microRNA（miRNA）是一類具有調控作用的單鏈小分子RNA，與腫瘤的增殖、侵襲和轉移有很大的關系。結直腸癌作為一種常見的消化道腫瘤，與miRNA有密切的關系。本文就miRNA對結直腸癌的增殖、侵襲和轉移等相關生物學行為的影響及其在結直腸癌診斷和治療中的作用做一綜述。
引用本文： 張夢怡, 賀軍, 畢鋒, 劉明. microRNA與結直腸癌研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(3): 587-592. doi: 10.7507/1001-5515.20160098 復制
引言
微小RNA(microRNA或miRNA)是一種含有21~23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發夾結構的70~90個堿基大小的單鏈RNA前體經過核酸酶Dicer加工后生成，最終成為在3＇端有兩個堿基突出的20 nt左右的雙鏈RNA。上述雙鏈RNA中的一條單鏈會與RNA誘導的沉默復合體結合。一旦成熟miRNA被裝載進入RNA誘導的沉默復合體，它將會與其靶mRNA的3＇非翻譯區結合，導致靶mRNA的降解，抑制其翻譯、脫甲基化帽子或脫腺苷化，進而抑制其靶mRNA的表達。據推測，約1%的人類已知基因可能編碼了miRNA，每個miRNA可以調控約100個靶基因，可能對相關生命過程產生潛在的影響。目前在人類基因組已有超過2 500條miRNA被發現，這些非編碼小分子RNA參與調控了大約人類基因組中30%的基因表達，可影響細胞增殖、分化、凋亡、胰島素分泌以及心臟、大腦和骨骼肌的發育等過程[1-3]。
隨著對miRNA研究的不斷增加，科學家開始認識到這些普遍存在的小分子在真核基因表達調控中有著廣泛的作用。多項研究顯示miRNA突變或者異位表達與結直腸癌相關，miRNA可以起到抑癌基因或者癌基因的功能。在結直腸癌的腫瘤生成過程中，研究發現多種miRNA的過度表達和沉默，編碼miRNA的基因轉錄激活和擴增可導致某些miRNA的表達上調，而由于染色體的缺失和生成過程中的缺陷可以導致某些miRNA的表達下調和沉默[4]。miRNA可以通過調控影響結直腸癌腫瘤生成通路的相關蛋白進而影響結直腸癌的增殖，這些蛋白包括Wnt/β-catenin、PI3K-AKT-mTOR通路的相關蛋白，以及K-RAS等。miRNA還可以通過影響細胞外基質降解和上皮間質轉化以及PI3K-AKT-mTOR和TGF-β信號通路進而影響腫瘤的侵襲和轉移。通過對這些miRNA的研究，我們可以對結直腸癌的腫瘤生成過程有更好的理解，并且可以研制靶向這些miRNA的藥物來治療結直腸癌。
1 miRNA對結直腸癌增殖的影響
1.1 miRNA通過對Wnt/β-catenin通路的調控影響結直腸癌的增殖
Wnt/β-catenin通路在結直腸癌組織、細胞增殖中起著很重要的作用。當Wnt通路激活時，細胞膜外的Wnt家族分泌性相關蛋白(Wnt)與跨膜受體卷曲蛋白(Frizzled,Frz)和輔助性受體低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor related protein 5/6,LRP5/6 )組成的受體復合物結合，從而使松散蛋白(Dishevelled,Dsh,Dvl)磷酸化，進而與軸蛋白(Axin)結合，引發β-連環蛋白(β-catenin)降解復合物[主要由糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase，GSK-3β)、Axin、結腸腺瘤性息肉蛋白(adenomatous polyposis coli,APC)組成]解體、抑制細胞質中β-catenin磷酸化降解過程。未磷酸化的β-catenin不斷積累于細胞質，然后轉位進入細胞核，與核內轉錄因子T細胞因子(T cell factor,TCF)/淋巴樣增強因子(lymphoid enhancing factor,LEF)結合，啟動下游基因轉錄。沒有Wnt信號分子存在的時候，蛋白酶體需要對被泛素連接酶復合體E3的亞單位β-Trep識別泛素化后的β-catenin反復崩解,從而降解細胞質中的β-catenin[5-6]。大量證據表明Wnt/β-catenin通路的異常激活可導致結直腸癌的發生。85%遺傳性和散發性的結直腸癌都是基于APC基因和β-catenin基因突變引起Wnt經典信號通路的激活[7]。miR-320a和miR-145的異常表達可阻斷β-catenin進入到細胞核中，下調轉錄因子C-MYC和細胞周期蛋白CYCLIND1進而抑制DLD-1細胞系的生長[8-9]。與此類似，miR-101表達下調可以促進Wnt/β-catenin通路的激活進而促進結腸癌細胞的增殖[10]。miR26b則通過抑制Wnt/β-catenin通路上LEF1的激活進而抑制結腸癌的增殖[11]。由此可見，多個miRNA涉及到Wnt/β-catenin信號通路的調控，進而抑制或增加結直腸癌組織細胞的增殖。
