低氧微環境普遍存在于實體瘤中，且與實體瘤的發展和轉移緊密相關。低氧誘導因子（HIF）作為響應低氧環境的主要轉錄因子，可促進腫瘤細胞增殖、生存、血管形成和上皮間質轉化（EMT）等。EMT是上皮細胞表型向間質細胞表型轉化的生物學過程，主要與其信號通路、轉錄因子、炎癥因子及miRNAs相關，在腫瘤侵襲和轉移中起著重要作用。本文總結了低氧信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、Notch信號通路、NF-κB信號通路、Hedgehog （Hh）信號通路以及PI3K/Akt信號通路等相關信號通路對腫瘤EMT的影響。
引用本文： 陳燦, 張小梅, 楊力, 呂永鋼. 低氧介導信號通路調控腫瘤細胞上皮間質轉化的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(3): 575-582. doi: 10.7507/1001-5515.20160096 復制
引言
1955年Thomlinson等[1]首次發現人腫瘤中存在低氧，腫瘤細胞遠離血管供給會造成擴散限制性低氧(diffusion-limited hypoxia)。其他研究證實血流隨著時間動態地變化也可能引起腫瘤細胞發生短暫的嚴重低氧，即灌流限制性低氧(perfusion-limited hypoxia)，又稱為急性或波動低氧[2]。這兩種低氧在不同程度上影響了整個腫瘤的低氧水平。引起腫瘤低氧的因素主要有兩個方面：一是實體瘤生長過程中腫瘤細胞快速增殖，引起細胞對氧氣的需求超過腫瘤現有血管對氧氣的供應；二是由于腫瘤新生血管結構和功能的異常導致低氧情況的發生。雖然，腫瘤微環境可通過一系列復雜的分子事件來誘導促血管生成因子的上調以及血管生成抑制劑的下調，促進腫瘤血管新生，但腫瘤血管常常發育不成熟、扭曲并缺乏柔韌、易出現多分支、盲端和新血管旁路等。隨著低氧檢測技術的不斷完善，越來越多的證據表明人腫瘤內普遍存在低氧微環境(氧濃度pO2＜10 mm Hg)，且與許多實體瘤的發展緊密相關[3]。低氧微環境使腫瘤對放化療的敏感顯著下降，并促進腫瘤的遠端轉移[4-5]。目前研究者們廣泛認為低氧微環境與腫瘤增強的侵襲表型相關，涉及眾多機理，其中低氧誘導上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是低氧促進腫瘤遠端轉移的重要機理之一。EMT是指具有極性的上皮細胞為了獲得運動和遷移能力，失去上皮形態和功能特征，并獲得間質細胞形態和功能特征的過程，與腫瘤細胞的侵襲和轉移有著密切關系[6]。低氧環境中EMT的發生與腫瘤微環境、多種蛋白分子及miRNAs等相關，其中低氧介導的信號通路發揮了重要作用。本文重點評述低氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、Notch信號通路、NF-κB信號通路、Hedgehog (Hh)信號通路和PI3K/Akt信號通路等各自在低氧調控腫瘤EMT過程中的作用，以及諸信號通路之間的相互關系。
1 EMT與腫瘤
上皮腫瘤細胞發生轉移必須獲得脫離上皮層、降解和穿過基底膜障礙的能力。EMT理論解釋了上皮腫瘤細胞獲得這種能力的可能機制。腫瘤細胞在EMT過程中丟失了上皮樣細胞特性：包括E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和緊密連接蛋白(zonula occluden-1,ZO-1) 表達的降低，角蛋白為主的細胞骨架的丟失；獲得間充質樣細胞特性：包括N-鈣粘蛋白(N-cadherin)表達的升高，波形蛋白(vimentin)為主的細胞骨架的形成[7]。E-鈣粘蛋白是一種鈣依賴性黏附分子，廣泛分布各上皮細胞中，介導上皮細胞同型相互作用，它在胚胎發育、形態發生、信號轉導、上皮細胞極性及組織細胞完整性的維持等方面起著重要作用[8]。E-鈣粘蛋白黏附功能紊亂將導致細胞間連接松散，與腫瘤的擴散和轉移有著密切關系。在多種人上皮腫瘤的發展過程中E-鈣粘蛋白表達缺失或功能失活，與乳腺癌的不良預后相關[9]。