對不同代數去卵巢骨質疏松模型大鼠骨髓間充質干細胞（OVX-rBMSCs）生物學活性進行綜合評價，為進一步選取藥物篩選的細胞模型提供實驗依據。采用全骨髓貼壁篩選法，體外分離、培養OVX-rBMSCs，并通過形態學觀察、細胞表面分子標記物（CD29、CD45、CD90）檢測、細胞增殖能力檢測、多向誘導分化實驗（成骨、成脂、成軟骨、成神經、成內皮誘導）等技術對P1、P2、P3、P4代OVX-rBMSCs的細胞生物學活性進行綜合評價。結果顯示，全骨髓貼壁篩選法成功分離培養OVX-rBMSCs，其中P4代細胞呈典型的干細胞形態特征，表面標記物（CD29、CD90）陽性率、細胞增殖指數以及向成骨、成脂、成軟骨、成神經、成內皮方向的分化能均優于P1、P2、P3細胞（P < 0.05）。結果表明：隨著傳代次數增加，OVX-rBMSCs純度及生物學活性指標逐漸優化，其中，P4代均優于其他各代細胞，可作為骨質疏松藥物篩選的細胞模型。
引用本文： 王彥焱, 凌彬, 趙志杰, 呂鑫, 羅麗, 龔忠誠, 趙春梅, 吳江. 不同代數去卵巢骨質疏松大鼠骨髓間充質干細胞的生物學活性綜合評價. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(5): 916-922. doi: 10.7507/1001-5515.20160148 復制
引言
近年來，原發性骨質疏松的發病率和死亡率隨著我國步入老齡化社會而逐年急劇增加，成為當前亟待解決的主要公眾健康問題[1]。藥物(如雌激素替代療法)是目前預防和治療骨質疏松，尤其是婦女絕經后骨質疏松的主要治療手段，其作用是減少骨丟失、增加骨量、降低骨脆性、提高骨強度，從而降低發生骨質疏松骨折的概率[2]。然而，藥物亦有其不可忽視的一些副作用。例如，不適當或長期使用雌激素會大大增加子宮內膜癌和乳腺癌的罹病風險，甲狀旁腺激素類藥物(如Teriparatide)有惡心、頭痛、關節痛等不適；而非激素類藥物如二磷酸鹽會增加女性患者心房纖顫的發病風險[3-4]。因此選擇一種適當的藥物評價模型對于研制、開發骨質疏松藥物具有重要的現實意義。
目前卵巢切除術(ovariectomy，OVX)后所建立的絕經后骨質疏松動物模型，仍然是普遍采用的骨質疏松藥物篩選模型之一。近期研究發現，骨量減少而脂肪組織增多是絕經后骨質疏松癥的特征性病理表現，學者認為其細胞學機制是由于成骨細胞和脂肪細胞的前體細胞——骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向兩者的分化能力發生了改變，尤其是BMSCs成骨分化能力下降，使得骨形成受阻，骨形成與骨吸收過程失衡，從而導致骨質疏松的發生[5]。這種復雜的細胞學機制，一方面為骨質疏松發生發展的機制提供了良好的研究思路，同時也為骨質疏松藥物的開發和研制帶了契機。尤其是，從經濟高效的考量來看，更應該在動物模型之前優先選擇細胞模型，才能適應近年來發展起來的高通量藥物篩選技術(如功能基因組和生物信息學)的迫切需要。
BMSCs可向不同譜系骨組織細胞系進行分化，其生長增殖能力和分化特性發生改變是骨質疏松發生發展機制中不可忽視的細胞學基礎。另外，BMSCs具有取材較為方便，易于分離、純化，不存在倫理問題等特點，且細胞建模周期短，可大規模擴增應用于骨質疏松藥物，特別適用于小分子靶向性藥物的篩選和評價。可見BMSCs是研究骨質疏松發生機制、研制開發及高通量篩選骨質疏松藥物的良好細胞模型。所以，BMSCs有望成為替代動物模型的有效評價手段。然而，目前所應用的BMSCs細胞純度及生物學活性較不穩定，嚴重制約了藥物評價效果[6]。因此，如何體外分離培養、純化BMSCs，獲得大量生物學活性穩定的BMSCs是目前高通量藥物篩選技術迫切需要解決的問題。本文在前期研究的基礎上，采用全骨髓貼壁篩選法，建立絕經期骨質疏松大鼠動物模型，體外分離、純化去卵巢骨質疏松大鼠BMSCs (ovariectomy rat BMSCs，OVX-rBMSCs)，進一步對不同代數OVX-rBMSCs細胞生物學活性進行綜合評價，以期為骨質疏松藥物篩選的細胞模型選取提供實驗基礎。
1 實驗材料及方法
1.1 實驗動物
采用本實驗室常規方法[7]，選用6月齡未交配的雌性SD大鼠10只，質量(250±20) g，購自新疆醫科大學動物實驗中心。實施卵巢切除術，在無菌條件下行雙側卵巢切除手術，術后3個月檢測骨代謝指標，確定大鼠骨質疏松模型成功建立后，用于后續細胞學實驗。動物實驗設計、實施過程符合動物福利和倫理委員會相關標準。
1.2 實驗試劑