1.2 miRNA通過對EGFR通路的調控影響結直腸癌的增殖
表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是ErbB酪氨酸激酶受體家族的一個成員，由具有酪氨酸激酶活性的胞內段和胞外段組成。這種跨膜糖蛋白家族可以通過和相關配體如表皮生長因子、轉移生長因子-α、兩性調節蛋白、肝素結合性表皮生長因子樣生長因子、β-細胞調節素、表皮調節素等結合，使EGFR和2型人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor type 2,HER2) 、3型人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor type 3,ErbB3/HER3) 和4型人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor type 4,ErbB4/HER4) 形成同源二聚體或異源二聚體，進而通過連續性激活兩大下游信號KRAS/RAF/ERK和PI3K/AKT促進胞內區域的自身磷酸化。這個信號通路與腫瘤細胞的增殖、生存、侵襲和轉移、神經血管生成有關，EGFR通路的失調促進了大量實體瘤的形成，其中包括結腸癌[12]。近期研究表明，KRAS是miR-30b的靶基因之一，miR-30b直接作用于KRAS mRNA的3＇端非翻譯區，抑制KRAS的表達，進而抑制結腸癌細胞的增殖[13]。miR-223則通過作用于RAS p21 GTP酶激活蛋白而促進結腸癌的增殖[14]。ADP核糖基化因子樣5A屬于ADP核糖基化因子家族，ADP核糖基化因子家族是Ras超家族的一個成員，研究表明miR-202-3p正是通過作用于ADP核糖基化因子樣5A而抑制結腸癌細胞的增殖[15]。BRAF是miR-378-5p的一個新的功能性靶點，miR-378-5p可通過調節RAS/RAF/MEK/ERK通路而抑制結腸癌細胞的增殖[16]。在對動物模型及結腸癌患者病例進行研究時，發現PTEN/PI3K失調能夠誘導miR-135b的表達，促進腫瘤的進展，而且miR-135b的上調與腫瘤分期和較差的臨床預后有關，在結腸癌腫瘤模型中抑制miR-135b可以通過抑制與增殖有關的通路抑制腫瘤的增長，因此研究者認為miR-135b是多種致癌信號通路的下游信號，也是結腸癌治療中的一個有潛力的靶點[17]。此外，miR-224可以激活PI3K/AKT信號通路，通過調節FOXO3a、p21Cip1、p27Kip1和cyclin D1的表達水平促進結腸癌的增殖[18]。
此外，在結直腸癌中，miRNA也涉及到參與調控其它的多個信號通路，如NOTCH、PI3K/AKT/mTOR、MAPK信號通路等，進而參與到調控結直腸癌細胞或組織的增殖。
2 miRNA對結直腸癌侵襲和轉移的影響
2.1 miRNA通過對基質金屬蛋白酶的調控影響結腸癌的侵襲和轉移
細胞外基質重構是腫瘤生長、存活、侵襲和轉移的重要條件。細胞外基質重構需要相應的蛋白酶參與。而這些蛋白酶中最重要的是尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑和基質金屬蛋白酶[19]。有研究表明miR-29a可以促進結直腸癌細胞的侵襲和轉移，主要作用機制是其能夠直接抑制Krüppel樣因子4，繼而促進基質金屬蛋白酶2的表達并且抑制上皮細胞鈣粘蛋白的表達，最終促進結直腸癌細胞的侵襲和轉移[20]。去整合素金屬蛋白酶屬于基質金屬蛋白酶相關家族，去整合素金屬蛋白酶和整合素受體結合發揮蛋白酶的作用，通過降解細胞外基質分子進而促進腫瘤侵襲和轉移，這種作用類似于基質金屬蛋白酶。去整合素金屬蛋白酶19是去整合素金屬蛋白酶家族的重要一員，多種研究表明去整合素金屬蛋白酶19能促進腫瘤的侵襲和轉移，miR-30c正是通過作用于去整合素金屬蛋白酶19來促進結腸癌的侵襲和轉移[21]。