連續血糖監測對于重癥糖尿病患者至關重要，但目前仍然沒有可供臨床使用的長效植入式葡萄糖傳感器面世。本文介紹了連續血糖監測用傳感器分類，重點探討了傳感器植入后的失效機制，指出了提高傳感器植入壽命的途徑及注意事項，并展望了植入式葡萄糖傳感器的未來研究方向。
引用本文： 余江淵, 李嶄虹, 陳誠, 陳云霞, 朱志剛. 血糖監測用植入式傳感器的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(5): 991-997. doi: 10.7507/1001-5515.20160159 復制
0 引言
糖尿病患者目前主要采用第2代手持式血糖儀進行個人檢測，Ⅱ型糖尿患者每天至少需要檢測2次，Ⅰ型糖尿患者每天需要檢測4次，來判斷血糖的波動趨勢。這種方式相對簡便、廉價，但無法掌控血糖波動變化趨勢及規律，特別是不可預測由低血糖昏迷導致的患者死亡。國際學術界普遍認為：對糖尿病患者血糖濃度進行連續監測是最佳診療方式，特別適合重癥糖尿病患者。因此，人們期待一種血糖檢測性能穩定且能夠連續工作一個月以上的植入式葡萄糖傳感器，并能在血糖濃度超過限值時進行警報，從而有助于醫生指導臨床用藥，控制病情。理想情況下，連續血糖監測(continuous glucose monitoring，CGM)設備與胰島素輸送泵聯用，構建閉合回路系統(closed loop)，也就是所謂的人工胰臟，可以模仿胰臟功能來定量輸出胰島素，從而控制血糖濃度的波動[1-2]。本文圍繞連續血糖監測用傳感器，首先介紹傳感器發展的現狀，然后探討傳感器植入體內后的失效機制，再指出提高傳感器壽命的幾種途徑，以及制備過程中的幾個注意事項，最終對全文進行小結并提出展望。
1 血糖連續監測用傳感器的分類
血糖連續監測用傳感器可根據技術方法和侵襲程度來分類。其中，技術方法可以分為電化學法[3]、微透析[4]和無創近紅外技術[5]等；根據傷害方式分為侵入式和非侵入式；根據侵入程度，又分為微創型和全植入型。市面上的多數植入血糖儀都屬于微創型，即將細針狀傳感器探頭直接刺入皮下，基座和數據部分固定在皮膚上。電化學葡萄糖傳感器因其具有檢測精度高、選擇特異性好、壽命長、體積小與成本低等優點，目前在連續血糖監測傳感器的市場份額上遙遙領先于其他類型的傳感器。而全植入式傳感器，將整個系統設計成密封式，包括電源、控制電路、無線通訊數據傳輸、用戶界面、數據庫等部分，其中用戶界面和數據庫是體外部分，它接收傳感器數據并轉換成相應的血糖信號，是使用者與系統交流的媒介。由于技術上的原因，目前市面上還未出現全植入式動態血糖監測產品。
2001年美國加州Cygnus公司推出曾經轟動一時的GlucoWatch無創血糖監測產品后，新技術方法和新產品不斷涌現，其主要方法包括：①電化學；②基于微滲透技術的檢測，如提取汗液、唾液等；③基于紅外或拉曼等光譜學研究。2014年以色列盈通格利有限公司全球首次推出糖無忌(GlucoTrack)不扎手指無創血糖儀新技術，通過無痛無創的“夾耳朵”方式監測血糖，而且可以實現多次重復檢測。GlucoTrack同時采用了超聲(檢測聲波穿過耳垂的速度)、電學(電導率變化)和熱量(組織的熱傳輸行為)三種檢測方法，以提高測量準確性。如表 1所示，列舉并比較了全球幾種商品化連續葡萄糖檢測儀器的性能。
表1
幾種商品化連續葡萄糖檢測儀器的比較
Table1.
Comparison of several commercially available continuous glucose monitoring devices
盡管無創血糖監測研究非常熱門，但作者認為最有發展與應用前景的血糖連續監測方法是基于電化學原理的皮下植入式微創型葡萄糖傳感器。這是因為此類傳感器體積小，且酶對葡萄糖具有高選擇性和靈敏度，也是目前使用最廣泛、商品化最成熟的方法[6]。如表 1所示，多款產品已經被美國食品藥品監督管理局(food and drug administration, FDA)認證，并且在醫院有著廣泛應用。基于電化學的植入式傳感器的檢測原理同體外檢測基本一致，其測試原理已經歷了三代傳感器類型的發展[7]，主要作用機制如圖 1所示。目前，植入式傳感器的最大瓶頸是傳感器的使用壽命只有3~5天，這是因為傳感器植入機體組織后，會受到多種機制影響而失效，具體解釋見下一章節。因此，制備高效長壽命的傳感器是連續血糖監測的關鍵環節。
圖1
三代葡萄糖傳感器的電子傳遞機制示意圖
Figure1.
Schematic diagram of electron transfer mechanisms with three generation enzymatic glucose biosensors
2 植入式葡萄糖傳感器的失效機制
傳感器植入體內后的失效機制主要有如下幾種可能：①體內的異物反應(foreign body reaction, FBR)導致傳感器失效，是植入后面臨的最主要難題；②細胞外基質的蛋白酶滲透到器件中以及反應產物過氧化氫的聚集導致固定酶失效；③固定酶分子隨著環境變化導致酶蛋白質結構變異，分子識別功能喪失；④膜的性質隨著時間、溫度而變化，如膜密度的變化可以改變分析物、產物以及媒介體的輸運性質；⑤材料與器件故障，如膜的脫落、引線連接的斷裂等。
傳感器在植入之后首先在傷口引起炎癥反應，隨后是傳感器與蛋白質、細胞以及組織之間長期交互作用容易造成異物反應。如圖 2所示，任何植入的醫療器械裝置都會擾亂宿主介質，損壞毛細血管并產生免疫應答。異物反應主要過程如下：①形成一個臨時基質(數分鐘到數小時)；②急性炎癥反應(數天)；③慢性炎癥反應(數周)；④肉芽組織的形成(數周)；⑤纖維包膜的形成(數周到數月)[8]。
圖2
異物反應過程示意圖
Figure2.