E-鈣粘蛋白表達降低除了直接降低細胞間的黏附外，還會導致參與其介導的細胞黏附復合物β-連環蛋白的移位，并進入細胞核內與T細胞因子(T cell factor,TCF)形成轉錄起始復合物，啟動某些與存活和惡性相關的基因表達[10]。上皮腫瘤細胞EMT過程中失去上皮標志E-鈣粘蛋白的同時也會表達間質相關的標志，如N-鈣粘蛋白和波形蛋白。多種上皮腫瘤的發展過程中，發現E-鈣粘蛋白與N-鈣粘蛋白的表達相反，E-鈣粘蛋白表達的降低伴隨著N-鈣粘蛋白表達的升高[11]。上皮細胞易位表達N-鈣粘蛋白，增強其與正常表達N-鈣粘蛋白的間質細胞的相互作用，使腫瘤細胞更易于浸入基質細胞群[12]。EMT過程中值得注意的另外一個標志是，原來以角蛋白為主的細胞骨架轉變為以波形蛋白為主的細胞骨架，或者兩者共存，從而引起細胞形態的改變[13]。
除了直接影響腫瘤細胞的黏附和運動外，EMT還可以通過以下幾個方面促進腫瘤的轉移。首先，EMT可促進腫瘤細胞對胞外基質的降解和重建，促進腫瘤細胞的侵襲。其次，EMT可以促進腫瘤細胞的干性特征。研究表明誘導上皮腫瘤細胞EMT的過程伴隨著腫瘤干細胞的產生，且用標志物篩選得到的腫瘤干細胞廣泛表達EMT相關基因和蛋白[14]。再者，EMT可提高腫瘤細胞的抗失巢凋亡能力[15]。最后，EMT的腫瘤細胞更耐受放化療[16]。由此可見，EMT是腫瘤轉移過程中的關鍵過程，探索影響腫瘤細胞EMT的因素以及相關信號通路對開發靶向腫瘤轉移的治療方案具有重要意義。微環境在腫瘤發生EMT過程中起著重要作用，其中低氧微環境可以促進腫瘤EMT的發生，并伴隨著侵襲能力的增強。其發生機制與轉錄因子、炎癥因子、信號通路及miRNAs等相關，本文將重點討論低氧介導的信號通路對腫瘤發生EMT的影響。
2 低氧調控EMT的信號通路
低氧可介導腫瘤細胞EMT的發生，HIF信號通路參與維持細胞低氧反應，調節并支持EMT的發生。本文重點總結了與HIF信號通路相關聯其他分子信號通路在腫瘤侵襲中的作用，包括Wnt/β-catenin信號通路、Notch信號通路、NF-κB信號通路、Hh信號通路和PI3K/Akt信號通路等，如圖 1所示。
圖1
低氧介導調控EMT的信號通路
Figure1.
Hypoxia-mediated multiple signaling pathways to regulate the EMT
2.1 HIF與EMT
作為癌癥發展的一個重要特征，低氧通常發生在實體瘤的中心，此處血管常常異常。為了適應低氧環境，HIF被激活以介導腫瘤細胞的基因轉錄調控[17]。HIF由氧濃度依賴調控的HIF-α亞基(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)和不依賴氧且持續表達的HIF-1β亞基組成。HIF-α與HIF-1β通過螺旋環螺旋結構域共同形成一個二聚體復合物，其在基因組中能識別并結合到缺氧反應元件上[18]。HIF-1α在所有細胞中都表達，HIF-2α只在上皮細胞等特定細胞類型中表達，而HIF-3α的屬性和功能在很大程度上還是未知的[19]。HIF-1是介導腫瘤細胞和組織適應低氧微環境的關鍵轉錄因子。脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase domain proteins,PHDs)是一種2-酮戊二酸依賴性的雙加氧酶，其活性依賴氧濃度。常氧條件下，PHDs可將HIF-1α上564位和402位的脯氨酸進行羥基化修飾，腫瘤抑制蛋白(Von Hippel-Lindau tumour suppressor protein,pVHL)可識別并結合被修飾后的HIF-1α，使HIF-1α泛素化，最后降解HIF-1α。低氧條件下，PHDs活性降低，不能羥基化修飾HIF-1α，pVHL無法識別并結合HIF-1α，HIF-1α無法降解。HIF-1α大量積累，并結合HIF-1β形成二聚體進入細胞核，與低氧反應元件(hypoxia response elements,HREs)結合，激活下游靶基因的轉錄表達[20]。HIF信號通路和EMT之間的分子機制包括以下幾個方面。首先，激活HIF-1和HIF-2可以上調EMT相關轉錄因子(如Twist、Snail、Slug和SIP1/ZEB2) 的表達來誘導EMT。