DMEM(高糖)培養液、DMEM(低糖)培養液、胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)等購自HyClone公司。異丁基甲基黃嘌呤(isobutylmethylxanthine, IBMX)、吲哚美辛、胰島素、β-磷酸甘油、維生素C、地塞米松、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、1%ITS-A、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、3-叔丁基-4-羥基茴香醚(Butylated hydroxyanisole, BHA)、流式細胞用單抗(CD29-PEcy5、CD45-PE、CD90-FITC)、同型陰性對照(IgGI-FITC、IgG2a-PE)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)、茜素紅、油紅O等均購自Sigma公司。兔抗鼠Ⅱ型膠原(collagen type Ⅱ，ColⅡ)、神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、血管性血友病因子(von Willebrand Factor，vWF)等單克隆抗體購自武漢博士德公司。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色試劑盒購自南京建成公司。細胞增殖CCK-8檢測試劑盒購自Gibco公司。
1.3 實驗方法
1.3.1 OVX-rBMSCs體外細胞分離、培養
OVX術后3個月，選取已成功建立骨質疏松模型大鼠，10%水合氯醛(0.5 mL/100 g體重)腹腔注射麻醉，75%乙醇消毒后，無菌分離大鼠脛骨和股骨，剪骨骺端關節面，暴露骨髓腔。用5 mL注射器沖洗骨髓腔至變白，用1 mL注射器將細胞吹散，混懸細胞計數，按8×106個/mL密度、含10% FBS的DMEM全培養液接種培養皿。置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中靜置培養。48 h后首次半量換液，除去未貼壁細胞。此后每3天換液一次，去除未貼壁細胞。待細胞長到80%～90%時，進行傳代。
1.3.2 形態學觀察
在倒置相差顯微鏡、掃描電鏡(scanning electronic microscopy, SEM)和透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)下，觀察P1、P2、P3、P4代細胞培養至第3天時的大體形態和超微結構。
1.3.3 流式細胞儀檢測細胞表面標記物和細胞周期
選取P1、P2、P3、P4細胞，胰酶消化2 min，離心(1 000 r/min, 5 min)，用PBS洗2遍后，離心重懸計數細胞(1×106個)，按照流式細胞術操作規程，細胞樣本依次加入2.5 μL CD29、CD45、CD90單抗和同型陰性對照抗體。4 ℃避光孵育30 min，用PBS液(含1% BSA)洗滌細胞3次，細胞重懸后上機檢測細胞表面標記。同時，選取P1、P2、P3、P4細胞，胰酶消化并離心收集細胞(800 r/min)，棄上清，用預冷PBS洗細胞兩次，加入預冷70%乙醇，－20 ℃固定保存過夜，PBS清洗，依次加入500 μL PBS(含50 μg/mL溴化乙錠、100 μg/mL RNase A)，4 ℃避光孵育20 min，上機檢測細胞周期，根據公式計算細胞增殖指數：增殖指數(proliferous index，PI)=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%。
1.3.4 酶標儀法檢測細胞增殖活力
選取P1、P2、P3、P4細胞接種于96孔培養板實驗孔中，每孔加入DMEM全培養液，對照孔中只加入DMEM培養液，37 ℃、5% CO2靜置培養，每3天換液1次。按照CCK-8檢測試劑盒說明書，連續8天測定450 nm處各孔光吸收值(OD)，比較各代細胞增殖活力。
1.3.5 誘導分化