Schematic diagram of the foreign body reaction
在植入過程的早期，形成的臨時基質隨著血液/材料交互作用和蛋白質黏附形成周圍異物，并提供結構、生物化學以及細胞成分來與身體形成異物反應。來自臨時基質中的化學引誘物、細胞因子、生長因子以及其它生物活性劑除了調節巨噬細胞的表型外，還可以提高細胞的增殖與活化。因此，臨時基質被認為是一種天然的衍生膜，通過釋放生物活性劑來控制炎癥反應的后續階段[9]。在此階段，生物分子與傳感器膜層的黏附通常導致傳感器對葡萄糖的響應下降幅度超過50%。使用質譜蛋白質組學分析生物分子附著在植入傳感器的動物實驗結果表明：炎癥細胞和較大蛋白質分子的片段都滲入到傳感器膜層并導致葡萄糖擴散能力的下降[10]。
急性炎癥反應的生物作用是吞噬異物，巨噬細胞消化植入物的過程會影響體內傳感器的性能。Klueh等[11-12]的結果證實巨噬細胞在體內與體外扮演著葡萄糖與氧氣之間擴散代謝障礙的角色，并因此對連續血糖監測具有重要影響。
緊隨急性炎癥之后，由于巨噬細胞、單核細胞和淋巴細胞以及血管的增殖和結締組織的存在，植入部位進入到慢性炎癥階段。該過程開始阻止巨噬細胞長大使得巨噬細胞融合形成異物巨細胞(foreign body giant cells，FBGCs)，企圖進一步消耗/降解植入異物。這種結果會導致分析底物的擴散以及局部組織相對濃度的降低。另外巨噬細胞可消耗氧和葡萄糖產生的超氧化物和過氧化氫，影響到電化學傳感器的響應。在免疫反應的最后步驟中，膠原蛋白在植入異物周圍的相互作用下形成纖維包膜，使得傳感器完全從局部組織環境中隔離，因此限制了葡萄糖的擴散，從而使得該傳感器不能測量或報告宿主的實際血糖水平。總之，在設計植入式葡萄糖傳感器時，復雜的免疫反應以及各個階段的異物反應都應該被考慮進去，從而提高葡萄糖傳感器的性能。
3 提高傳感器植入壽命的途徑
當傳感器植入組織后會形成一個組織-傳感器界面，這個界面的相容性對于傳感器的正常穩定工作起到決定性作用。這個界面反應較為復雜，可分為初期、中期和后期三個階段。因此，如何優化電極-組織生物界面已成為了一個最具挑戰的問題，同時也是提高植入式傳感器壽命的關鍵步驟。提高人體組織與傳感器的界面相容性有以下幾種主要途徑：①傳感器的微納設計；②生物相容性膜設計與合成；③添加適當的緩釋藥物。
3.1 傳感器的微納設計
為了減少異物反應，現行的設計方法將傳感器與相關的電子和通訊硬件分開，硬件系統被置于體外，而傳感器則置于皮下、靜脈或通過肌注方式植入等。其中皮下組織被認為是植入最為合適的部位，因為該部位便于進行外科手術以及傳感器的更換。此外，為了最大限度地減少傳感器植入時所引起的創傷及大量出血，植入式傳感器的尺寸不宜太大。為限制和緩解植入后炎癥反應，目前主流的傳感器都沿用此類設計方法，因而傳感器通常被設計成針形[13](如圖 3所示)、多針、針列、線圈型等。
圖3
針形植入式葡萄糖傳感器示意圖
Figure3.
