫至變性階段選擇最優加熱溫度為115 ℃，降溫至退火階段選擇最優冷卻溫度為40 ℃；升溫至延伸階段選擇最優加熱溫度為85 ℃，對優化后單模塊氣浴式核酸擴增系統樣本溫度進行實時測量，系統運行3個擴增循環，樣本溫度循環曲線如圖 9所示。
圖9
優化后樣本溫度循環
Figure9.
Sample temperature cycle after optimizing
由圖 9可知優化后樣本升降溫速度有明顯改善，在240 s內可完成三次擴增，與圖 5(d)中3 min樣本循環時間相比，改進后的擴增循環時間降至原來的50%以下。
圖 10為優化前后微型模塊化氣浴式核酸擴增系統對單增李斯特菌[19]擴增結果電泳圖，C1為優化后系統擴增結果，C2為優化前系統擴增結果。由圖 10可知，C1目的條帶亮度明顯高于C2，系統擴增結果得到了改善。
圖10
電泳結果
M：DNA相對分子量；C1：優化后擴增結果；C2：優化前擴增結果
Figure10. Electrophoretic resultsM: relative molecular weight of DNA; C1: amplified results after optimization; C2: amplified results before optimization
4 結論
根據氣浴式核酸擴增系統工作原理，搭建了微型模塊化氣浴式核酸擴增裝置。通過對擴增過程中樣本與熱空氣溫度延遲的理論時間計算和實際延遲時間測試，選擇了合理加熱時間并在此基礎上對裝置進行加熱溫度優化。結果表明：氣浴式核酸擴增系統在設定溫度為115、40、85 ℃，加熱時間為5 s時，可以在240 s內完成3個擴增循環，并且擴增結果良好。
本文的研究結果對提高氣浴式核酸擴增系統反應速度和擴增效率具有一定意義。在其基礎上，可以考慮對變溫金屬塊式核酸擴增系統、芯片式核酸擴增系統進行溫度控制的優化分析，促進PCR技術在各領域的應用。
引言
聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)[1-3]是20世紀末分子生物學領域的重大成果，通過94 ℃變性、55 ℃退火和72 ℃延伸三個不同階段的溫度循環，特定DNA片段呈鏈式反應般復制生成大量產物。由于PCR技術對樣本純度要求低且具有反應速度快、特異性強等優點，在遺傳疾病檢測[4-6]、食品安全檢測以及生物反恐[7-8]等領域得到了廣泛的應用。核酸擴增系統是完成PCR的核心部分，通過控制系統內部溫度變化，進而完成擴增所需變性、退火和延伸三個步驟的不斷循環，促使PCR的進行。作為主流核酸擴增系統之一，氣浴式核酸擴增系統因其升降溫速度快、溫度均勻性好以及易維護等優點被廣泛應用于實驗室研究、病原體檢測等場合。
氣浴式核酸擴增系統主要工作原理如下(見圖 1)：系統利用風機將冷空氣導入反應腔，當冷空氣流過熱源時被加熱為高溫熱空氣。反應腔內部的離心攪拌裝置工作，促使熱空氣均勻地與周圍的反應管進行強制對流換熱，系統通過改變熱源的功率實現樣本溫度的變化從而完成變性、退火和延伸三個反應階段[9]。
圖1
氣浴式核酸擴增系統原理圖
Figure1.
Schematic diagram of nucleic acid amplification system heated by air
核酸擴增系統發展多年，快速化一直是研究熱點。以氣浴式核酸擴增系統為例，提高擴增速度的常規方法主要有2類：① 改變系統結構；② 提高系統功率。改變系統結構主要通過優化空氣流動方式，降低其在系統內部流動的能量損失以保證空氣與反應管對流換熱強度，提高整體換熱系數進而提高擴增速度；提高系統功率主要通過增大熱源或者風機功率直接提高空氣與反應管的對流換熱強度進而改善擴增速度。上述解決方案均能夠提升系統的擴增速度，但是擴增中因反應樣本與熱源存在較大溫度延遲而導致的額外擴增時間過大的問題一直未能解決(見圖 2)，這導致樣本擴增仍然需要浪費較長時間到達指定溫度，降低了整個擴增過程的速度。樣本在擴增過程中不可避免地會產生非特異性產物，長時間未到達指定溫度還會導致擴增過程中非特異性產物的產生率升高，降低了整體擴增效率[10]。
圖2
樣本、熱源溫度延遲示意圖
Figure2.