RECK基因是最近發現的基質金屬蛋白酶抑制基因，在腫瘤組織中低表達。RECK基因編碼一個膜糖蛋白，能夠負性調節基質金屬蛋白酶2、基質金屬蛋白酶9的活性，抑制腫瘤血管的生成和轉移。有研究表明miR-221在轉移性結腸癌細胞系和組織中是顯著上調的，miR-221的過度表達在體內和體外均增強結腸癌細胞系的遷移和侵襲能力，miR-221的缺失則導致相反的結果。在實驗中發現miR-221的表達水平與RECK呈負相關，重新引入miR-221可以逆轉miR-221所誘發的結腸癌細胞侵襲，因此推測miR-221直接作用于RECK，通過這種機制增強結腸癌細胞的侵襲和轉移能力[22]。
2.2 miRNA通過調控PI3K/AKT通路影響結腸癌的侵襲和轉移
PI3K/AKT通路也與結腸癌的侵襲和轉移有關。新近研究表明結腸癌患者腫瘤組織中的miR-92a的表達水平與其淋巴結轉移率呈正相關，miR-92a通過抑制PTEN激活PI3K/AKT而促進結腸癌的轉移，而且，miR-92a和PTEN表達水平可以預測結腸癌的臨床預后和腫瘤復發[23]。miR-17-92基因簇、miR-32也是通過抑制PTEN激活PI3K/AKT而促進結腸癌的轉移[24-25]。此外，miR-126能夠與PI3Kβ的3＇端非翻譯區結合，抑制PI3K/AKT通路的激活進而抑制結腸癌的侵襲和轉移[26]。miR-29b也能促進結腸癌的侵襲和轉移，它的靶點是胰島素樣生長因子,而胰島素樣生長因子1是PI3K/AKT信號通路的激活劑,也就是說miR-29b間接通過激活PI3K/AKT促進結腸癌的侵襲和轉移[27]。
2.3 miRNA通過調控TGF-β信號通路影響結腸癌的侵襲和轉移
轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號通路也與結直腸癌的侵襲和轉移有關。轉化生長因子β受體2是TGF-β主要的跨膜受體之一，通過與配體TGF-β結合,轉化生長因子β受體2的GS盒子的絲氨酸和蘇氨酸的殘基發生磷酸化，激活TGF-β信號通路，進而促進腫瘤的發生和進展。miR-301a正是通過下游的轉化生長因子β受體2促進腫瘤的遷移和侵襲，臨床標本研究表明miR-301a的表達水平在淋巴結陽性轉移的結腸癌患者中比在淋巴結陰性轉移的結腸癌患者中高出很多，體內和體外的研究也證實了miR-301a對結腸癌侵襲和轉移的作用[28]。SMAD4蛋白是一種轉錄因子，參與TGF-β信號通路下游的協同轉錄作用，SMAD4的缺失促進結腸癌的侵襲和轉移，miR-224正是通過作用于SMAD4而促進結腸癌的轉移[29]。另有新近研究表明TGF-β通過Sox4激活miR-1269a,miR-1269a通過靶向Smad7和HOXD10加強TGF-β信號的作用，兩者形成了正反饋環，通過此反饋環miR-1269a可以顯著增強結腸癌細胞的侵襲能力以及體內轉移的能力[30]。Smad7可以被TGF-β和骨形態發生蛋白激活，也可以被其他激活劑如上皮生長因子、干擾素、腫瘤壞死因子所激活，它的抗腫瘤作用可能與細胞周期調節因子如CyclinD、p21、p27、cdk2/4和細胞連接相關蛋白如N-cadherin、ZO-1、claudin-1/4/7、nm23有關，miR-25正是通過作用于Smad7抑制結腸癌細胞的轉移[31]。
此外，Rho GTPases信號通路也參與了結直腸癌的侵襲及轉移。我們的前期研究顯示，多個miRNA能靶向調控Rho GTPases進而影響結直腸癌細胞的侵襲及轉移，例如,miR-21靶向調控RhoB[32]，miR-137靶向調控Cdc42[33]，miR-185靶向調控Cdc42及RhoA[34]等，進而調控結直腸癌細胞的侵襲及轉移。
3 miRNA在結直腸癌診斷中的作用