Schematic diagram of needle-type implantable glucose biosensor
典型的針式電極具有電極植入方式靈活、各種膜層容易涂覆、組織反應程度小等優點而被廣泛采用。通常采用兩電極結構，即以導電的鉑絲、金絲、碳化纖維作為工作電極，Ag/AgCl作為參比電極。此外，可以采用平面微電極和微電極陣列來代替針式電極，也可以通過絲網印刷和噴墨印刷碳膠制作工作電極。螺旋型鉑銥合金電極最早由美國Moussy教授提出，采用螺旋型鉑銥合金電極來擔載葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)，與上述針式結構相比，該器型螺旋孔道結構可以擔載更多酶，從而能延長器件植入后的使用壽命。作者隨Moussy教授工作多年，本課題組也一直從事植入葡萄糖傳感器的深度開發，包括螺旋鉑-銥電極(如圖 4所示)[14]、碳納米管(carbon nanotube，CNT)纖維電極[15]和CNT陣列與納米Ni復合無酶電極[16]，并制備出一套基于Zigbee模塊的小型連續血糖監測系統[17]。此外，植入器件時，應當避免出現尖角和邊緣，由于體內存在大量的移動微組織，一旦有鋒利的尖角和邊緣存在，會成為炎癥反應的刺激點從而加劇炎癥反應，導致傳感器的失效[18-19]。
圖4
螺旋電極示意圖
1：特氟龍包覆的Pt-Ir絲；2：Ag/AgCl絲；3：封裝膜；4：Epoxy-PU半透膜；5：GOD；6：去包覆的Pt-Ir線圈；7：纖維材料
Figure4. Schematic diagram of spiral-type Pt-Ir electrode1: PTFE coated Pt-Ir wire; 2: Ag/AgCl wire; 3: sealing membrane; 4: Epoxy-PU semi-permeable membrane; 5: glucose oxidase; 6: Pt-Ir coil; 7: fiber materials
3.2 生物相容性膜材料
為了滿足體內植入的苛刻要求，最常見的方法是將傳感器的生物相容性薄膜制成與主體類似的仿生結構。聚合物的涂覆有利于緩解炎癥反應，并具有以下幾個特點：①阻止氧化酶的流失，并可以選擇性地過濾干擾分子；②限制葡萄糖的滲透量，改善電極對氧的依賴性，提高傳感器的檢測線性范圍；③此膜直接與皮下組織相接觸，可通過結構設計和調制來提高生物相容性。在眾多的聚合物材料中，Nafion、聚氨酯(polyurethane，PU)以及各種復合水凝膠已成功地運用到植入傳感器中。
Nafion是一種全氟磺酸系聚合物，Moussy等[20]通過將包覆Nafion涂層的連續血糖監測探頭植入到犬科動物，可以使傳感器正常工作10天，使用后膜有著明顯的開裂從而導致了傳感器的失效。Chen等[21]研制出多孔聚偏氟乙烯和納米球型Nafion復合涂層，該涂層構建的傳感器植入到小鼠后，具有快速、線性地血糖濃度變化響應，并表現出與周圍組織良好的生物相容性。
聚氨酯廣泛地應用于生物傳感器外層膜，作為與主體組織周圍相容的膜材料。王寧等[22]報道了一種用于微型植入式葡萄糖傳感器的多孔聚氨酯膜。該靜電涂層取代了傳統的環氧聚氨酯外涂層，主要充當傳質限制膜并顯著地提高了檢測線性度，此外，該涂層具有可控的纖維多孔結構和厚度。Wang等[23]采用靜電紡絲技術制備出具有多孔結構的聚亞安酯纖維膜，并探討了分級多孔結構的尺寸效應對滲透性和表面性的影響。相比于傳統的成膜工藝，靜電紡絲可制備出高比例的孔隙、廣泛互聯的孔道、并具有良好的可裁剪性，可應用于生物傳感器表面涂層。
目前，最受研究者關注的生物膜材料是水凝膠。水凝膠是由水溶性高分子與水形成三維網絡結構，具有多孔、親水等特點，是一種高吸水性材料。當在生理環境中，水凝膠可以緩解蛋白質吸附和纖維包膜。因此，水凝膠被認為是制備植入式葡萄糖傳感器的重要生物膜材料。Yu等[24]討論了水凝膠膜在植入式葡萄糖傳感器的作用，該研究表明，涂覆水凝膠的傳感器都可以正常工作21天以上，組織學研究表明其壽命的延長歸因于水凝膠的涂覆減少了纖維包膜。Lin等[25]研究了一種新型的葡萄糖敏感水凝膠(glucose-sensitive hydrogel，GSH)，發現此凝膠涂覆后體系具有更快的反應動力學并明顯減少了果糖的干擾，非常適合應用于體內葡萄糖傳感器監測。Wang等[26]制備了一種用聚(乳酸-乙醇酸)[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]共聚物微球分散于聚(乙烯醇)[poly(vinyl alcohol)，PVA]的水凝膠，這種新型聚合物涂層涂覆在傳感器外圍，可作為一種“智能”藥物釋放系統直接在植入位點釋放，從而緩解異物反應，進而提升體內傳感器性能。
3.3 適當的添加緩釋藥物
急性炎癥反應和隨后的纖維包膜會減弱酶底物和氧氣傳遞到傳感器電極的通量，從而導致了傳感器的失效。因此，引入合適的藥物緩釋涂層可以防止局部組織發炎，并增加毛細血管的生成。緩釋藥物包括抗炎藥物(地塞米松，dexamethasone，DX)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和抗凝劑(肝素)。