其次，低氧和HIF通路可激活EMT相關信號通路如Notch、NF-κB、Wnt/β-catenin和Hh信號通路。再者，低氧和HIF通路可以通過增加EMT相關炎癥因子如腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor,TNF-α)、白細胞介素6 (interleukin 6,IL-6) 和白細胞介素1β (interleukin 1β,IL-1β)的表達來誘導EMT。最后，低氧和HIF通路可以通過直接或間接調節相應蛋白或酶來誘導EMT，調節細胞-基質間相互作用和促進細胞運動能力和侵襲能力[21]。王永興等[22]研究發現，缺氧條件可誘導前列腺癌細胞PC3發生EMT，HIF-1α起關鍵調節作用，其可增強前列腺癌細胞的侵襲，缺氧條件下抑制HIF-1α的表達可抑制前列腺癌細胞發生EMT。近期研究發現，低氧可誘導乳腺癌細胞中環氧合酶2 (cyclooxygenase-2,COX-2) 的過表達，而COX-2的過表達可下調E-鈣粘蛋白的表達，并上調波形蛋白和N-鈣粘蛋白的表達，促進EMT的發生并提高乳腺癌細胞的侵襲能力[23]。HIF通過轉錄激活的下游目標，如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)，參與調節血管生成、細胞存活、增殖、凋亡、黏附和代謝[24]。由此可見，在腫瘤發生發展過程中，HIF通路尤其是HIF-1可促進腫瘤發生EMT。
2.2 Wnt/β-catenin信號通路
Wnt/β-catenin信號通路又稱經典Wnt通路。Wnt蛋白與膜受體卷曲蛋白(Frizzleds,Frz)及低密度脂蛋白受體相關蛋白(low density lipoprotein receptor related protein,LRP)結合后，Frz可作用于蓬亂蛋白(dishevelled,Dsh)，抑制β-catenin的磷酸化，β-catenin在細胞質中積累轉位進入細胞核，與淋巴樣增強子(lymphoid-enhancing factor,LEF)/TCF的轉錄因子結合形成轉錄復合物[25]，激活下游靶基因的轉錄表達，促進腫瘤EMT及腫瘤侵襲轉移等過程[26]。SOX2 (SRY-related HMG-box 2) 是多潛能干細胞標志物之一，可調控目的基因的轉錄，促進細胞增殖和腫瘤發生。SOX2是SOX基因家族的一個成員，在人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞中，其過表達會導致β-catenin的大幅增加和核積累并發生EMT，而在SOX2過表達的細胞中用小RNA干擾β-catenin之后，E-鈣粘蛋白的表達降低及細胞轉移、侵襲能力增強這些現象會減弱。上述研究均說明SOX2誘導EMT的過程依賴于β-catenin的活化[27]，Wnt/β-catenin信號通路參與了腫瘤細胞EMT的發生的過程。
在腫瘤微環境中，HIF和Wnt/β-catenin信號通路相互作用調節腫瘤EMT的發生。結腸腺瘤樣息肉蛋白(adenomatous polyposis coli protein,APC)可與Axin、糖原合成激酶3 (glycogen synthase kinase 3,GSK3) 形成復合物促進β-catenin磷酸化，使得β-catenin降解，降低TCF/LEF的轉錄，抑制下游靶基因的表達。低氧環境中，HIF-1α可結合APC啟動子HREs形成轉錄起始復合物，抑制β-catenin的磷酸化，阻止β-catenin的降解，β-catenin水平上升進入細胞核，促進下游靶基因的表達[28]。肝癌中HIF-1α與TCF4競爭結合β-catenin，低氧抑制β-catenin-TCF4復合物的形成，提高的HIF-1α活性伴隨著更顯著的EMT特征。肝癌中Wnt/β-catenin信號通路也可提高HIF-1α的活性并防止腫瘤細胞死亡，促進低氧誘導EMT的發生[29]。由此可見，HIF被低氧激活后，參與調節Wnt/β-catenin信號通路，并在腫瘤的發生發展中參與誘發EMT的過程。
2.3 Notch信號通路