由于在結直腸癌早期診斷中缺乏簡單、非侵入性的檢測工具，結直腸癌的早期診斷相對困難，而miRNA的發現以及它們在不同疾病之間表達譜的不同為結腸癌診斷提供了新的思路。有研究對正常結腸組織、結腸癌、結腸腺瘤性息肉、炎癥性腸病的標本進行比較，正常組織中的miR-145與非正常組織中miR-145的表達量有顯著差別，癌變組織與非癌變組織miR-145的表達量也有顯著差別，miR-145在結腸癌標本中是顯著下調的，因此miR-145可以作為一個很有發展前景的非侵入性腫瘤標記物[35]。miR-193a-3p、miR-23a和miR-338-5p也被證明可以作為結腸癌早期檢測的非侵入性腫瘤標記物，其受試者工作特征曲線面積為0.887(敏感性為80.0%,特異性為84.4%，準確性為83.3%)[36]。最近一個臨床研究顯示6種血漿miRNA(miR-21、let-7a、miR-31、miR-92a、miR-181b、miR-203) 在結腸癌病例組和對照組表達量有顯著差別，危險系數分析顯示這6種miRNA為基礎的生物標志物對于鑒別結腸癌患者和無癌者有很高的敏感性和特異性，然而同樣的血漿樣品，腫瘤標志物癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)和碳水化合物抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9,CA19-9) 的特異性及敏感性卻不及這6種miRNA。此外，這6種血漿miRNA的表達水平也和結腸癌的進展相關。因此，這6種miRNA可以作為結腸癌診斷的非侵入性生物標記物，且具有很高的敏感性和特異性[37]。另外一項相關研究發現原發性結腸癌患者，甚至是早期的原發性結腸癌患者7種miRNA(let-7a、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223、miR-23a)的血漿水平跟健康組相比顯著升高，腫瘤病灶切除后，這些miRNA的水平又顯著下降，對細胞系的研究也發現結腸癌細胞與正常結腸細胞相比產生更多的此類miRNA，并且受試者工作特征曲線也驗證了這些miRNA的高敏感性[38]。在新確診的結腸癌中，同期肝轉移約占15%，這部分患者往往對傳統治療不敏感，因此預后很差，超過50%的結腸癌患者會在不同時期發生肝轉移，跟原位結腸癌患者相比，miR-141和miR-21在同期肝轉移和其他器官轉移的結腸癌病例中顯著上調，而miR-126的水平則下調，miR-126的敏感性為77.78%，特異性為68.97%，miR-141的敏感性為86.11%，特異性為76.11%，miR-21的敏感性為73.61%，特異性為66.38%[39]。因此，miRNA的出現為結直腸的早期篩查提供了新的思路，特別是血漿miRNA水平，但是其特異性值得深入研究。
4 miRNA在結直腸癌治療中的作用
除了手術治療外，化療是結直腸癌一個常用治療手段之一，特別是在疾病的晚期。5-氟尿嘧啶是結腸癌化療方案中最常見的化療藥物，但事實上，少于25%的晚期結腸癌患者對5-氟尿嘧啶為基礎的化療方案有較強敏感性。在許多情況下，最初對5-氟尿嘧啶有反應的患者到后期對其產生耐藥。因此，化療藥物的耐藥是結腸癌化療的主要障礙。對HT-29結腸癌細胞系的研究表明，miR-21的過度表達顯著地抑制凋亡，增強細胞增殖、侵襲和克隆形成能力，促進G1/S細胞周期轉換，增強腫瘤細胞對5-氟尿嘧啶和X射線的耐受性，敲除miR-21可以逆轉這些效應并且增強HT-29細胞對5-氟尿嘧啶化療方案的敏感性。此外，有研究表明，miR-21以Hmsh2為靶點，間接調節胸苷磷酸化酶和二氫嘧啶脫氫酶的表達，這些結果證明了miR-21在結直腸癌對5-氟尿嘧啶的耐藥性有重要的作用。因此miR-21可以作為臨床藥物治療的靶點[40]。此外，有研究表明miR-320的異常表達可以抑制HCT-116細胞系的增殖、侵襲，增強細胞系對5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑的敏感性，其中FOXM1是miR-320的靶點[41]。一項關于研究結腸癌的隊列研究表明有8種miRNA(let-7g、miR-107、miR-299-5p、miR-337-5p、miR-370、miR-505、miR-889和miR-99a-3p)在治療組中能夠顯著預測患者對化療的敏感性，另外，miR-107、miR-337-5p和miR-99a-3p的過度表達與較高的無進展生存期以及總生存期有關。在另一項結腸癌的隊列研究中miRNA-107和miR-99a-3p作為對化療反應敏感性的預測標記物進一步得到驗證[42]。由此可見，miRNA在結直腸癌的化療耐藥中也有一定的作用，并有可能嘗試通過miRNA來逆轉化療耐藥。