糖皮質激素類藥物DX同時具有抗炎性和免疫抑制作用，在植入后可以抑制炎癥反應，將組織傷害降到最小化，使得正常組織再生，從而限制纖維包膜形成。通常水凝膠與微球的藥物遞送組合被認為是用作可植入式傳感器生物相容涂層的最佳手段，可以最大限度減少異物反應。Wang等[27]探討了DX加載PLGA微球/PVA復合水凝膠對傳感器的影響。結果表明：該復合涂層不會影響傳感器的線性范圍，反而使得線性范圍遠超過人體生理血糖濃度范圍(2~22 mmol/L)，因此可以用作植入葡萄糖傳感器的智能涂層，以提高傳感器在體內的存活壽命。隨后，Vaddiraju等[28]在此基礎上，通過在工作電極的電化學表面重建產生一個三維納米多孔結構，來增加其電化學工作面積，成功研制了在靈敏度和大信噪比方面增強的傳感器。Vallejo-heligon等[29]設計了一種具有多孔、DX釋放PU涂層的葡萄糖傳感器，動物研究表明，DX釋放的多孔PU膜植入大鼠皮下組織可明顯緩解初始炎癥反應。綜上，可以認為DX的釋放是一種有效改善葡萄糖傳感器性能的方法。盡管糖皮質激素作用的確切機制尚不清楚，但是，從植入后活性釋放的DX研究表明，DX的添加可以明顯減少炎癥反應。
VEGF作為促進組織血管生成的釋放試劑被廣泛研究。除抑制炎癥反應，它的主要功用是促進植入部位的新血管生成、緩解纖維包膜，從而提高傳感器壽命。Kastellorzios等[30]針對DX、VEGF、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)等三種機體組織的反應調節劑在遞送過程中的協同作用進行了系統的研究。實驗發現：三種反應調節劑的協同作用下可以最大限度促進血管生成、生長，并抑制炎癥反應；此外，VEGF調節劑的用量應高于PDGF的劑量，增加DX的用量同時需要增加VEGF的使用量。
4 植入傳感器的注意事項
4.1 生物分子的干擾
生物分子干擾物分為外源性和內源性分子。內源性分子(指人體內原本就存在的分子)干擾物包括：尿酸(uric acid，UA)、抗壞血酸(ascorbic acid，AA)、多巴胺(dopamine，DA)等。外源(指任意藥物或食物中所含的活性分子)干擾物有對乙酰氨基酚(acetaminophen，AP)等。這些干擾物都具有電化學活性，在工作電極上施加較高的氧化電位時，同樣會將這類干擾物氧化，從而影響測量的準確性。目前，消除這些干擾物最常用的方法是在傳感器上使用一層選擇性膜。這些膜通常根據尺寸大小、電荷以及極性來篩選調節各個參與反應的分子和離子的擴散通量，從而有效限制干擾分子進入。電聚合膜如聚鄰苯二胺、多酚和聚氨基苯酚已經證實對減少干擾物影響非常有效，可以明顯改善選擇性和線性檢測范圍。電聚合膜的另一個優點是薄且均勻，可以被選擇性地沉積到具有復雜幾何形狀的微電極上[31]。此外，通過對電極進行改性，例如納米材料的應用，可明顯降低傳感器的工作電位，是有效減少生物體中電活性干擾物影響的重要途徑。
4.2 氧氣的依賴
電化學檢測過氧化氫，需要氧氣作為輔助物參與到酶促反應。在間質液中氧氣濃度大約為葡萄糖溶液中濃度的十分之一。因此很容易出現“氧缺乏”狀態，使得基于氧化酶的葡萄糖傳感器在葡萄糖高濃度區失去線性度。一般情況下，當植入部位處于麻醉狀態時，皮下氧分壓范圍為40~130 mm Hg。為減少氧氣依賴，提高傳感器的線性度，可以采用以下2種方法：①采用擴散限制層，如聚氨酯或聚碳酸酯。它可以改變葡萄糖和氧氣的通量并增加氧/葡萄糖透過率的比值，從而減少氧依賴性并提高生物傳感器的上限。例如，Zhang等[32]報道，在電極外層浸涂3％的聚氨酯溶液使得傳感器線性范圍上限提高到25 mmol/L。②提高氧傳質速率。Gough等[33]通過在一個二維圓筒電極側壁涂覆聚二甲基硅氧烷來減少葡萄糖流量，通過高效滲透氧氣方法解決氧缺乏。對于植入式傳感器而言，必須做到氧氣分壓在20 mm Hg時才可以正常工作。
4.3 一氧化氮的作用
一氧化氮(nitrogen oxide, NO)是一種強效的抗血栓和抗炎劑，早在20世紀80年代，就被發現是一種血管內皮衍生松弛因子，可以控制放松和平滑肌細胞襯脈管收縮。研究表明，NO在血管生成、癌癥生物學和骨重塑等領域發揮著重要作用。治療性材料如能可控地釋放NO，則可以促進植入物的生物相容性，但是NO有效遞送效率低被認為是限制NO靶向治療的重要瓶頸。Soto等[34]在針式電極上涂覆含有NO釋放物的聚氨酯膜層，經NO緩釋的傳感器可以明顯改善傳感器植入1~3天后的精度，同時延遲響應時間減少到4.2 min。Koh等[13]將NO供體加載纖維修飾到多孔聚氨酯膜包覆的針型植入式傳感器中，當這些多孔纖維膜厚度≤50 μm時，不會影響生物傳感器的性能。盡管這些研究強調NO釋放物可以改善FBR反應，但畢竟處在早期研究階段，其機制尚未完全闡釋，需要更深入細致地研究。
5 小結與展望
連續血糖監測用植入式傳感器的發展包括生物相容性膜的開發、表面改性[35]和電極微型化幾個方面，提高植入傳感器的分析靈敏度和精度、減少身體異物反應并最終延長器件壽命是一項極富挑戰的工作。雖然上文所敘的一些方法，已經被采用且被證實是非常有效的，但高效長壽命的植入式傳感器件至今仍不完善。因此，在今后的研究工作可以密切關注以下問題：①酶的穩定性：酶的穩定性在植入式生物傳感器中至關重要，直接決定了信號的重現性和分析性能。酶的穩定性主要受固定酶的方法和微環境的影響。Harris等[36]總結了過氧化氫、小分子材料(抗壞血酸鹽、尿素鹽、半胱氨酸等)的聚集和戊二醛交聯三者對氧化酶降解的影響，指出葡萄糖氧化酶基因改性并輔之以硅凝膠封裝是一條提高植入傳感器壽命有效的辦法。②生物分子的干擾：通過涂覆選擇性半透膜來減少內源性分子(UA、AA、DA)和外源性分子(AP)等電化學活性物質的干擾。此外，通過傳感器電極設計，將工作電位降低、甚至到負電位，可以有效緩解干擾物的影響。③氧氣的含量：電化學檢測過氧化氫，需要氧氣作為輔助參與到酶促反應。在間質液中氧氣濃度大約為葡萄糖溶液濃度的十分之一，而導致出現“氧缺乏”狀態，需要通過增加外層擴散限制膜、電聚合物[37]或者電子媒介體來緩解。④生物相容性膜材料：通過構建新型復合水凝膠，比如內層采用靜電逐層自組裝技術(layer-by-layer，LBL)來沉積高分子電解質，改善膜表面電性，從而緩解帶電蛋白質的表面淤積。為了減少纖維包膜的形成，外層可以采用共聚物水凝膠，通過物理及化學膠凝方式來形成網絡互穿結構，打破纖維形成的連續包膜。通過此復合結構涂層來同時緩解電極表面的蛋白質淤積和纖維包膜的形成，從而緩解異物反應。