Notch信號通路在調節細胞諸多基本過程中發揮著重要作用，可調節干細胞更新和多向分化、胚胎器官組織發育，控制成人組織細胞分化、增殖和凋亡[30]。Notch信號通路可被相鄰細胞的受體配位基相互作用而激活。激活后，Notch被金屬蛋白酶TNF-α轉化酶(TNF-α-converting enzyme,TACE)和γ-分泌酶裂解，釋放Notch胞外域(Notch extracellular domain,NECD)和Notch胞內域(Notch intracellular domain,NICD)。NECD參與受體配位基綁定，NICD進入細胞核激活Notch靶基因的轉錄，如Hes1、Hey1和細胞周期蛋白D1[31]。Notch信號通路在腫瘤侵襲過程中發揮著關鍵作用，調節細胞增殖、凋亡、侵襲和EMT效應。
低氧可誘導HIF-1α激活Notch信號通路，促進腫瘤細胞增殖和侵襲[32]。在黑色素瘤中，低氧環境可促進細胞侵襲，敲除HIF-1α后細胞侵襲能力降低。Notch1在低氧環境中過表達，抑制其表達可阻斷低氧引起的細胞侵襲，Notch信號通路參與了低氧刺激EMT過程，從而增強細胞運動性和侵襲性[33-34]。抑制Notch信號通路能解除低氧介導的EMT和侵襲。另一方面，活化的Notch能代替低氧誘導該過程。研究發現，在低氧條件下，乳腺癌細胞中的Notch與EMT轉錄因子Snail呈正相關[35]。Notch通過兩種作用機制來協同控制Snail-1的表達，是EMT的關鍵調節器。首先，NICD募集到Snail-1啟動子上，直接上調Snail-1的表達。其次，Notch可加強HIF-1α募集到賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)啟動子上，促進低氧誘導LOX的上調，穩定Snail-1蛋白。這些研究表明低氧在調節EMT的過程中依賴Notch蛋白的作用。雖然Notch信號通路誘導腫瘤EMT已有研究報道，但其具體分子機制尚未清楚，還有待進一步研究。
2.4 NF-κB信號通路
在許多腫瘤中，NF-κB可以調控與細胞存活、增殖、侵襲、遷移及腫瘤轉移相關的基因的表達，促進EMT的發生。正常情況下，NF-κB的抑制基因IκB結合到NF-κB上，抑制NF-κB的核轉移，NF-κB蛋白隱藏在細胞質中。細胞一旦受到刺激，IκB蛋白在IκB激酶(IκB kinase,IKK)復合物作用下磷酸化、泛素化，在蛋白酶體的作用下降解，最后導致NF-κB核內聚集并激活目標基因的轉錄。低氧可激活很多細胞(包括腫瘤細胞)中的NF-κB信號通路[36]。NF-κB主要是炎癥和抗凋亡基因表達的調節器[37]。研究者推測低氧誘導NF-κB的活化，有利于腫瘤發生和發展過程中EMT特性的維持。HIF-1α介導NF-κB的活化，HIF-1α功能的缺失會降低NF-κB活化，而提高HIF-1α的表達會激活NF-κB[38]。被HIF-1α激活的NF-κB參與癌細胞的生存、侵襲和腫瘤生長[39]。因此在腫瘤微環境中，低氧活化HIF通路在調節NF-κB通路中發揮了重要作用。
研究表明低氧可通過激活IKK信號來誘導NF-κB的活化，尤其是IKK-β[40]。低氧可通過PHD 1的表達來激活IKK，因為IKK-β含有PHD 1羥基化的序列類似圖案。抑制PHD 1信號羥基化會增加NF-κB信號。在結直腸癌中，IKK-β磷酸化需要熱休克蛋白90 (heat shock protein 90,Hsp 90) ，PHD 3可阻止IKK-β和Hsp 90相互作用，從而抑制IKK-β和NF-κB蛋白磷酸化。敲除PHD 3可增加IKK信號并抑制這些癌細胞對TNF-α的抗性，促進腫瘤發生[41]。低氧誘導IKK激酶調節IKK的活化，導致NF-κB活化，條件性缺失IKK激酶可抑制低氧誘導IKK活化[42]。這些研究表明低氧可激活IKK，尤其是IKK-β，在腫瘤低氧微環境中NF-κB通路可能發揮了關鍵作用。體外實驗顯示，HIF和NF-κB通路相互作用誘導乳腺癌EMT和遷移，促進乳腺癌轉移[43]。因此，HIF和NF-κB信號通路相互作用在腫瘤微環境中發揮了重要作用，而其具體分子機制也尚不完全明確。
2.5 Hh信號通路