Schematic diagram of temperature delay between sample and air
針對系統樣本與熱源溫度延遲的問題，本文對系統樣本與熱源換熱過程進行分析，總結樣本與熱源溫度延遲與系統各參數的關系，計算熱量傳遞時間常數；設計微型模塊化氣浴式核酸擴增系統對系統樣本與熱源的溫度延遲進行實際測量，根據理論分析和實際測量結果對熱空氣加熱時間和熱空氣溫度進行優化，降低樣本與熱源的溫度延遲，提高擴增速度和擴增效率。
1 系統換熱過程分析和計算
氣浴式核酸擴增系統內部熱量轉換主要包括空氣與電熱絲的強制對流換熱，加熱后空氣與反應管壁在攪拌風機的作用下的強制對流換熱，反應管外壁與內壁的導熱以及樣本與反應管內壁的自然對流換熱。在冷空氣經電熱絲加熱后到與反應管換熱前空氣會損失部分無法計算的熱能和動能，且在核酸擴增系統中溫度反饋為熱空氣溫度值，因此忽略這部分換熱過程的計算，僅對對熱空氣與樣本之間的換熱過程進行分析，優化樣本與空氣的溫度延遲。根據換熱強化與削弱理論，強化換熱需從對流換熱和輻射換熱著手，而削弱傳熱需通過導熱進行，因此本研究主要對空氣與反應管外壁以及反應管內壁與樣本對流換熱這兩種能量傳遞過程進行分析并計算換熱時間常數τ。
1.1 空氣與反應管外壁換熱時間常數分析
令熱空氣溫度為tw1，工作環境溫度為tf1，依據流體橫掠管模型[11]對反應管與熱空氣之間的換熱進行分析。反應管當量直徑有：
| $d=\frac{4A}{P}$ |
式中A為反應管截面積，P為潤濕周長。定性溫度tm1為：
| ${{t}_{m1}}=\frac{{{t}_{f1}}+{{t}_{w1}}}{2}$ |
依據定性溫度查詢標準大氣壓下干空氣的物性參數有導熱系數λ1、運動黏度υ1、普朗特準則Pr1。通道內部氣流速度u則有：
| $R{{e}_{1}}=\frac{ud}{{{\upsilon }_{1}}}$ |
對本文對流換熱模型Nu數進行計算：
| $N{{u}_{1}}=0.3+\frac{0.62R{{e}^{1/2}}P{{r}^{1/3}}}{{{[1+{{(0.4/Pr)}^{2/3}}]}^{1/4}}}\left[ 1+{{\left( {{\frac{Re}{28200}}^{5/8}} \right)}^{4/5}} \right]$ |
根據Nu數求取熱空氣橫掠反應管的對流換熱系數h1：
| ${{h}_{1}}=\frac{N{{u}_{1}}\cdot {{\lambda }_{1}}}{d}$ |
查詢石英玻璃的導熱系數有λ0，由于擴增的升降溫過程中溫度大部分時間不斷變化，可將這階段核酸擴增系統視作非穩態導熱。對熱空氣與反應管壁傳熱過程畢渥數(Bi)進行計算：
| $B{{i}_{1}}=\frac{{{h}_{1}}{{\delta }_{1}}}{{{\lambda }_{0}}}$ |
式中δ1為反應管管壁厚度。
若Bi1＜0.1，可使用集中參數法對其導熱過程時間常數進行計算：
| $\frac{{{h}_{1}}A}{\rho CV}\tau =B{{i}_{1}}\cdot F{{o}_{1}}$ |
| $\frac{\theta }{{{\theta }_{0}}}=exp(-B{{i}_{1}}\cdot F{{o}_{1}})$ |
式中ρ為石英反應管密度，C為反應管比熱容，A和V分別代表熱空氣接觸反應管管壁面積和體積，Fo1為傅里葉數。對其傳熱時間進行計算：
| $\frac{\theta }{{{\theta }_{0}}}=\frac{{{t}_{1}}-{{t}_{w1}}}{{{t}_{f1}}-{{t}_{w1}}}$ |
式中t1為管壁加熱后溫度，則有
| $\frac{\theta }{{{\theta }_{0}}}=exp(-\frac{{{h}_{1}}A}{\rho CV}{{\tau }_{1}})$ |