綜上所述，目前人們對miRNA的基本特征、生物學功能等有了初步了解，我們已經可以系統地鑒定miRNA及其靶基因,并通過過量表達和沉默技術來研究特定miRNA的功能。miRNA通過發揮基因調控作用而促進結腸癌腫瘤細胞的惡性轉變，有望成為新的腫瘤標記物用于對結腸癌的診斷及預后評價，而且利用各種途徑抑制或促進miRNA的表達對結腸癌的治療也有很大幫助。可以相信,隨著研究的深入,miRNA必將在生命起源和物種進化、基因表達調控的復雜性、疾病發生和發展的機制等方面的研究起到更為重要的作用。
引言
微小RNA(microRNA或miRNA)是一種含有21~23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發夾結構的70~90個堿基大小的單鏈RNA前體經過核酸酶Dicer加工后生成，最終成為在3＇端有兩個堿基突出的20 nt左右的雙鏈RNA。上述雙鏈RNA中的一條單鏈會與RNA誘導的沉默復合體結合。一旦成熟miRNA被裝載進入RNA誘導的沉默復合體，它將會與其靶mRNA的3＇非翻譯區結合，導致靶mRNA的降解，抑制其翻譯、脫甲基化帽子或脫腺苷化，進而抑制其靶mRNA的表達。據推測，約1%的人類已知基因可能編碼了miRNA，每個miRNA可以調控約100個靶基因，可能對相關生命過程產生潛在的影響。目前在人類基因組已有超過2 500條miRNA被發現，這些非編碼小分子RNA參與調控了大約人類基因組中30%的基因表達，可影響細胞增殖、分化、凋亡、胰島素分泌以及心臟、大腦和骨骼肌的發育等過程[1-3]。
隨著對miRNA研究的不斷增加，科學家開始認識到這些普遍存在的小分子在真核基因表達調控中有著廣泛的作用。多項研究顯示miRNA突變或者異位表達與結直腸癌相關，miRNA可以起到抑癌基因或者癌基因的功能。在結直腸癌的腫瘤生成過程中，研究發現多種miRNA的過度表達和沉默，編碼miRNA的基因轉錄激活和擴增可導致某些miRNA的表達上調，而由于染色體的缺失和生成過程中的缺陷可以導致某些miRNA的表達下調和沉默[4]。miRNA可以通過調控影響結直腸癌腫瘤生成通路的相關蛋白進而影響結直腸癌的增殖，這些蛋白包括Wnt/β-catenin、PI3K-AKT-mTOR通路的相關蛋白，以及K-RAS等。miRNA還可以通過影響細胞外基質降解和上皮間質轉化以及PI3K-AKT-mTOR和TGF-β信號通路進而影響腫瘤的侵襲和轉移。通過對這些miRNA的研究，我們可以對結直腸癌的腫瘤生成過程有更好的理解，并且可以研制靶向這些miRNA的藥物來治療結直腸癌。
1 miRNA對結直腸癌增殖的影響
1.1 miRNA通過對Wnt/β-catenin通路的調控影響結直腸癌的增殖
Wnt/β-catenin通路在結直腸癌組織、細胞增殖中起著很重要的作用。當Wnt通路激活時，細胞膜外的Wnt家族分泌性相關蛋白(Wnt)與跨膜受體卷曲蛋白(Frizzled,Frz)和輔助性受體低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor related protein 5/6,LRP5/6 )組成的受體復合物結合，從而使松散蛋白(Dishevelled,Dsh,Dvl)磷酸化，進而與軸蛋白(Axin)結合，引發β-連環蛋白(β-catenin)降解復合物[主要由糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase，GSK-3β)、Axin、結腸腺瘤性息肉蛋白(adenomatous polyposis coli,APC)組成]解體、抑制細胞質中β-catenin磷酸化降解過程。未磷酸化的β-catenin不斷積累于細胞質，然后轉位進入細胞核，與核內轉錄因子T細胞因子(T cell factor,TCF)/淋巴樣增強因子(lymphoid enhancing factor,LEF)結合，啟動下游基因轉錄。沒有Wnt信號分子存在的時候，蛋白酶體需要對被泛素連接酶復合體E3的亞單位β-Trep識別泛素化后的β-catenin反復崩解,從而降解細胞質中的β-catenin[5-6]。大量證據表明Wnt/β-catenin通路的異常激活可導致結直腸癌的發生。85%遺傳性和散發性的結直腸癌都是基于APC基因和β-catenin基因突變引起Wnt經典信號通路的激活[7]。miR-320a和miR-145的異常表達可阻斷β-catenin進入到細胞核中，下調轉錄因子C-MYC和細胞周期蛋白CYCLIND1進而抑制DLD-1細胞系的生長[8-9]。與此類似，miR-101表達下調可以促進Wnt/β-catenin通路的激活進而促進結腸癌細胞的增殖[10]。miR26b則通過抑制Wnt/β-catenin通路上LEF1的激活進而抑制結腸癌的增殖[11]。由此可見，多個miRNA涉及到Wnt/β-catenin信號通路的調控，進而抑制或增加結直腸癌組織細胞的增殖。