另一個和調節HIF通路相關的重要信號通路是Hh信號通路，Hh對細胞增殖和分化發揮了關鍵作用，Hh信號的活化能誘導腫瘤發生。Hh信號通路是細胞分化、組織極性和細胞增殖的重要調節器[44]。Hh蛋白包括三個分泌蛋白，包括sonic hedgehog (Shh)、desert hedgehog (Dhh)和indian hedgehog (Ihh)。Hh蛋白被多個過程激活，包括分裂、脂化修飾。Patched (PTCH)蛋白是細胞表面Hh信號受體蛋白，可與Hh結合，也可抑制Smoothened (Smo)蛋白。Smo蛋白是Hh信號轉換器。Gli蛋白為Hh信號通路的鋅指核轉錄因子，可與下游基因的特定序列結合，調控Hh信號通路下游靶基因的轉錄表達。在沒有Hh信號時，PTCH與Smo結合，抑制Smo的活化，蛋白激酶A (proteinkinase A,PKA)催化Gli蛋白磷酸化，抑制下游靶基因的轉錄。當Hh結合到其受體PTCH上，解除對Smo的抑制，隨后激活轉錄因子Gli蛋白進入核內激活下游靶基因的表達。
活化的Hh信號存在于基底細胞癌、成神經管細胞瘤、白血病、腎癌、腸胃癌、肺癌、宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌等多種惡性腫瘤疾病中。低氧能夠誘導腫瘤侵襲、EMT發生，并活化Hh通路[45]。在胰腺癌細胞中，缺氧以非配體依賴性的方式上調Smo、Gli 1和基質金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9,MMP 9) 的基因表達，激活Hh信號通路并增強胰腺導管癌的侵襲性[46]。在低氧環境中條件性敲除Smo可減少Hh下游目標基因Gli 1和MMP 9的轉錄，并抑制腫瘤侵襲性。在宮頸癌中，Shh表達的升高和Smo表達的降低，都與臨床腫瘤低氧指標HP5相關[47]。這些數據表明低氧可能介導腫瘤微環境中的Hh信號通路，Smo可能是一個有效的治療靶點。
2.6 PI3K/Akt信號通路
PI3K/Akt/mTOR在各種細胞過程中發揮了關鍵作用，包括細胞增殖、黏附、遷移、侵襲、新陳代謝和存活[48]。在微環境的刺激下，PI3K發生磷酸化作用[49]，促進3、4-二磷酸脂酰肌醇(PIP2) 轉化為3、4、5-三磷酸脂酰肌醇(PIP3) ，致Akt活化，引起mTOR的磷酸化(激活狀態)，從而導致基因轉錄和翻譯的上調。腫瘤抑制蛋白人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)作為一個抑制PI3K活性的磷酸酶，可下調Akt的活化水平，減少mTOR信號[50]。在許多腫瘤中發現有PI3K/Akt/mTOR信號通路的異常激活，且與腫瘤侵襲有關，通過多個細胞信號通路介導EMT過程。實驗發現，前列腺癌經放療處理后具有輻射抗性，細胞增強了集落形成、侵襲能力及球狀體形成能力[51]。此外，還增強了EMT發生和PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白的表達。PI3K/mTOR抑制劑和放療共同作用于這種具有輻射抗性的前列腺癌細胞后，細胞凋亡增強，且EMT標志物和PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白的表達減少。由此可見，前列腺癌發生EMT與PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化相關，聯合抑制劑和放療將是一種克服前列腺癌抗輻射的有前景的方法。
HIF和PI3K/Akt信號通路在腫瘤低氧微環境中可引起EMT，導致腫瘤侵襲。在低氧條件下這兩個信號通路間可交互作用。早期研究顯示在多種細胞(包括癌細胞)中，Akt信號通路參與HIF-1α活性的調節[52]。活化的GSK3可使HIF-1α磷酸化，加速其降解。短暫缺氧可活化PI3K-Akt通路，抑制GSK3的活性，阻止HIF-1α的降解。長期缺氧抑制PI3K-Akt通路，GSK3促進HIF-1α的降解[53]。在正常氧和低氧條件下，Akt/mTOR上調HIF-1α的表達，穩定HIF-1α，增加HIF-1α在各種細胞中的合成。PI3K、Akt或mTOR的特定抑制劑可降低HIF-1α的水平，并且抑制低氧誘導的HIF-1α的激活和VEGF的表達，從而減少血管生成[54]。相比有抑癌基因PTEN表達的前列腺癌細胞中，PTEN表達減少后會促進HIF-1介導的基因表達，引起腫瘤炎癥微環境[55]。HIF信號通路參與PI3K/Akt/mTOR信號通路的調節，從而促進細胞增殖和存活及腫瘤生長。