可知空氣將熱量傳遞至反應管的時間常數τ1。
若Bi1＞0.1，可采用圖線法進行求解。反應管壁可視作平板模型，根據式(9)求得無量綱過余溫度，依據無量綱過余溫度和Bi數求得Fo。查詢該定性溫度下空氣運動粘度a1。根據
| ${{\tau }_{1}}=Fo\frac{{{\delta }_{1}}}{a_{1}^{2}}$ |
可知空氣將熱量傳遞至反應管壁的時間常數τ1。
1.2 反應管內壁與樣本換熱時間常數分析
對反應管與樣本傳熱時間進行分析，試管內部可將其傳熱模型視作有限空間內自然對流換熱，取反應管壁溫度tw2，樣本溫度tf2，可設定性溫度為：
| $~{{t}_{m2}}=\frac{{{t}_{w2}}+{{t}_{f2}}}{2}$ |
查詢標準大氣壓下飽和水物性參數有導熱系數λ2、運動黏度υ2、普朗特準則Pr2，反應管夾層厚為1 mm，根據格拉曉夫數(Gr)計算準則：
| $Gr=\frac{g{{\alpha }_{V}}\Delta t\delta _{2}^{3}}{\upsilon _{2}^{2}}$ |
根據Gr數計算豎夾層下有限空間自然對流Nu數：
| $N{{u}_{2}}=0.179{{(GrP{{r}_{2}})}^{0.25}}{{\left( \frac{H}{{{\delta }_{2}}} \right)}^{-1/9}}$ |
計算反應樣本與反應管壁對流換熱系數h2：
| ${{h}_{2}}=\frac{N{{u}_{2}}{{\lambda }_{2}}}{{{\delta }_{2}}}$ |
對反應管壁與樣本傳熱過程Bi數進行計算：
| $B{{i}_{2}}=\frac{{{h}_{2}}{{\delta }_{1}}}{{{\lambda }_{0}}}$ |
若Bi2＜0.1，用集中參數法求取傳熱過程時間常數：
| $\frac{{{h}_{2}}A}{\rho CV}\tau =B{{i}_{2}}\cdot F{{o}_{2}}$ |
| $\frac{\theta }{{{\theta }_{0}}}=exp(-B{{i}_{2}}\cdot F{{o}_{2}})$ |
| $\frac{\theta }{{{\theta }_{0}}}=\frac{{{t}_{2}}-{{t}_{w2}}}{{{t}_{f2}}-{{t}_{w2}}}$ |
式中t2為樣本加熱后溫度，則有：
| $\frac{\theta }{{{\theta }_{0}}}=exp(-\frac{{{h}_{2}}A}{\rho CV}{{\tau }_{2}})$ |
可知管壁將熱量傳遞至樣本的時間常數τ2。
若Bi2＞0.1，可采用圖線法進行求解。根據式(18)求得無量綱過余溫度，依據無量綱過余溫度和Bi2求得Fo2。查詢該定性溫度下飽和水運動粘度a2，則有：
| ${{\tau }_{2}}=Fo\frac{{{\delta }_{1}}}{a_{2}^{2}}$ |
可知反應管壁將熱量傳遞至樣本的時間常數τ2。
實際擴增中，空氣溫度通過改變熱源功率進行控制，其溫度隨時間逐步上升，因此計算核酸擴增系統中熱量傳遞時間可采用微分離散方法，分別計算不同溫差下熱量傳遞時間。對運行的氣浴式核酸擴增系統空氣與樣本溫度進行測量得出溫差與時間曲線，記錄空氣變化時間，擬合樣本與空氣的溫度時間變化關系式并代入到時間常數計算中，通過積分即可估算出熱量傳遞時間。綜上可知，氣浴式核酸擴增系統熱量傳遞時間t無論是利用集中參數法還是圖解法都與無量綱過余溫度有關，即空氣與樣本的溫差越大，樣本與熱源之間溫度延遲越低。此外，τ還與對流換熱系數、反應管與空氣接觸面積體積比有關，但改善對流換熱系數或反應管與空氣的面積體積比均需要對結構進行優化，而結構的改變會引起諸如流體壓降變化、能量耗損的變化等其他情況，而改變溫差僅需要改變控制程序即可實現。因此本文選用增大空氣與樣本溫差的方法降低兩者之間的延遲，優化整個擴增過程。