1.2 miRNA通過對EGFR通路的調控影響結直腸癌的增殖
表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是ErbB酪氨酸激酶受體家族的一個成員，由具有酪氨酸激酶活性的胞內段和胞外段組成。這種跨膜糖蛋白家族可以通過和相關配體如表皮生長因子、轉移生長因子-α、兩性調節蛋白、肝素結合性表皮生長因子樣生長因子、β-細胞調節素、表皮調節素等結合，使EGFR和2型人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor type 2,HER2) 、3型人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor type 3,ErbB3/HER3) 和4型人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor type 4,ErbB4/HER4) 形成同源二聚體或異源二聚體，進而通過連續性激活兩大下游信號KRAS/RAF/ERK和PI3K/AKT促進胞內區域的自身磷酸化。這個信號通路與腫瘤細胞的增殖、生存、侵襲和轉移、神經血管生成有關，EGFR通路的失調促進了大量實體瘤的形成，其中包括結腸癌[12]。近期研究表明，KRAS是miR-30b的靶基因之一，miR-30b直接作用于KRAS mRNA的3＇端非翻譯區，抑制KRAS的表達，進而抑制結腸癌細胞的增殖[13]。miR-223則通過作用于RAS p21 GTP酶激活蛋白而促進結腸癌的增殖[14]。ADP核糖基化因子樣5A屬于ADP核糖基化因子家族，ADP核糖基化因子家族是Ras超家族的一個成員，研究表明miR-202-3p正是通過作用于ADP核糖基化因子樣5A而抑制結腸癌細胞的增殖[15]。BRAF是miR-378-5p的一個新的功能性靶點，miR-378-5p可通過調節RAS/RAF/MEK/ERK通路而抑制結腸癌細胞的增殖[16]。在對動物模型及結腸癌患者病例進行研究時，發現PTEN/PI3K失調能夠誘導miR-135b的表達，促進腫瘤的進展，而且miR-135b的上調與腫瘤分期和較差的臨床預后有關，在結腸癌腫瘤模型中抑制miR-135b可以通過抑制與增殖有關的通路抑制腫瘤的增長，因此研究者認為miR-135b是多種致癌信號通路的下游信號，也是結腸癌治療中的一個有潛力的靶點[17]。此外，miR-224可以激活PI3K/AKT信號通路，通過調節FOXO3a、p21Cip1、p27Kip1和cyclin D1的表達水平促進結腸癌的增殖[18]。
此外，在結直腸癌中，miRNA也涉及到參與調控其它的多個信號通路，如NOTCH、PI3K/AKT/mTOR、MAPK信號通路等，進而參與到調控結直腸癌細胞或組織的增殖。
2 miRNA對結直腸癌侵襲和轉移的影響
2.1 miRNA通過對基質金屬蛋白酶的調控影響結腸癌的侵襲和轉移
細胞外基質重構是腫瘤生長、存活、侵襲和轉移的重要條件。細胞外基質重構需要相應的蛋白酶參與。而這些蛋白酶中最重要的是尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑和基質金屬蛋白酶[19]。有研究表明miR-29a可以促進結直腸癌細胞的侵襲和轉移，主要作用機制是其能夠直接抑制Krüppel樣因子4，繼而促進基質金屬蛋白酶2的表達并且抑制上皮細胞鈣粘蛋白的表達，最終促進結直腸癌細胞的侵襲和轉移[20]。去整合素金屬蛋白酶屬于基質金屬蛋白酶相關家族，去整合素金屬蛋白酶和整合素受體結合發揮蛋白酶的作用，通過降解細胞外基質分子進而促進腫瘤侵襲和轉移，這種作用類似于基質金屬蛋白酶。去整合素金屬蛋白酶19是去整合素金屬蛋白酶家族的重要一員，多種研究表明去整合素金屬蛋白酶19能促進腫瘤的侵襲和轉移，miR-30c正是通過作用于去整合素金屬蛋白酶19來促進結腸癌的侵襲和轉移[21]。RECK基因是最近發現的基質金屬蛋白酶抑制基因，在腫瘤組織中低表達。RECK基因編碼一個膜糖蛋白，能夠負性調節基質金屬蛋白酶2、基質金屬蛋白酶9的活性，抑制腫瘤血管的生成和轉移。有研究表明miR-221在轉移性結腸癌細胞系和組織中是顯著上調的，miR-221的過度表達在體內和體外均增強結腸癌細胞系的遷移和侵襲能力，miR-221的缺失則導致相反的結果。在實驗中發現miR-221的表達水平與RECK呈負相關，重新引入miR-221可以逆轉miR-221所誘發的結腸癌細胞侵襲，因此推測miR-221直接作用于RECK，通過這種機制增強結腸癌細胞的侵襲和轉移能力[22]。