0 引言
糖尿病患者目前主要采用第2代手持式血糖儀進行個人檢測，Ⅱ型糖尿患者每天至少需要檢測2次，Ⅰ型糖尿患者每天需要檢測4次，來判斷血糖的波動趨勢。這種方式相對簡便、廉價，但無法掌控血糖波動變化趨勢及規律，特別是不可預測由低血糖昏迷導致的患者死亡。國際學術界普遍認為：對糖尿病患者血糖濃度進行連續監測是最佳診療方式，特別適合重癥糖尿病患者。因此，人們期待一種血糖檢測性能穩定且能夠連續工作一個月以上的植入式葡萄糖傳感器，并能在血糖濃度超過限值時進行警報，從而有助于醫生指導臨床用藥，控制病情。理想情況下，連續血糖監測(continuous glucose monitoring，CGM)設備與胰島素輸送泵聯用，構建閉合回路系統(closed loop)，也就是所謂的人工胰臟，可以模仿胰臟功能來定量輸出胰島素，從而控制血糖濃度的波動[1-2]。本文圍繞連續血糖監測用傳感器，首先介紹傳感器發展的現狀，然后探討傳感器植入體內后的失效機制，再指出提高傳感器壽命的幾種途徑，以及制備過程中的幾個注意事項，最終對全文進行小結并提出展望。
1 血糖連續監測用傳感器的分類
血糖連續監測用傳感器可根據技術方法和侵襲程度來分類。其中，技術方法可以分為電化學法[3]、微透析[4]和無創近紅外技術[5]等；根據傷害方式分為侵入式和非侵入式；根據侵入程度，又分為微創型和全植入型。市面上的多數植入血糖儀都屬于微創型，即將細針狀傳感器探頭直接刺入皮下，基座和數據部分固定在皮膚上。電化學葡萄糖傳感器因其具有檢測精度高、選擇特異性好、壽命長、體積小與成本低等優點，目前在連續血糖監測傳感器的市場份額上遙遙領先于其他類型的傳感器。而全植入式傳感器，將整個系統設計成密封式，包括電源、控制電路、無線通訊數據傳輸、用戶界面、數據庫等部分，其中用戶界面和數據庫是體外部分，它接收傳感器數據并轉換成相應的血糖信號，是使用者與系統交流的媒介。由于技術上的原因，目前市面上還未出現全植入式動態血糖監測產品。
2001年美國加州Cygnus公司推出曾經轟動一時的GlucoWatch無創血糖監測產品后，新技術方法和新產品不斷涌現，其主要方法包括：①電化學；②基于微滲透技術的檢測，如提取汗液、唾液等；③基于紅外或拉曼等光譜學研究。2014年以色列盈通格利有限公司全球首次推出糖無忌(GlucoTrack)不扎手指無創血糖儀新技術，通過無痛無創的“夾耳朵”方式監測血糖，而且可以實現多次重復檢測。GlucoTrack同時采用了超聲(檢測聲波穿過耳垂的速度)、電學(電導率變化)和熱量(組織的熱傳輸行為)三種檢測方法，以提高測量準確性。如表 1所示，列舉并比較了全球幾種商品化連續葡萄糖檢測儀器的性能。
表1
幾種商品化連續葡萄糖檢測儀器的比較
Table1.
Comparison of several commercially available continuous glucose monitoring devices
盡管無創血糖監測研究非常熱門，但作者認為最有發展與應用前景的血糖連續監測方法是基于電化學原理的皮下植入式微創型葡萄糖傳感器。這是因為此類傳感器體積小，且酶對葡萄糖具有高選擇性和靈敏度，也是目前使用最廣泛、商品化最成熟的方法[6]。如表 1所示，多款產品已經被美國食品藥品監督管理局(food and drug administration, FDA)認證，并且在醫院有著廣泛應用。基于電化學的植入式傳感器的檢測原理同體外檢測基本一致，其測試原理已經歷了三代傳感器類型的發展[7]，主要作用機制如圖 1所示。目前，植入式傳感器的最大瓶頸是傳感器的使用壽命只有3~5天，這是因為傳感器植入機體組織后，會受到多種機制影響而失效，具體解釋見下一章節。因此，制備高效長壽命的傳感器是連續血糖監測的關鍵環節。
圖1
三代葡萄糖傳感器的電子傳遞機制示意圖
Figure1.
Schematic diagram of electron transfer mechanisms with three generation enzymatic glucose biosensors
2 植入式葡萄糖傳感器的失效機制
傳感器植入體內后的失效機制主要有如下幾種可能：①體內的異物反應(foreign body reaction, FBR)導致傳感器失效，是植入后面臨的最主要難題；②細胞外基質的蛋白酶滲透到器件中以及反應產物過氧化氫的聚集導致固定酶失效；③固定酶分子隨著環境變化導致酶蛋白質結構變異，分子識別功能喪失；④膜的性質隨著時間、溫度而變化，如膜密度的變化可以改變分析物、產物以及媒介體的輸運性質；⑤材料與器件故障，如膜的脫落、引線連接的斷裂等。
傳感器在植入之后首先在傷口引起炎癥反應，隨后是傳感器與蛋白質、細胞以及組織之間長期交互作用容易造成異物反應。如圖 2所示，任何植入的醫療器械裝置都會擾亂宿主介質，損壞毛細血管并產生免疫應答。異物反應主要過程如下：①形成一個臨時基質(數分鐘到數小時)；②急性炎癥反應(數天)；③慢性炎癥反應(數周)；④肉芽組織的形成(數周)；⑤纖維包膜的形成(數周到數月)[8]。
圖2
異物反應過程示意圖
Figure2.