2 實驗平臺搭建
根據氣浴式核酸擴增系統工作原理[12]和Cephid公司的Smart-cycler工作特點[13]，本文設計了微型模塊化氣浴式核酸擴增系統。以單個模塊(見圖 3)為實驗對象，主要部件包括80 mm×20 mm×40 mm(長×寬×高)矩形反應腔，高寬比為2:1有利于降低空氣流動的摩擦壓降[14]；規格為30 mm×30 mm×15 mm(高×寬×厚)的軸流風機作為空氣動力源；20 W鐵烙鋁電熱絲作為系統熱源，置于反應腔中部；20 mm×40 mm×3 mm(寬×高×厚)的泡沫銅網[15-16]置于反應腔后半部使熱空氣均勻流向1.2 mm×1.2 mm×30 mm(長×寬×高)石英反應管。該模塊工作原理如下：軸流風機啟動，冷空氣流入至反應腔與鐵烙鋁電熱絲進行強制對流換熱，加熱后的空氣經過泡沫銅網后均勻流向反應管。改變電熱絲的功率可以間接完成樣本變性、退火和延伸三個過程。
圖3
單模塊氣浴式核酸擴增系統
Figure3.
Single module system of nucleic acid amplification heated by air
3 實驗結果與討論
3.1 加熱時間選擇
為了選擇合理的溫差改善單模塊氣浴式核酸擴增系統樣本與空氣溫度延遲的問題，實驗中需對加熱時間進行選擇。對核酸擴增系統內部反應管液體溫度和管附近空氣溫度進行實時測量，得出溫差與空氣溫度變化時間的關系式并記錄系統各階段樣本與空氣的實際溫度延遲[17-18]。令實際延遲為t延，實驗過程空氣持續加熱時間為t加。由于在理論計算中忽略能量損失，因此傳熱理論時間τ小于實際延遲t延；為了保證擴增過程樣本溫度過沖，加熱時間t加應小于實際延遲t延；為了保證樣本溫度可以到達各階段溫度點，加熱時間t加應大于傳熱理論時間τ，因此有τ＜t加＜t延。實驗中，利用與反應管平行放置的T型熱電偶實時測量熱空氣溫度，利用IT-23可植入微探針插入反應管實時測量樣本溫度[見圖 4(a)]，將測量數據導入至上位機利用ORIGIN作出樣本與熱空氣各階段的溫度曲線和樣本循環溫度曲線(見圖 5)。依據所測數據擬合升溫至變性、降溫至退火以及升溫至延伸三個階段樣本和空氣溫差與空氣溫度變化時間的關系式。
圖4
溫度測量示意圖
(a)可植入探針位置；(b)實驗平臺
Figure4. Schematic diagram of temperature measurement(a) probe location; (b) experimental platform
圖5
升降溫過程熱空氣與樣本液體溫度曲線
(a)升溫至變性；(b)降溫至退火；(c)升溫至延伸；(d)樣本循環
Figure5. Temperature retard between sample and air in the progress of heating and cooling(a) heating to denaturation; (b) cooling to annealing; (c) heating to extension; (d) sample cycling
由圖 5(a)可知，單模塊氣浴式核酸擴增系統在延伸升溫至變性階段，空氣溫度在4.2 s左右升至變性溫度，樣本溫度在16.2 s升至變性溫度，實際延遲約為12 s。空氣溫度T隨時間t變化關系式：
| $T=75.65+9.10t-1.53{{t}^{2}}+0.11{{t}^{3}}-0.003{{t}^{4}}$ |
樣本溫度T隨時間t變化關系式：
| $T=73.91-0.35t+0.43{{t}^{2}}-0.03{{t}^{3}}+0.0006{{t}^{4}}$ |