選擇P1、P2、P3、P4細胞，接種于3.5 cm培養皿，待細胞匯合率達80%時，進行下列實驗：①成骨誘導液(1×10-7 mol/L地塞米松、1×10-2 mol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C)誘導培養細胞至第9天，行ALP化學染色，第21天行茜素紅染色；②成脂誘導液(1×10-6 mol/L維生素C、5 mg/L胰島素、1×10-4 mol/L IBMX、6×10-7 mol/L吲哚美辛)誘導培養細胞至第7天，行油紅O染色；③成軟骨誘導液(10 ng/ mL TGF-β1、1×10-7 mol/L地塞米松、50 mg/L維生素C、1% ITS-A)誘導培養細胞至第10天，行Ⅱ型膠原免疫組化染色；④成神經誘導液(100 mg/L BHA、10 ng/mL bFGF、2% DMSO)作用細胞7 d后，行NSE免疫組化染色；⑤成內皮誘導液(10 ng/mL VEGF、2 ng/mL bFGF)作用細胞14 d后，行vWF免疫組化。應用圖像分析軟件(Image Pro Plus 5.0美國；IOD分析法)對上述各組陽性圖像結果進行定性、定量統計分析。
1.4 統計方法
實驗數據以均數±標準差(x±s)表示，采用SPSS 13.0進行統計分析。組間比較采用獨立樣本t檢驗分析，組內比較采用重復測量方差分析，P < 0.05時認為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 形態學觀察
如圖 1所示，倒置相差顯微鏡下可見，OVX-rBMSCs細胞接種于培養皿時，細胞形態為類圓型。24 h后，貼壁細胞不多，為不規則圓形或多角形。48 h后已有較多細胞開始貼壁，細胞胞體逐漸拉長，變為梭形，為典型的間充質細胞形態。繼續培養3～4天后，細胞呈克隆樣生長，形成多個小細胞集落，并呈放射狀排列；細胞傳代后，生長迅速，培養24 h細胞即可貼壁伸展，立體感明顯，細胞胞體狹長，胞質較少，胞核圓形或橢圓形。3天后，散在的細胞克隆集落匯合，呈放射狀、螺旋狀或者是魚群狀排列，逐漸融合成片，鋪滿皿底。以上特點P4細胞尤其突出。掃描電鏡下觀察，P3、P4代OVX-rBMSCs細胞偽足樣突起明顯，胞體表面有多個細胞囊泡樣結構。透射電鏡下觀察，各代細胞表面皆有長而粗的纖毛狀突起，數量較多，細胞間連接緊密，細胞胞質內線粒體、粗面內質網、初級溶酶體、次級溶酶體等細胞器豐富，核仁亦清晰，呈“核大漿少”的典型干細胞形態。P4代OVX-rBMSCs細胞中間充質樣細胞所占比例明顯較P1、P2、P3代細胞高，可見分裂相細胞，表明P4細胞純度較其他各代高，且增殖能力旺盛。
圖1
去卵巢骨質疏松模型rBMSCs形態學觀察
Figure1.
Morphological observation of OVX-rBMSCs
2.2 流式細胞儀檢測細胞表面標記物和細胞周期
表面標記物結果顯示：隨著細胞傳代次數增加，間充質干細胞表型CD29、CD90表達的陽性率明顯升高，而造血干細胞表型CD45表達逐漸轉為陰性。統計分析結果顯示：P4與P1、P2(CD29、CD45、CD90)組間比較，差異有統計學意義(P < 0.05)。由此說明P4代OVX-rBMSCs細胞中間充質干細胞純度最高(如圖 2和表 1所示)。細胞周期分布及細胞增殖指數計算結果顯示：P4與P1、P2組間比較差異有統計學意義(P < 0.01)，說明P4代OVX-rBMSCs細胞中增殖細胞所占百分比最大，生長活性最強(如表 2所示)。
圖2
流式細胞術檢測P4代OVX-rBMSCs細胞表面分子標記物表達
Figure2.
Surface marker expression of P4 OVX-rBMSCs cells by flow cytometry
表1
流式細胞術檢測OVX-rBMSCs細胞表面分子標記物表達值(x±s, n=4)
Table1.
Surface marker expression values of OVX-rBMSCs cells by flow cytometry (x±s, n=4)
表2
OVX-rBMSCs細胞周期分布和增殖指數(x±s, n=4)
Table2.
Cell cycle distribution and proliferation index of OVX-rBMSCs (x±s, n=4)
2.3 細胞增殖活力
細胞增殖活力檢測結果顯示：在細胞接種后1～2天，細胞OD值基本上沒有上升，為潛伏適應期；第3～6天細胞OD值呈倍數增長，表明細胞進入對數生長期；第7天后細胞OD值逐漸平穩，至第8天細胞增殖進入平臺期。細胞增殖OD值統計學分析顯示：P4與P1、P4與P2組間比較，差異有統計學意義(P < 0.05)，結合流式細胞檢測增殖指數結果，說明P4代OVX-rBMSCs細胞增殖能力最強(如表 3所示)。
表3
OVX-rBMSCs細胞增殖OD值(x±s, CCK-8 KIT，n=3)
Table3.