Schematic diagram of the foreign body reaction
在植入過程的早期，形成的臨時基質隨著血液/材料交互作用和蛋白質黏附形成周圍異物，并提供結構、生物化學以及細胞成分來與身體形成異物反應。來自臨時基質中的化學引誘物、細胞因子、生長因子以及其它生物活性劑除了調節巨噬細胞的表型外，還可以提高細胞的增殖與活化。因此，臨時基質被認為是一種天然的衍生膜，通過釋放生物活性劑來控制炎癥反應的后續階段[9]。在此階段，生物分子與傳感器膜層的黏附通常導致傳感器對葡萄糖的響應下降幅度超過50%。使用質譜蛋白質組學分析生物分子附著在植入傳感器的動物實驗結果表明：炎癥細胞和較大蛋白質分子的片段都滲入到傳感器膜層并導致葡萄糖擴散能力的下降[10]。
急性炎癥反應的生物作用是吞噬異物，巨噬細胞消化植入物的過程會影響體內傳感器的性能。Klueh等[11-12]的結果證實巨噬細胞在體內與體外扮演著葡萄糖與氧氣之間擴散代謝障礙的角色，并因此對連續血糖監測具有重要影響。
緊隨急性炎癥之后，由于巨噬細胞、單核細胞和淋巴細胞以及血管的增殖和結締組織的存在，植入部位進入到慢性炎癥階段。該過程開始阻止巨噬細胞長大使得巨噬細胞融合形成異物巨細胞(foreign body giant cells，FBGCs)，企圖進一步消耗/降解植入異物。這種結果會導致分析底物的擴散以及局部組織相對濃度的降低。另外巨噬細胞可消耗氧和葡萄糖產生的超氧化物和過氧化氫，影響到電化學傳感器的響應。在免疫反應的最后步驟中，膠原蛋白在植入異物周圍的相互作用下形成纖維包膜，使得傳感器完全從局部組織環境中隔離，因此限制了葡萄糖的擴散，從而使得該傳感器不能測量或報告宿主的實際血糖水平。總之，在設計植入式葡萄糖傳感器時，復雜的免疫反應以及各個階段的異物反應都應該被考慮進去，從而提高葡萄糖傳感器的性能。
3 提高傳感器植入壽命的途徑
當傳感器植入組織后會形成一個組織-傳感器界面，這個界面的相容性對于傳感器的正常穩定工作起到決定性作用。這個界面反應較為復雜，可分為初期、中期和后期三個階段。因此，如何優化電極-組織生物界面已成為了一個最具挑戰的問題，同時也是提高植入式傳感器壽命的關鍵步驟。提高人體組織與傳感器的界面相容性有以下幾種主要途徑：①傳感器的微納設計；②生物相容性膜設計與合成；③添加適當的緩釋藥物。
3.1 傳感器的微納設計
為了減少異物反應，現行的設計方法將傳感器與相關的電子和通訊硬件分開，硬件系統被置于體外，而傳感器則置于皮下、靜脈或通過肌注方式植入等。其中皮下組織被認為是植入最為合適的部位，因為該部位便于進行外科手術以及傳感器的更換。此外，為了最大限度地減少傳感器植入時所引起的創傷及大量出血，植入式傳感器的尺寸不宜太大。為限制和緩解植入后炎癥反應，目前主流的傳感器都沿用此類設計方法，因而傳感器通常被設計成針形[13](如圖 3所示)、多針、針列、線圈型等。
圖3
針形植入式葡萄糖傳感器示意圖
Figure3.
Schematic diagram of needle-type implantable glucose biosensor
典型的針式電極具有電極植入方式靈活、各種膜層容易涂覆、組織反應程度小等優點而被廣泛采用。通常采用兩電極結構，即以導電的鉑絲、金絲、碳化纖維作為工作電極，Ag/AgCl作為參比電極。此外，可以采用平面微電極和微電極陣列來代替針式電極，也可以通過絲網印刷和噴墨印刷碳膠制作工作電極。螺旋型鉑銥合金電極最早由美國Moussy教授提出，采用螺旋型鉑銥合金電極來擔載葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)，與上述針式結構相比，該器型螺旋孔道結構可以擔載更多酶，從而能延長器件植入后的使用壽命。作者隨Moussy教授工作多年，本課題組也一直從事植入葡萄糖傳感器的深度開發，包括螺旋鉑-銥電極(如圖 4所示)[14]、碳納米管(carbon nanotube，CNT)纖維電極[15]和CNT陣列與納米Ni復合無酶電極[16]，并制備出一套基于Zigbee模塊的小型連續血糖監測系統[17]。此外，植入器件時，應當避免出現尖角和邊緣，由于體內存在大量的移動微組織，一旦有鋒利的尖角和邊緣存在，會成為炎癥反應的刺激點從而加劇炎癥反應，導致傳感器的失效[18-19]。
圖4
螺旋電極示意圖
1：特氟龍包覆的Pt-Ir絲；2：Ag/AgCl絲；3：封裝膜；4：Epoxy-PU半透膜；5：GOD；6：去包覆的Pt-Ir線圈；7：纖維材料
Figure4. Schematic diagram of spiral-type Pt-Ir electrode1: PTFE coated Pt-Ir wire; 2: Ag/AgCl wire; 3: sealing membrane; 4: Epoxy-PU semi-permeable membrane; 5: glucose oxidase; 6: Pt-Ir coil; 7: fiber materials