由圖 5(b)可知，單模塊氣浴式核酸擴增系統在變性降溫至退火階段，空氣溫度在8.1 s降至退火溫度，樣本在37.5 s左右降至退火溫度，實際延遲約為29.4 s。空氣溫度T隨時間t變化式為：
| $T=98.40-9.39t+0.68{{t}^{2}}-0.02{{t}^{3}}+0.0002{{t}^{4}}$ |
樣本溫度T隨時間t變化關系式：
| $T=94.39-2.83t+0.075{{t}^{2}}-0.000\text{ }8{{t}^{3}}$ |
由圖 5(c)可知，單模塊氣浴式核酸擴增系統在退火升溫至延伸階段，空氣溫度5.1 s達到延伸溫度，但是伴有1 ℃左右的過沖，樣本11.7 s達到延伸溫度，實際延遲約為6.6 s。空氣溫度T隨時間t變化式為：
| $T=55.63+4.35t-0.02{{t}^{2}}-0.06{{t}^{3}}+0.003\text{ }7{{t}^{4}}$ |
樣本溫度T隨時間t變化關系式：
| $T=55.65+5.02t-0.68{{t}^{2}}+0.044{{t}^{3}}-0.001{{t}^{4}}$ |
由圖 5(d)可知，在控制樣本溫度到達變性、退火和延伸溫度并根據擴增需求恒溫保持的情況下，完成一次擴增所需時間約為3 min。
查詢風扇參數計算空氣流速有u為7.3 m/s，根據熱空氣溫度與實驗環境溫度選擇空氣物性參數，導熱系數λ1為2.912×10-2 W·m-1·K-1，運動黏度υ1為18.98×10-6 m2·s-1，普朗特準則Pr1為0.695 6。 水物性參數有λ2為65.9×10-2 W·m-1·K-1，運動黏度υ2為0.478×10-6 m2·s-1，普朗特準則Pr2為2.99，石英玻璃導熱系數λ為1.46 W·m-1·K-1。將各參數代入各求解式有h1為273.4 W·m-2·K-1，h2為1 041.22 W·m-2·K-1。對空氣傳熱至反應管壁以及反應管壁傳遞至樣本過程進行計算，可知Bi1、Bi2均小于0.1，因此用集中參數法進行計算。換熱時間有：
| ${{\tau }_{1}}=\frac{ln\left( \frac{{{t}_{1}}-{{t}_{w1}}}{{{t}_{f1}}-{{t}_{w1}}} \right)}{-1.85}$ |
| ${{\tau }_{1}}=\frac{ln\left( \frac{{{t}_{2}}-{{t}_{w2}}}{{{t}_{f2}}-{{t}_{w2}}} \right)}{-7.06}$ |
將式(22)~(27)分別代入到式(28)(29)，對空氣溫度變化時間進行積分可得從延伸升溫至變性階段τ1和τ2分別為4.6 s和1.2 s；退火升溫至延伸階段τ1和τ2分別為4.2 s和1.1 s。同理可以求得從變性降溫至退火階段τ1和τ2分別為17.8 s和4.7 s。 由于熱量從空氣傳遞至管壁與管壁傳遞至樣本在同時進行，因此選取同一變溫階段τ1、τ2較大值作為理論的熱量傳遞時間τ，可知降溫至退火為17.8 s，升溫至延伸為4.2 s，升溫至變性為4.6 s。由前述分析可知，τ＜t加＜t延，而為了保證同一加熱時間不引起樣本溫度過沖，t加應處于理論延遲最小值和實際延遲最小值之間，即4.2 s＜t加＜6.6 s。為了簡化實驗和數據處理過程，文中選擇t加=5 s對核酸擴增系統進行空氣溫度優化實驗。
3.2 空氣溫度優化
依據加熱時間的選擇，對系統溫度控制進行優化，不同擴增階段選擇不同溫度對單模塊氣浴式核酸擴增系統進行實驗，通過樣本溫度隨時間變化曲線選擇最優加熱或者冷卻溫度。在延伸升溫至變性階段，分別設置空氣溫度為100、105、115、120 ℃，利用可植入探針實時測量樣本溫度，根據測量數據得到變化曲線如圖 6所示。
圖6
變性階段過沖溫度測試
Figure6.