3 結語
低氧在腫瘤的發展中發揮了重要作用，可以調節EMT過程中的多個相關因素。本文重點總結了腫瘤和上皮間質轉化、HIF信號通路及與低氧相關的信號通路對腫瘤EMT的影響。低氧條件下HIF對腫瘤的發展具有促進作用，深入探索HIF通路靶向抑制劑作為抗腫瘤藥物具有良好的應用前景，可以探索相關藥物阻斷HIF在基因水平的表達，并抑制HIF在蛋白水平的翻譯。而多種信號通路和HIF信號通路相互作用促進腫瘤發展，因此，可以同時抑制其他信號通路和HIF信號通路以達到抑制低氧引起的腫瘤惡化。雖然已發現一些信號通路特異性抑制劑可阻斷促進EMT發生的信號通路，從而抑制腫瘤發展，但是，由于腫瘤發生發展機制錯綜復雜，與低氧相關信號通路抑制劑作用的分子機制還有待進一步研究揭示。
引言
1955年Thomlinson等[1]首次發現人腫瘤中存在低氧，腫瘤細胞遠離血管供給會造成擴散限制性低氧(diffusion-limited hypoxia)。其他研究證實血流隨著時間動態地變化也可能引起腫瘤細胞發生短暫的嚴重低氧，即灌流限制性低氧(perfusion-limited hypoxia)，又稱為急性或波動低氧[2]。這兩種低氧在不同程度上影響了整個腫瘤的低氧水平。引起腫瘤低氧的因素主要有兩個方面：一是實體瘤生長過程中腫瘤細胞快速增殖，引起細胞對氧氣的需求超過腫瘤現有血管對氧氣的供應；二是由于腫瘤新生血管結構和功能的異常導致低氧情況的發生。雖然，腫瘤微環境可通過一系列復雜的分子事件來誘導促血管生成因子的上調以及血管生成抑制劑的下調，促進腫瘤血管新生，但腫瘤血管常常發育不成熟、扭曲并缺乏柔韌、易出現多分支、盲端和新血管旁路等。隨著低氧檢測技術的不斷完善，越來越多的證據表明人腫瘤內普遍存在低氧微環境(氧濃度pO2＜10 mm Hg)，且與許多實體瘤的發展緊密相關[3]。低氧微環境使腫瘤對放化療的敏感顯著下降，并促進腫瘤的遠端轉移[4-5]。目前研究者們廣泛認為低氧微環境與腫瘤增強的侵襲表型相關，涉及眾多機理，其中低氧誘導上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是低氧促進腫瘤遠端轉移的重要機理之一。EMT是指具有極性的上皮細胞為了獲得運動和遷移能力，失去上皮形態和功能特征，并獲得間質細胞形態和功能特征的過程，與腫瘤細胞的侵襲和轉移有著密切關系[6]。低氧環境中EMT的發生與腫瘤微環境、多種蛋白分子及miRNAs等相關，其中低氧介導的信號通路發揮了重要作用。本文重點評述低氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、Notch信號通路、NF-κB信號通路、Hedgehog (Hh)信號通路和PI3K/Akt信號通路等各自在低氧調控腫瘤EMT過程中的作用，以及諸信號通路之間的相互關系。
1 EMT與腫瘤
上皮腫瘤細胞發生轉移必須獲得脫離上皮層、降解和穿過基底膜障礙的能力。EMT理論解釋了上皮腫瘤細胞獲得這種能力的可能機制。腫瘤細胞在EMT過程中丟失了上皮樣細胞特性：包括E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和緊密連接蛋白(zonula occluden-1,ZO-1) 表達的降低，角蛋白為主的細胞骨架的丟失；獲得間充質樣細胞特性：包括N-鈣粘蛋白(N-cadherin)表達的升高，波形蛋白(vimentin)為主的細胞骨架的形成[7]。E-鈣粘蛋白是一種鈣依賴性黏附分子，廣泛分布各上皮細胞中，介導上皮細胞同型相互作用，它在胚胎發育、形態發生、信號轉導、上皮細胞極性及組織細胞完整性的維持等方面起著重要作用[8]。E-鈣粘蛋白黏附功能紊亂將導致細胞間連接松散，與腫瘤的擴散和轉移有著密切關系。