The OD value of OVX-rBMSCs (x±s, CCK-8 KIT, n=3)
2.4 OVX-rBMSCs細胞多向誘導分化潛能
OVX-rBMSCs細胞多向誘導分化實驗結果如圖 3和表 4所示。成骨誘導分化后，OVX-rBMSCs細胞形態由原來細長的梭形細胞變為扁平的多角形，胞漿及部分胞體邊緣出現棕黃色深染顆粒；檢測成骨標志物ALP結果顯示：P4與P1組間比較差異有統計學意義(P < 0.01)；P4與P2組間比較，差異也有統計學意義(P < 0.05)。茜素紅染色結果顯示：各組細胞呈漩渦狀密集生長，團簇細胞處經茜素紅染色后，細胞分泌形成的礦化結節呈橘紅色。IOD分析結果發現，P4與P1組間比較差異有統計學意義(P < 0.01)；P4與P2組間比較，差異也有統計學意義(P < 0.05)。成脂誘導分化后，細胞由原來的長梭形逐漸變為卵圓形，胞漿豐富，胞核被擠至細胞胞漿邊緣，行油紅O染色，胞漿內脂滴被染成深紅色。IOD分析法對實驗結果進行定量分析顯示，P4與P1組間比較差異有統計學意義(P < 0.01)；P4與P2組間比較，差異也有統計學意義(P < 0.05)。成軟骨誘導分化后，細胞形態逐漸變為橢圓形樣的上皮細胞形態，隨著培養天數的增加，細胞間基質呈片層狀，對各代細胞分泌軟骨外基質行Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示，細胞胞質及胞外均被染成棕色或棕褐色，細胞聚集部位陽性顏色較深；IOD分析法結果發現，P4與P1、P4與P2組間比較，差異均有統計學意義(P < 0.05)。成神經誘導分化后，細胞數量逐漸變少，形態也逐漸變得更加狹長，細胞突觸樣結構明顯；行NSE免疫組織化學染色顯示：細胞漿及胞膜處被染成棕黃色，P4與P1、P4與P2組間IOD值比較，差異均有統計學意義(P < 0.05)。成內皮誘導分化后，細胞變為鋪路石樣外觀，細胞間連接緊密，行vWF免疫組織化學染色顯示，細胞胞漿及胞膜處出現大量棕黃色深染顆粒；P4與P1、P4與P2組間IOD值比較，差異均有統計學意義(P < 0.05)。
圖3
OVX-rBMSCs成骨、成脂、成軟骨、成神經和成內皮誘導分化結果
Figure3.
Osteogenic, adipogenic, chondrogenic, neural and endothelial induced differentiation of OVX-rBMSCs
表4
OVX-rBMSCs誘導分化各指標IOD法圖像分析結果(x±s, n=6)
Table4.
IOD values of induced differentiation items of OVX-rBMSCs (x±s, n=6)
3 討論
研究表明，動物模型在藥物篩選中的缺點越來越凸顯，往往因為藥物代謝的種屬差異以及藥物本身的化學性質、給藥途徑等不同，導致實驗結果不理想，也令骨質疏松藥物的研發周期和費用亦急劇增加[8]。近年來新型多肽及小分子靶向類藥物(如氯化鋰、src酪氨酸激酶抑制劑、Cbfα1調控劑等)越來越受到骨質疏松藥物研究者的青睞，然而，動物實驗和臨床前期藥效評價過程中總會得出陰性或相反的結論[9]。究其原因，除了骨質疏松發生機制本身非常復雜外，主要還是由于在藥物研制過程中，使用動物模型的差異性結果干擾了后期的臨床藥效學評價，因此，還需要進一步深入研究骨質疏松發生機制，嚴格遵循隨機雙盲研究，篩選給藥途徑，選擇最佳劑量，尤其應使用最佳的細胞學模型進行前期藥物的特異性量效關系研究[10]。這不僅為深入認識骨質疏松的發病機制提供實驗依據，更為發現新的骨質疏松藥物治療途徑、尋找新的靶向性多肽及小分子藥物提供理論參考。
BMSCs來源于中胚層，能夠在誘導因素下向多胚層細胞發生分化，在組織修復和退行性疾病中發揮著重要的作用[11]。特別是，BMSCs是成骨細胞的前體細胞，可從更上游的干細胞分化活性來客觀評價藥物的敏感性和藥效學機制。所以，BMSCs是骨質疏松藥物篩選較為理想的模型細胞[6]。體外分離純化骨質疏松相關疾病的BMSCs，研究其培養、生物學特性，對于模型干細胞的選取具有重要的現實意義。
據文獻報道，目前體外培養BMSCs的方法主要有全骨髓貼壁篩選分離法、密度梯度離心法、流式細胞儀法及免疫磁珠法等四種方法[12]。其中，全骨髓貼壁篩選分離法對實驗條件要求不高，操作方便，耗材單一，一次分離的有核細胞可達107個數量級，培養周期短，被研究者廣泛采用；密度梯度離心法操作步驟繁瑣，分離試劑要求特殊，離心剪切應力對細胞生物學活性有一定影響；流式細胞儀法及免疫磁珠法對操作平臺和操作人員的技術要求較高，且價格昂貴，一次分離所獲得的有核活性細胞較少。因此，從經濟、簡便、高效的角度考慮，本實驗采用全骨髓貼壁篩選分離法，體外分離、培養OVX-rBMSCs。對OVX-rBMSCs P1、P2、P3、P4代生物學活性進行綜合性評價，進而選擇出最佳活性狀態細胞。結果顯示：各代細胞呈典型的長梭形細胞，且胞質較豐富，胞核圓而大、核仁較清楚，其中P4細胞具備典型“核大漿少”的干細胞形態學特征，且間充質干細胞典型的CD29、CD90表面標記物表達最高。這與Zhang等[13]所研究的BMSCs生物學活性結果是一致的。進一步研究顯示，P4代細胞增殖能力較其他代數細胞強，這可能與細胞傳代有關，隨著傳代次數增加，雜細胞被逐步篩選掉，OVX-rBMSCs純度依次提高，細胞整體增殖能力進一步加強。另外，對分化誘導實驗結果進行分析，結果發現：P1、P2、P3、P4代OVX-rBMSCs均能向成骨、成脂、成軟骨、成神經和成內皮等方向發生分化，其中，P4代細胞分化能力最強。