3.2 生物相容性膜材料
為了滿足體內植入的苛刻要求，最常見的方法是將傳感器的生物相容性薄膜制成與主體類似的仿生結構。聚合物的涂覆有利于緩解炎癥反應，并具有以下幾個特點：①阻止氧化酶的流失，并可以選擇性地過濾干擾分子；②限制葡萄糖的滲透量，改善電極對氧的依賴性，提高傳感器的檢測線性范圍；③此膜直接與皮下組織相接觸，可通過結構設計和調制來提高生物相容性。在眾多的聚合物材料中，Nafion、聚氨酯(polyurethane，PU)以及各種復合水凝膠已成功地運用到植入傳感器中。
Nafion是一種全氟磺酸系聚合物，Moussy等[20]通過將包覆Nafion涂層的連續血糖監測探頭植入到犬科動物，可以使傳感器正常工作10天，使用后膜有著明顯的開裂從而導致了傳感器的失效。Chen等[21]研制出多孔聚偏氟乙烯和納米球型Nafion復合涂層，該涂層構建的傳感器植入到小鼠后，具有快速、線性地血糖濃度變化響應，并表現出與周圍組織良好的生物相容性。
聚氨酯廣泛地應用于生物傳感器外層膜，作為與主體組織周圍相容的膜材料。王寧等[22]報道了一種用于微型植入式葡萄糖傳感器的多孔聚氨酯膜。該靜電涂層取代了傳統的環氧聚氨酯外涂層，主要充當傳質限制膜并顯著地提高了檢測線性度，此外，該涂層具有可控的纖維多孔結構和厚度。Wang等[23]采用靜電紡絲技術制備出具有多孔結構的聚亞安酯纖維膜，并探討了分級多孔結構的尺寸效應對滲透性和表面性的影響。相比于傳統的成膜工藝，靜電紡絲可制備出高比例的孔隙、廣泛互聯的孔道、并具有良好的可裁剪性，可應用于生物傳感器表面涂層。
目前，最受研究者關注的生物膜材料是水凝膠。水凝膠是由水溶性高分子與水形成三維網絡結構，具有多孔、親水等特點，是一種高吸水性材料。當在生理環境中，水凝膠可以緩解蛋白質吸附和纖維包膜。因此，水凝膠被認為是制備植入式葡萄糖傳感器的重要生物膜材料。Yu等[24]討論了水凝膠膜在植入式葡萄糖傳感器的作用，該研究表明，涂覆水凝膠的傳感器都可以正常工作21天以上，組織學研究表明其壽命的延長歸因于水凝膠的涂覆減少了纖維包膜。Lin等[25]研究了一種新型的葡萄糖敏感水凝膠(glucose-sensitive hydrogel，GSH)，發現此凝膠涂覆后體系具有更快的反應動力學并明顯減少了果糖的干擾，非常適合應用于體內葡萄糖傳感器監測。Wang等[26]制備了一種用聚(乳酸-乙醇酸)[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]共聚物微球分散于聚(乙烯醇)[poly(vinyl alcohol)，PVA]的水凝膠，這種新型聚合物涂層涂覆在傳感器外圍，可作為一種“智能”藥物釋放系統直接在植入位點釋放，從而緩解異物反應，進而提升體內傳感器性能。
3.3 適當的添加緩釋藥物
急性炎癥反應和隨后的纖維包膜會減弱酶底物和氧氣傳遞到傳感器電極的通量，從而導致了傳感器的失效。因此，引入合適的藥物緩釋涂層可以防止局部組織發炎，并增加毛細血管的生成。緩釋藥物包括抗炎藥物(地塞米松，dexamethasone，DX)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和抗凝劑(肝素)。
糖皮質激素類藥物DX同時具有抗炎性和免疫抑制作用，在植入后可以抑制炎癥反應，將組織傷害降到最小化，使得正常組織再生，從而限制纖維包膜形成。通常水凝膠與微球的藥物遞送組合被認為是用作可植入式傳感器生物相容涂層的最佳手段，可以最大限度減少異物反應。Wang等[27]探討了DX加載PLGA微球/PVA復合水凝膠對傳感器的影響。結果表明：該復合涂層不會影響傳感器的線性范圍，反而使得線性范圍遠超過人體生理血糖濃度范圍(2~22 mmol/L)，因此可以用作植入葡萄糖傳感器的智能涂層，以提高傳感器在體內的存活壽命。隨后，Vaddiraju等[28]在此基礎上，通過在工作電極的電化學表面重建產生一個三維納米多孔結構，來增加其電化學工作面積，成功研制了在靈敏度和大信噪比方面增強的傳感器。Vallejo-heligon等[29]設計了一種具有多孔、DX釋放PU涂層的葡萄糖傳感器，動物研究表明，DX釋放的多孔PU膜植入大鼠皮下組織可明顯緩解初始炎癥反應。綜上，可以認為DX的釋放是一種有效改善葡萄糖傳感器性能的方法。盡管糖皮質激素作用的確切機制尚不清楚，但是，從植入后活性釋放的DX研究表明，DX的添加可以明顯減少炎癥反應。
VEGF作為促進組織血管生成的釋放試劑被廣泛研究。除抑制炎癥反應，它的主要功用是促進植入部位的新血管生成、緩解纖維包膜，從而提高傳感器壽命。Kastellorzios等[30]針對DX、VEGF、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)等三種機體組織的反應調節劑在遞送過程中的協同作用進行了系統的研究。實驗發現：三種反應調節劑的協同作用下可以最大限度促進血管生成、生長，并抑制炎癥反應；此外，VEGF調節劑的用量應高于PDGF的劑量，增加DX的用量同時需要增加VEGF的使用量。