在多種人上皮腫瘤的發展過程中E-鈣粘蛋白表達缺失或功能失活，與乳腺癌的不良預后相關[9]。E-鈣粘蛋白表達降低除了直接降低細胞間的黏附外，還會導致參與其介導的細胞黏附復合物β-連環蛋白的移位，并進入細胞核內與T細胞因子(T cell factor,TCF)形成轉錄起始復合物，啟動某些與存活和惡性相關的基因表達[10]。上皮腫瘤細胞EMT過程中失去上皮標志E-鈣粘蛋白的同時也會表達間質相關的標志，如N-鈣粘蛋白和波形蛋白。多種上皮腫瘤的發展過程中，發現E-鈣粘蛋白與N-鈣粘蛋白的表達相反，E-鈣粘蛋白表達的降低伴隨著N-鈣粘蛋白表達的升高[11]。上皮細胞易位表達N-鈣粘蛋白，增強其與正常表達N-鈣粘蛋白的間質細胞的相互作用，使腫瘤細胞更易于浸入基質細胞群[12]。EMT過程中值得注意的另外一個標志是，原來以角蛋白為主的細胞骨架轉變為以波形蛋白為主的細胞骨架，或者兩者共存，從而引起細胞形態的改變[13]。
除了直接影響腫瘤細胞的黏附和運動外，EMT還可以通過以下幾個方面促進腫瘤的轉移。首先，EMT可促進腫瘤細胞對胞外基質的降解和重建，促進腫瘤細胞的侵襲。其次，EMT可以促進腫瘤細胞的干性特征。研究表明誘導上皮腫瘤細胞EMT的過程伴隨著腫瘤干細胞的產生，且用標志物篩選得到的腫瘤干細胞廣泛表達EMT相關基因和蛋白[14]。再者，EMT可提高腫瘤細胞的抗失巢凋亡能力[15]。最后，EMT的腫瘤細胞更耐受放化療[16]。由此可見，EMT是腫瘤轉移過程中的關鍵過程，探索影響腫瘤細胞EMT的因素以及相關信號通路對開發靶向腫瘤轉移的治療方案具有重要意義。微環境在腫瘤發生EMT過程中起著重要作用，其中低氧微環境可以促進腫瘤EMT的發生，并伴隨著侵襲能力的增強。其發生機制與轉錄因子、炎癥因子、信號通路及miRNAs等相關，本文將重點討論低氧介導的信號通路對腫瘤發生EMT的影響。
2 低氧調控EMT的信號通路
低氧可介導腫瘤細胞EMT的發生，HIF信號通路參與維持細胞低氧反應，調節并支持EMT的發生。本文重點總結了與HIF信號通路相關聯其他分子信號通路在腫瘤侵襲中的作用，包括Wnt/β-catenin信號通路、Notch信號通路、NF-κB信號通路、Hh信號通路和PI3K/Akt信號通路等，如圖 1所示。
圖1
低氧介導調控EMT的信號通路
Figure1.
Hypoxia-mediated multiple signaling pathways to regulate the EMT
2.1 HIF與EMT
作為癌癥發展的一個重要特征，低氧通常發生在實體瘤的中心，此處血管常常異常。為了適應低氧環境，HIF被激活以介導腫瘤細胞的基因轉錄調控[17]。HIF由氧濃度依賴調控的HIF-α亞基(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)和不依賴氧且持續表達的HIF-1β亞基組成。HIF-α與HIF-1β通過螺旋環螺旋結構域共同形成一個二聚體復合物，其在基因組中能識別并結合到缺氧反應元件上[18]。HIF-1α在所有細胞中都表達，HIF-2α只在上皮細胞等特定細胞類型中表達，而HIF-3α的屬性和功能在很大程度上還是未知的[19]。HIF-1是介導腫瘤細胞和組織適應低氧微環境的關鍵轉錄因子。脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase domain proteins,PHDs)是一種2-酮戊二酸依賴性的雙加氧酶，其活性依賴氧濃度。常氧條件下，PHDs可將HIF-1α上564位和402位的脯氨酸進行羥基化修飾，腫瘤抑制蛋白(Von Hippel-Lindau tumour suppressor protein,pVHL)可識別并結合被修飾后的HIF-1α，使HIF-1α泛素化，最后降解HIF-1α。低氧條件下，PHDs活性降低，不能羥基化修飾HIF-1α，pVHL無法識別并結合HIF-1α，HIF-1α無法降解。HIF-1α大量積累，并結合HIF-1β形成二聚體進入細胞核，與低氧反應元件(hypoxia response elements,HREs)結合，激活下游靶基因的轉錄表達[20]。