2.2 miRNA通過調控PI3K/AKT通路影響結腸癌的侵襲和轉移
PI3K/AKT通路也與結腸癌的侵襲和轉移有關。新近研究表明結腸癌患者腫瘤組織中的miR-92a的表達水平與其淋巴結轉移率呈正相關，miR-92a通過抑制PTEN激活PI3K/AKT而促進結腸癌的轉移，而且，miR-92a和PTEN表達水平可以預測結腸癌的臨床預后和腫瘤復發[23]。miR-17-92基因簇、miR-32也是通過抑制PTEN激活PI3K/AKT而促進結腸癌的轉移[24-25]。此外，miR-126能夠與PI3Kβ的3＇端非翻譯區結合，抑制PI3K/AKT通路的激活進而抑制結腸癌的侵襲和轉移[26]。miR-29b也能促進結腸癌的侵襲和轉移，它的靶點是胰島素樣生長因子,而胰島素樣生長因子1是PI3K/AKT信號通路的激活劑,也就是說miR-29b間接通過激活PI3K/AKT促進結腸癌的侵襲和轉移[27]。
2.3 miRNA通過調控TGF-β信號通路影響結腸癌的侵襲和轉移
轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號通路也與結直腸癌的侵襲和轉移有關。轉化生長因子β受體2是TGF-β主要的跨膜受體之一，通過與配體TGF-β結合,轉化生長因子β受體2的GS盒子的絲氨酸和蘇氨酸的殘基發生磷酸化，激活TGF-β信號通路，進而促進腫瘤的發生和進展。miR-301a正是通過下游的轉化生長因子β受體2促進腫瘤的遷移和侵襲，臨床標本研究表明miR-301a的表達水平在淋巴結陽性轉移的結腸癌患者中比在淋巴結陰性轉移的結腸癌患者中高出很多，體內和體外的研究也證實了miR-301a對結腸癌侵襲和轉移的作用[28]。SMAD4蛋白是一種轉錄因子，參與TGF-β信號通路下游的協同轉錄作用，SMAD4的缺失促進結腸癌的侵襲和轉移，miR-224正是通過作用于SMAD4而促進結腸癌的轉移[29]。另有新近研究表明TGF-β通過Sox4激活miR-1269a,miR-1269a通過靶向Smad7和HOXD10加強TGF-β信號的作用，兩者形成了正反饋環，通過此反饋環miR-1269a可以顯著增強結腸癌細胞的侵襲能力以及體內轉移的能力[30]。Smad7可以被TGF-β和骨形態發生蛋白激活，也可以被其他激活劑如上皮生長因子、干擾素、腫瘤壞死因子所激活，它的抗腫瘤作用可能與細胞周期調節因子如CyclinD、p21、p27、cdk2/4和細胞連接相關蛋白如N-cadherin、ZO-1、claudin-1/4/7、nm23有關，miR-25正是通過作用于Smad7抑制結腸癌細胞的轉移[31]。
此外，Rho GTPases信號通路也參與了結直腸癌的侵襲及轉移。我們的前期研究顯示，多個miRNA能靶向調控Rho GTPases進而影響結直腸癌細胞的侵襲及轉移，例如,miR-21靶向調控RhoB[32]，miR-137靶向調控Cdc42[33]，miR-185靶向調控Cdc42及RhoA[34]等，進而調控結直腸癌細胞的侵襲及轉移。
3 miRNA在結直腸癌診斷中的作用
由于在結直腸癌早期診斷中缺乏簡單、非侵入性的檢測工具，結直腸癌的早期診斷相對困難，而miRNA的發現以及它們在不同疾病之間表達譜的不同為結腸癌診斷提供了新的思路。有研究對正常結腸組織、結腸癌、結腸腺瘤性息肉、炎癥性腸病的標本進行比較，正常組織中的miR-145與非正常組織中miR-145的表達量有顯著差別，癌變組織與非癌變組織miR-145的表達量也有顯著差別，miR-145在結腸癌標本中是顯著下調的，因此miR-145可以作為一個很有發展前景的非侵入性腫瘤標記物[35]。miR-193a-3p、miR-23a和miR-338-5p也被證明可以作為結腸癌早期檢測的非侵入性腫瘤標記物，其受試者工作特征曲線面積為0.887(敏感性為80.0%,特異性為84.4%，準確性為83.3%)[36]。