4 植入傳感器的注意事項
4.1 生物分子的干擾
生物分子干擾物分為外源性和內源性分子。內源性分子(指人體內原本就存在的分子)干擾物包括：尿酸(uric acid，UA)、抗壞血酸(ascorbic acid，AA)、多巴胺(dopamine，DA)等。外源(指任意藥物或食物中所含的活性分子)干擾物有對乙酰氨基酚(acetaminophen，AP)等。這些干擾物都具有電化學活性，在工作電極上施加較高的氧化電位時，同樣會將這類干擾物氧化，從而影響測量的準確性。目前，消除這些干擾物最常用的方法是在傳感器上使用一層選擇性膜。這些膜通常根據尺寸大小、電荷以及極性來篩選調節各個參與反應的分子和離子的擴散通量，從而有效限制干擾分子進入。電聚合膜如聚鄰苯二胺、多酚和聚氨基苯酚已經證實對減少干擾物影響非常有效，可以明顯改善選擇性和線性檢測范圍。電聚合膜的另一個優點是薄且均勻，可以被選擇性地沉積到具有復雜幾何形狀的微電極上[31]。此外，通過對電極進行改性，例如納米材料的應用，可明顯降低傳感器的工作電位，是有效減少生物體中電活性干擾物影響的重要途徑。
4.2 氧氣的依賴
電化學檢測過氧化氫，需要氧氣作為輔助物參與到酶促反應。在間質液中氧氣濃度大約為葡萄糖溶液中濃度的十分之一。因此很容易出現“氧缺乏”狀態，使得基于氧化酶的葡萄糖傳感器在葡萄糖高濃度區失去線性度。一般情況下，當植入部位處于麻醉狀態時，皮下氧分壓范圍為40~130 mm Hg。為減少氧氣依賴，提高傳感器的線性度，可以采用以下2種方法：①采用擴散限制層，如聚氨酯或聚碳酸酯。它可以改變葡萄糖和氧氣的通量并增加氧/葡萄糖透過率的比值，從而減少氧依賴性并提高生物傳感器的上限。例如，Zhang等[32]報道，在電極外層浸涂3％的聚氨酯溶液使得傳感器線性范圍上限提高到25 mmol/L。②提高氧傳質速率。Gough等[33]通過在一個二維圓筒電極側壁涂覆聚二甲基硅氧烷來減少葡萄糖流量，通過高效滲透氧氣方法解決氧缺乏。對于植入式傳感器而言，必須做到氧氣分壓在20 mm Hg時才可以正常工作。
4.3 一氧化氮的作用
一氧化氮(nitrogen oxide, NO)是一種強效的抗血栓和抗炎劑，早在20世紀80年代，就被發現是一種血管內皮衍生松弛因子，可以控制放松和平滑肌細胞襯脈管收縮。研究表明，NO在血管生成、癌癥生物學和骨重塑等領域發揮著重要作用。治療性材料如能可控地釋放NO，則可以促進植入物的生物相容性，但是NO有效遞送效率低被認為是限制NO靶向治療的重要瓶頸。Soto等[34]在針式電極上涂覆含有NO釋放物的聚氨酯膜層，經NO緩釋的傳感器可以明顯改善傳感器植入1~3天后的精度，同時延遲響應時間減少到4.2 min。Koh等[13]將NO供體加載纖維修飾到多孔聚氨酯膜包覆的針型植入式傳感器中，當這些多孔纖維膜厚度≤50 μm時，不會影響生物傳感器的性能。盡管這些研究強調NO釋放物可以改善FBR反應，但畢竟處在早期研究階段，其機制尚未完全闡釋，需要更深入細致地研究。
5 小結與展望
連續血糖監測用植入式傳感器的發展包括生物相容性膜的開發、表面改性[35]和電極微型化幾個方面，提高植入傳感器的分析靈敏度和精度、減少身體異物反應并最終延長器件壽命是一項極富挑戰的工作。雖然上文所敘的一些方法，已經被采用且被證實是非常有效的，但高效長壽命的植入式傳感器件至今仍不完善。因此，在今后的研究工作可以密切關注以下問題：①酶的穩定性：酶的穩定性在植入式生物傳感器中至關重要，直接決定了信號的重現性和分析性能。酶的穩定性主要受固定酶的方法和微環境的影響。Harris等[36]總結了過氧化氫、小分子材料(抗壞血酸鹽、尿素鹽、半胱氨酸等)的聚集和戊二醛交聯三者對氧化酶降解的影響，指出葡萄糖氧化酶基因改性并輔之以硅凝膠封裝是一條提高植入傳感器壽命有效的辦法。②生物分子的干擾：通過涂覆選擇性半透膜來減少內源性分子(UA、AA、DA)和外源性分子(AP)等電化學活性物質的干擾。此外，通過傳感器電極設計，將工作電位降低、甚至到負電位，可以有效緩解干擾物的影響。③氧氣的含量：電化學檢測過氧化氫，需要氧氣作為輔助參與到酶促反應。在間質液中氧氣濃度大約為葡萄糖溶液濃度的十分之一，而導致出現“氧缺乏”狀態，需要通過增加外層擴散限制膜、電聚合物[37]或者電子媒介體來緩解。④生物相容性膜材料：通過構建新型復合水凝膠，比如內層采用靜電逐層自組裝技術(layer-by-layer，LBL)來沉積高分子電解質，改善膜表面電性，從而緩解帶電蛋白質的表面淤積。為了減少纖維包膜的形成，外層可以采用共聚物水凝膠，通過物理及化學膠凝方式來形成網絡互穿結構，打破纖維形成的連續包膜。通過此復合結構涂層來同時緩解電極表面的蛋白質淤積和纖維包膜的形成，從而緩解異物反應。