綜上所述，本研究所采用的全骨髓貼壁培養法可以有效分離、培養OVX-rBMSCs，且隨著傳代次數增加，干細胞純度及生物學活性指標逐漸優化，其中，P4代均優于其他各代細胞，可作為后續骨質疏松藥物篩選的優選模型細胞。
引言
近年來，原發性骨質疏松的發病率和死亡率隨著我國步入老齡化社會而逐年急劇增加，成為當前亟待解決的主要公眾健康問題[1]。藥物(如雌激素替代療法)是目前預防和治療骨質疏松，尤其是婦女絕經后骨質疏松的主要治療手段，其作用是減少骨丟失、增加骨量、降低骨脆性、提高骨強度，從而降低發生骨質疏松骨折的概率[2]。然而，藥物亦有其不可忽視的一些副作用。例如，不適當或長期使用雌激素會大大增加子宮內膜癌和乳腺癌的罹病風險，甲狀旁腺激素類藥物(如Teriparatide)有惡心、頭痛、關節痛等不適；而非激素類藥物如二磷酸鹽會增加女性患者心房纖顫的發病風險[3-4]。因此選擇一種適當的藥物評價模型對于研制、開發骨質疏松藥物具有重要的現實意義。
目前卵巢切除術(ovariectomy，OVX)后所建立的絕經后骨質疏松動物模型，仍然是普遍采用的骨質疏松藥物篩選模型之一。近期研究發現，骨量減少而脂肪組織增多是絕經后骨質疏松癥的特征性病理表現，學者認為其細胞學機制是由于成骨細胞和脂肪細胞的前體細胞——骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向兩者的分化能力發生了改變，尤其是BMSCs成骨分化能力下降，使得骨形成受阻，骨形成與骨吸收過程失衡，從而導致骨質疏松的發生[5]。這種復雜的細胞學機制，一方面為骨質疏松發生發展的機制提供了良好的研究思路，同時也為骨質疏松藥物的開發和研制帶了契機。尤其是，從經濟高效的考量來看，更應該在動物模型之前優先選擇細胞模型，才能適應近年來發展起來的高通量藥物篩選技術(如功能基因組和生物信息學)的迫切需要。
BMSCs可向不同譜系骨組織細胞系進行分化，其生長增殖能力和分化特性發生改變是骨質疏松發生發展機制中不可忽視的細胞學基礎。另外，BMSCs具有取材較為方便，易于分離、純化，不存在倫理問題等特點，且細胞建模周期短，可大規模擴增應用于骨質疏松藥物，特別適用于小分子靶向性藥物的篩選和評價。可見BMSCs是研究骨質疏松發生機制、研制開發及高通量篩選骨質疏松藥物的良好細胞模型。所以，BMSCs有望成為替代動物模型的有效評價手段。然而，目前所應用的BMSCs細胞純度及生物學活性較不穩定，嚴重制約了藥物評價效果[6]。因此，如何體外分離培養、純化BMSCs，獲得大量生物學活性穩定的BMSCs是目前高通量藥物篩選技術迫切需要解決的問題。本文在前期研究的基礎上，采用全骨髓貼壁篩選法，建立絕經期骨質疏松大鼠動物模型，體外分離、純化去卵巢骨質疏松大鼠BMSCs (ovariectomy rat BMSCs，OVX-rBMSCs)，進一步對不同代數OVX-rBMSCs細胞生物學活性進行綜合評價，以期為骨質疏松藥物篩選的細胞模型選取提供實驗基礎。
1 實驗材料及方法
1.1 實驗動物
采用本實驗室常規方法[7]，選用6月齡未交配的雌性SD大鼠10只，質量(250±20) g，購自新疆醫科大學動物實驗中心。實施卵巢切除術，在無菌條件下行雙側卵巢切除手術，術后3個月檢測骨代謝指標，確定大鼠骨質疏松模型成功建立后，用于后續細胞學實驗。動物實驗設計、實施過程符合動物福利和倫理委員會相關標準。
1.2 實驗試劑
DMEM(高糖)培養液、DMEM(低糖)培養液、胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)等購自HyClone公司。異丁基甲基黃嘌呤(isobutylmethylxanthine, IBMX)、吲哚美辛、胰島素、β-磷酸甘油、維生素C、地塞米松、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、1%ITS-A、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、3-叔丁基-4-羥基茴香醚(Butylated hydroxyanisole, BHA)、流式細胞用單抗(CD29-PEcy5、CD45-PE、CD90-FITC)、同型陰性對照(IgGI-FITC、IgG2a-PE)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)、茜素紅、油紅O等均購自Sigma公司。兔抗鼠Ⅱ型膠原(collagen type Ⅱ，ColⅡ)、神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、血管性血友病因子(von Willebrand Factor，vWF)等單克隆抗體購自武漢博士德公司。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色試劑盒購自南京建成公司。細胞增殖CCK-8檢測試劑盒購自Gibco公司。