最近一個臨床研究顯示6種血漿miRNA(miR-21、let-7a、miR-31、miR-92a、miR-181b、miR-203) 在結腸癌病例組和對照組表達量有顯著差別，危險系數分析顯示這6種miRNA為基礎的生物標志物對于鑒別結腸癌患者和無癌者有很高的敏感性和特異性，然而同樣的血漿樣品，腫瘤標志物癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)和碳水化合物抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9,CA19-9) 的特異性及敏感性卻不及這6種miRNA。此外，這6種血漿miRNA的表達水平也和結腸癌的進展相關。因此，這6種miRNA可以作為結腸癌診斷的非侵入性生物標記物，且具有很高的敏感性和特異性[37]。另外一項相關研究發現原發性結腸癌患者，甚至是早期的原發性結腸癌患者7種miRNA(let-7a、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223、miR-23a)的血漿水平跟健康組相比顯著升高，腫瘤病灶切除后，這些miRNA的水平又顯著下降，對細胞系的研究也發現結腸癌細胞與正常結腸細胞相比產生更多的此類miRNA，并且受試者工作特征曲線也驗證了這些miRNA的高敏感性[38]。在新確診的結腸癌中，同期肝轉移約占15%，這部分患者往往對傳統治療不敏感，因此預后很差，超過50%的結腸癌患者會在不同時期發生肝轉移，跟原位結腸癌患者相比，miR-141和miR-21在同期肝轉移和其他器官轉移的結腸癌病例中顯著上調，而miR-126的水平則下調，miR-126的敏感性為77.78%，特異性為68.97%，miR-141的敏感性為86.11%，特異性為76.11%，miR-21的敏感性為73.61%，特異性為66.38%[39]。因此，miRNA的出現為結直腸的早期篩查提供了新的思路，特別是血漿miRNA水平，但是其特異性值得深入研究。
4 miRNA在結直腸癌治療中的作用
除了手術治療外，化療是結直腸癌一個常用治療手段之一，特別是在疾病的晚期。5-氟尿嘧啶是結腸癌化療方案中最常見的化療藥物，但事實上，少于25%的晚期結腸癌患者對5-氟尿嘧啶為基礎的化療方案有較強敏感性。在許多情況下，最初對5-氟尿嘧啶有反應的患者到后期對其產生耐藥。因此，化療藥物的耐藥是結腸癌化療的主要障礙。對HT-29結腸癌細胞系的研究表明，miR-21的過度表達顯著地抑制凋亡，增強細胞增殖、侵襲和克隆形成能力，促進G1/S細胞周期轉換，增強腫瘤細胞對5-氟尿嘧啶和X射線的耐受性，敲除miR-21可以逆轉這些效應并且增強HT-29細胞對5-氟尿嘧啶化療方案的敏感性。此外，有研究表明，miR-21以Hmsh2為靶點，間接調節胸苷磷酸化酶和二氫嘧啶脫氫酶的表達，這些結果證明了miR-21在結直腸癌對5-氟尿嘧啶的耐藥性有重要的作用。因此miR-21可以作為臨床藥物治療的靶點[40]。此外，有研究表明miR-320的異常表達可以抑制HCT-116細胞系的增殖、侵襲，增強細胞系對5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑的敏感性，其中FOXM1是miR-320的靶點[41]。一項關于研究結腸癌的隊列研究表明有8種miRNA(let-7g、miR-107、miR-299-5p、miR-337-5p、miR-370、miR-505、miR-889和miR-99a-3p)在治療組中能夠顯著預測患者對化療的敏感性，另外，miR-107、miR-337-5p和miR-99a-3p的過度表達與較高的無進展生存期以及總生存期有關。在另一項結腸癌的隊列研究中miRNA-107和miR-99a-3p作為對化療反應敏感性的預測標記物進一步得到驗證[42]。由此可見，miRNA在結直腸癌的化療耐藥中也有一定的作用，并有可能嘗試通過miRNA來逆轉化療耐藥。
綜上所述，目前人們對miRNA的基本特征、生物學功能等有了初步了解，我們已經可以系統地鑒定miRNA及其靶基因,并通過過量表達和沉默技術來研究特定miRNA的功能。miRNA通過發揮基因調控作用而促進結腸癌腫瘤細胞的惡性轉變，有望成為新的腫瘤標記物用于對結腸癌的診斷及預后評價，而且利用各種途徑抑制或促進miRNA的表達對結腸癌的治療也有很大幫助。可以相信,隨著研究的深入,miRNA必將在生命起源和物種進化、基因表達調控的復雜性、疾病發生和發展的機制等方面的研究起到更為重要的作用。