Temperature test in denaturation
由圖 6可知，樣本到達變性溫度所需時間隨著加熱溫度增大而縮短。在100、105、115、120 ℃時，樣本到達變性時間分別為9.8、8.9、6.4、5.4 s。在設定加熱空氣溫度為115 ℃時，樣本升溫較快且僅存在0.6 ℃過沖溫度；而當設定溫度為120 ℃時，樣本溫度曲線出現了約2.5 ℃過沖。因此選擇115 ℃為加熱溫度對延伸升溫至變性階段的樣本與空氣溫度的延遲進行優化。
從變性階段降溫至退火，分別設置冷卻溫度為50、45、40、35 ℃，樣本溫度隨時間變化曲線如圖 7所示。由圖 7可知，在不同冷卻溫度下樣本到達退火溫度所需時間分別為28.5、22.3、19.4、12.9 s。設定溫度為35 ℃時樣本降溫最快，但在此過程中樣本溫度出現了3 ℃左右的過沖，因此選擇40 ℃為冷卻溫度對變性降溫至退火過程樣本與空氣溫度的延遲進行優化。
圖7
退火階段過沖溫度測試
Figure7.
Temperature test in annealing
從退火階段升溫至延伸分別設置空氣溫度為75、80、85、90 ℃，樣本溫度隨時間變化曲線如圖 8所示。由圖 8可知，樣本到達延伸溫度所需時間分別為6.0、8.1、9.2、10.2 s，但是在設定溫度為90 ℃時，樣本出現了1 ℃左右的過沖。因此選擇85 ℃為加熱溫度對退火升溫至延伸階段樣本與空氣溫度的延遲進行優化。
圖8
延伸階段過沖溫度測試
Figure8.
Temperature test in extension
結合以上不同擴增階段過沖溫度測試結果可知：擴增過程中保持過沖時間為5 s，升溫至變性階段選擇最優加熱溫度為115 ℃，降溫至退火階段選擇最優冷卻溫度為40 ℃；升溫至延伸階段選擇最優加熱溫度為85 ℃，對優化后單模塊氣浴式核酸擴增系統樣本溫度進行實時測量，系統運行3個擴增循環，樣本溫度循環曲線如圖 9所示。
圖9
優化后樣本溫度循環
Figure9.
Sample temperature cycle after optimizing
由圖 9可知優化后樣本升降溫速度有明顯改善，在240 s內可完成三次擴增，與圖 5(d)中3 min樣本循環時間相比，改進后的擴增循環時間降至原來的50%以下。
圖 10為優化前后微型模塊化氣浴式核酸擴增系統對單增李斯特菌[19]擴增結果電泳圖，C1為優化后系統擴增結果，C2為優化前系統擴增結果。由圖 10可知，C1目的條帶亮度明顯高于C2，系統擴增結果得到了改善。
圖10
電泳結果
M：DNA相對分子量；C1：優化后擴增結果；C2：優化前擴增結果
Figure10. Electrophoretic resultsM: relative molecular weight of DNA; C1: amplified results after optimization; C2: amplified results before optimization
4 結論
根據氣浴式核酸擴增系統工作原理，搭建了微型模塊化氣浴式核酸擴增裝置。通過對擴增過程中樣本與熱空氣溫度延遲的理論時間計算和實際延遲時間測試，選擇了合理加熱時間并在此基礎上對裝置進行加熱溫度優化。結果表明：氣浴式核酸擴增系統在設定溫度為115、40、85 ℃，加熱時間為5 s時，可以在240 s內完成3個擴增循環，并且擴增結果良好。
本文的研究結果對提高氣浴式核酸擴增系統反應速度和擴增效率具有一定意義。在其基礎上，可以考慮對變溫金屬塊式核酸擴增系統、芯片式核酸擴增系統進行溫度控制的優化分析，促進PCR技術在各領域的應用。