1.3 實驗方法
1.3.1 OVX-rBMSCs體外細胞分離、培養
OVX術后3個月，選取已成功建立骨質疏松模型大鼠，10%水合氯醛(0.5 mL/100 g體重)腹腔注射麻醉，75%乙醇消毒后，無菌分離大鼠脛骨和股骨，剪骨骺端關節面，暴露骨髓腔。用5 mL注射器沖洗骨髓腔至變白，用1 mL注射器將細胞吹散，混懸細胞計數，按8×106個/mL密度、含10% FBS的DMEM全培養液接種培養皿。置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中靜置培養。48 h后首次半量換液，除去未貼壁細胞。此后每3天換液一次，去除未貼壁細胞。待細胞長到80%～90%時，進行傳代。
1.3.2 形態學觀察
在倒置相差顯微鏡、掃描電鏡(scanning electronic microscopy, SEM)和透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)下，觀察P1、P2、P3、P4代細胞培養至第3天時的大體形態和超微結構。
1.3.3 流式細胞儀檢測細胞表面標記物和細胞周期
選取P1、P2、P3、P4細胞，胰酶消化2 min，離心(1 000 r/min, 5 min)，用PBS洗2遍后，離心重懸計數細胞(1×106個)，按照流式細胞術操作規程，細胞樣本依次加入2.5 μL CD29、CD45、CD90單抗和同型陰性對照抗體。4 ℃避光孵育30 min，用PBS液(含1% BSA)洗滌細胞3次，細胞重懸后上機檢測細胞表面標記。同時，選取P1、P2、P3、P4細胞，胰酶消化并離心收集細胞(800 r/min)，棄上清，用預冷PBS洗細胞兩次，加入預冷70%乙醇，－20 ℃固定保存過夜，PBS清洗，依次加入500 μL PBS(含50 μg/mL溴化乙錠、100 μg/mL RNase A)，4 ℃避光孵育20 min，上機檢測細胞周期，根據公式計算細胞增殖指數：增殖指數(proliferous index，PI)=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%。
1.3.4 酶標儀法檢測細胞增殖活力
選取P1、P2、P3、P4細胞接種于96孔培養板實驗孔中，每孔加入DMEM全培養液，對照孔中只加入DMEM培養液，37 ℃、5% CO2靜置培養，每3天換液1次。按照CCK-8檢測試劑盒說明書，連續8天測定450 nm處各孔光吸收值(OD)，比較各代細胞增殖活力。
1.3.5 誘導分化
選擇P1、P2、P3、P4細胞，接種于3.5 cm培養皿，待細胞匯合率達80%時，進行下列實驗：①成骨誘導液(1×10-7 mol/L地塞米松、1×10-2 mol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C)誘導培養細胞至第9天，行ALP化學染色，第21天行茜素紅染色；②成脂誘導液(1×10-6 mol/L維生素C、5 mg/L胰島素、1×10-4 mol/L IBMX、6×10-7 mol/L吲哚美辛)誘導培養細胞至第7天，行油紅O染色；③成軟骨誘導液(10 ng/ mL TGF-β1、1×10-7 mol/L地塞米松、50 mg/L維生素C、1% ITS-A)誘導培養細胞至第10天，行Ⅱ型膠原免疫組化染色；④成神經誘導液(100 mg/L BHA、10 ng/mL bFGF、2% DMSO)作用細胞7 d后，行NSE免疫組化染色；⑤成內皮誘導液(10 ng/mL VEGF、2 ng/mL bFGF)作用細胞14 d后，行vWF免疫組化。應用圖像分析軟件(Image Pro Plus 5.0美國；IOD分析法)對上述各組陽性圖像結果進行定性、定量統計分析。
1.4 統計方法
實驗數據以均數±標準差(x±s)表示，采用SPSS 13.0進行統計分析。組間比較采用獨立樣本t檢驗分析，組內比較采用重復測量方差分析，P < 0.05時認為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 形態學觀察
如圖 1所示，倒置相差顯微鏡下可見，OVX-rBMSCs細胞接種于培養皿時，細胞形態為類圓型。24 h后，貼壁細胞不多，為不規則圓形或多角形。48 h后已有較多細胞開始貼壁，細胞胞體逐漸拉長，變為梭形，為典型的間充質細胞形態。繼續培養3～4天后，細胞呈克隆樣生長，形成多個小細胞集落，并呈放射狀排列；細胞傳代后，生長迅速，培養24 h細胞即可貼壁伸展，立體感明顯，細胞胞體狹長，胞質較少，胞核圓形或橢圓形。3天后，散在的細胞克隆集落匯合，呈放射狀、螺旋狀或者是魚群狀排列，逐漸融合成片，鋪滿皿底。以上特點P4細胞尤其突出。掃描電鏡下觀察，P3、P4代OVX-rBMSCs細胞偽足樣突起明顯，胞體表面有多個細胞囊泡樣結構。透射電鏡下觀察，各代細胞表面皆有長而粗的纖毛狀突起，數量較多，細胞間連接緊密，細胞胞質內線粒體、粗面內質網、初級溶酶體、次級溶酶體等細胞器豐富，核仁亦清晰，呈“核大漿少”的典型干細胞形態。P4代OVX-rBMSCs細胞中間充質樣細胞所占比例明顯較P1、P2、P3代細胞高，可見分裂相細胞，表明P4細胞純度較其他各代高，且增殖能力旺盛。
圖1
去卵巢骨質疏松模型rBMSCs形態學觀察
Figure1.
Morphological observation of OVX-rBMSCs
2.2 流式細胞儀檢測細胞表面標記物和細胞周期
表面標記物結果顯示：隨著細胞傳代次數增加，間充質干細胞表型CD29、CD90表達的陽性率明顯升高，而造血干細胞表型CD45表達逐漸轉為陰性。統計分析結果顯示：P4與P1、P2(CD29、CD45、CD90)組間比較，差異有統計學意義(P < 0.05)。由此說明P4代OVX-rBMSCs細胞中間充質干細胞純度最高(如圖 2和表 1所示)。細胞周期分布及細胞增殖指數計算結果顯示：P4與P1、P2組間比較差異有統計學意義(P < 0.01)，說明P4代OVX-rBMSCs細胞中增殖細胞所占百分比最大，生長活性最強(如表 2所示)。
圖2
流式細胞術檢測P4代OVX-rBMSCs細胞表面分子標記物表達
Figure2.
Surface marker expression of P4 OVX-rBMSCs cells by flow cytometry
表1
流式細胞術檢測OVX-rBMSCs細胞表面分子標記物表達值(x±s, n=4)
Table1.
Surface marker expression values of OVX-rBMSCs cells by flow cytometry (x±s, n=4)
表2
OVX-rBMSCs細胞周期分布和增殖指數(x±s, n=4)
Table2.
Cell cycle distribution and proliferation index of OVX-rBMSCs (x±s, n=4)
2.3 細胞增殖活力
細胞增殖活力檢測結果顯示：在細胞接種后1～2天，細胞OD值基本上沒有上升，為潛伏適應期；第3～6天細胞OD值呈倍數增長，表明細胞進入對數生長期；第7天后細胞OD值逐漸平穩，至第8天細胞增殖進入平臺期。細胞增殖OD值統計學分析顯示：P4與P1、P4與P2組間比較，差異有統計學意義(P < 0.05)，結合流式細胞檢測增殖指數結果，說明P4代OVX-rBMSCs細胞增殖能力最強(如表 3所示)。
表3
OVX-rBMSCs細胞增殖OD值(x±s, CCK-8 KIT，n=3)
Table3.
The OD value of OVX-rBMSCs (x±s, CCK-8 KIT, n=3)
2.4 OVX-rBMSCs細胞多向誘導分化潛能
OVX-rBMSCs細胞多向誘導分化實驗結果如圖 3和表 4所示。成骨誘導分化后，OVX-rBMSCs細胞形態由原來細長的梭形細胞變為扁平的多角形，胞漿及部分胞體邊緣出現棕黃色深染顆粒；檢測成骨標志物ALP結果顯示：P4與P1組間比較差異有統計學意義(P < 0.01)；P4與P2組間比較，差異也有統計學意義(P < 0.05)。茜素紅染色結果顯示：各組細胞呈漩渦狀密集生長，團簇細胞處經茜素紅染色后，細胞分泌形成的礦化結節呈橘紅色。IOD分析結果發現，P4與P1組間比較差異有統計學意義(P < 0.01)；P4與P2組間比較，差異也有統計學意義(P < 0.05)。成脂誘導分化后，細胞由原來的長梭形逐漸變為卵圓形，胞漿豐富，胞核被擠至細胞胞漿邊緣，行油紅O染色，胞漿內脂滴被染成深紅色。IOD分析法對實驗結果進行定量分析顯示，P4與P1組間比較差異有統計學意義(P < 0.01)；P4與P2組間比較，差異也有統計學意義(P < 0.05)。成軟骨誘導分化后，細胞形態逐漸變為橢圓形樣的上皮細胞形態，隨著培養天數的增加，細胞間基質呈片層狀，對各代細胞分泌軟骨外基質行Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示，細胞胞質及胞外均被染成棕色或棕褐色，細胞聚集部位陽性顏色較深；IOD分析法結果發現，P4與P1、P4與P2組間比較，差異均有統計學意義(P < 0.05)。成神經誘導分化后，細胞數量逐漸變少，形態也逐漸變得更加狹長，細胞突觸樣結構明顯；行NSE免疫組織化學染色顯示：細胞漿及胞膜處被染成棕黃色，P4與P1、P4與P2組間IOD值比較，差異均有統計學意義(P < 0.05)。成內皮誘導分化后，細胞變為鋪路石樣外觀，細胞間連接緊密，行vWF免疫組織化學染色顯示，細胞胞漿及胞膜處出現大量棕黃色深染顆粒；P4與P1、P4與P2組間IOD值比較，差異均有統計學意義(P < 0.05)。
圖3
OVX-rBMSCs成骨、成脂、成軟骨、成神經和成內皮誘導分化結果
Figure3.
Osteogenic, adipogenic, chondrogenic, neural and endothelial induced differentiation of OVX-rBMSCs
表4
OVX-rBMSCs誘導分化各指標IOD法圖像分析結果(x±s, n=6)
Table4.
IOD values of induced differentiation items of OVX-rBMSCs (x±s, n=6)
3 討論
研究表明，動物模型在藥物篩選中的缺點越來越凸顯，往往因為藥物代謝的種屬差異以及藥物本身的化學性質、給藥途徑等不同，導致實驗結果不理想，也令骨質疏松藥物的研發周期和費用亦急劇增加[8]。近年來新型多肽及小分子靶向類藥物(如氯化鋰、src酪氨酸激酶抑制劑、Cbfα1調控劑等)越來越受到骨質疏松藥物研究者的青睞，然而，動物實驗和臨床前期藥效評價過程中總會得出陰性或相反的結論[9]。究其原因，除了骨質疏松發生機制本身非常復雜外，主要還是由于在藥物研制過程中，使用動物模型的差異性結果干擾了后期的臨床藥效學評價，因此，還需要進一步深入研究骨質疏松發生機制，嚴格遵循隨機雙盲研究，篩選給藥途徑，選擇最佳劑量，尤其應使用最佳的細胞學模型進行前期藥物的特異性量效關系研究[10]。這不僅為深入認識骨質疏松的發病機制提供實驗依據，更為發現新的骨質疏松藥物治療途徑、尋找新的靶向性多肽及小分子藥物提供理論參考。
BMSCs來源于中胚層，能夠在誘導因素下向多胚層細胞發生分化，在組織修復和退行性疾病中發揮著重要的作用[11]。特別是，BMSCs是成骨細胞的前體細胞，可從更上游的干細胞分化活性來客觀評價藥物的敏感性和藥效學機制。所以，BMSCs是骨質疏松藥物篩選較為理想的模型細胞[6]。體外分離純化骨質疏松相關疾病的BMSCs，研究其培養、生物學特性，對于模型干細胞的選取具有重要的現實意義。
據文獻報道，目前體外培養BMSCs的方法主要有全骨髓貼壁篩選分離法、密度梯度離心法、流式細胞儀法及免疫磁珠法等四種方法[12]。其中，全骨髓貼壁篩選分離法對實驗條件要求不高，操作方便，耗材單一，一次分離的有核細胞可達107個數量級，培養周期短，被研究者廣泛采用；密度梯度離心法操作步驟繁瑣，分離試劑要求特殊，離心剪切應力對細胞生物學活性有一定影響；流式細胞儀法及免疫磁珠法對操作平臺和操作人員的技術要求較高，且價格昂貴，一次分離所獲得的有核活性細胞較少。因此，從經濟、簡便、高效的角度考慮，本實驗采用全骨髓貼壁篩選分離法，體外分離、培養OVX-rBMSCs。對OVX-rBMSCs P1、P2、P3、P4代生物學活性進行綜合性評價，進而選擇出最佳活性狀態細胞。結果顯示：各代細胞呈典型的長梭形細胞，且胞質較豐富，胞核圓而大、核仁較清楚，其中P4細胞具備典型“核大漿少”的干細胞形態學特征，且間充質干細胞典型的CD29、CD90表面標記物表達最高。這與Zhang等[13]所研究的BMSCs生物學活性結果是一致的。進一步研究顯示，P4代細胞增殖能力較其他代數細胞強，這可能與細胞傳代有關，隨著傳代次數增加，雜細胞被逐步篩選掉，OVX-rBMSCs純度依次提高，細胞整體增殖能力進一步加強。另外，對分化誘導實驗結果進行分析，結果發現：P1、P2、P3、P4代OVX-rBMSCs均能向成骨、成脂、成軟骨、成神經和成內皮等方向發生分化，其中，P4代細胞分化能力最強。
綜上所述，本研究所采用的全骨髓貼壁培養法可以有效分離、培養OVX-rBMSCs，且隨著傳代次數增加，干細胞純度及生物學活性指標逐漸優化，其中，P4代均優于其他各代細胞，可作為后續骨質疏松藥物篩選的優選模型細胞。