HIF信號通路和EMT之間的分子機制包括以下幾個方面。首先，激活HIF-1和HIF-2可以上調EMT相關轉錄因子(如Twist、Snail、Slug和SIP1/ZEB2) 的表達來誘導EMT。其次，低氧和HIF通路可激活EMT相關信號通路如Notch、NF-κB、Wnt/β-catenin和Hh信號通路。再者，低氧和HIF通路可以通過增加EMT相關炎癥因子如腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor,TNF-α)、白細胞介素6 (interleukin 6,IL-6) 和白細胞介素1β (interleukin 1β,IL-1β)的表達來誘導EMT。最后，低氧和HIF通路可以通過直接或間接調節相應蛋白或酶來誘導EMT，調節細胞-基質間相互作用和促進細胞運動能力和侵襲能力[21]。王永興等[22]研究發現，缺氧條件可誘導前列腺癌細胞PC3發生EMT，HIF-1α起關鍵調節作用，其可增強前列腺癌細胞的侵襲，缺氧條件下抑制HIF-1α的表達可抑制前列腺癌細胞發生EMT。近期研究發現，低氧可誘導乳腺癌細胞中環氧合酶2 (cyclooxygenase-2,COX-2) 的過表達，而COX-2的過表達可下調E-鈣粘蛋白的表達，并上調波形蛋白和N-鈣粘蛋白的表達，促進EMT的發生并提高乳腺癌細胞的侵襲能力[23]。HIF通過轉錄激活的下游目標，如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)，參與調節血管生成、細胞存活、增殖、凋亡、黏附和代謝[24]。由此可見，在腫瘤發生發展過程中，HIF通路尤其是HIF-1可促進腫瘤發生EMT。
2.2 Wnt/β-catenin信號通路
Wnt/β-catenin信號通路又稱經典Wnt通路。Wnt蛋白與膜受體卷曲蛋白(Frizzleds,Frz)及低密度脂蛋白受體相關蛋白(low density lipoprotein receptor related protein,LRP)結合后，Frz可作用于蓬亂蛋白(dishevelled,Dsh)，抑制β-catenin的磷酸化，β-catenin在細胞質中積累轉位進入細胞核，與淋巴樣增強子(lymphoid-enhancing factor,LEF)/TCF的轉錄因子結合形成轉錄復合物[25]，激活下游靶基因的轉錄表達，促進腫瘤EMT及腫瘤侵襲轉移等過程[26]。SOX2 (SRY-related HMG-box 2) 是多潛能干細胞標志物之一，可調控目的基因的轉錄，促進細胞增殖和腫瘤發生。SOX2是SOX基因家族的一個成員，在人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞中，其過表達會導致β-catenin的大幅增加和核積累并發生EMT，而在SOX2過表達的細胞中用小RNA干擾β-catenin之后，E-鈣粘蛋白的表達降低及細胞轉移、侵襲能力增強這些現象會減弱。上述研究均說明SOX2誘導EMT的過程依賴于β-catenin的活化[27]，Wnt/β-catenin信號通路參與了腫瘤細胞EMT的發生的過程。
在腫瘤微環境中，HIF和Wnt/β-catenin信號通路相互作用調節腫瘤EMT的發生。結腸腺瘤樣息肉蛋白(adenomatous polyposis coli protein,APC)可與Axin、糖原合成激酶3 (glycogen synthase kinase 3,GSK3) 形成復合物促進β-catenin磷酸化，使得β-catenin降解，降低TCF/LEF的轉錄，抑制下游靶基因的表達。低氧環境中，HIF-1α可結合APC啟動子HREs形成轉錄起始復合物，抑制β-catenin的磷酸化，阻止β-catenin的降解，β-catenin水平上升進入細胞核，促進下游靶基因的表達[28]。肝癌中HIF-1α與TCF4競爭結合β-catenin，低氧抑制β-catenin-TCF4復合物的形成，提高的HIF-1α活性伴隨著更顯著的EMT特征。肝癌中Wnt/β-catenin信號通路也可提高HIF-1α的活性并防止腫瘤細胞死亡，促進低氧誘導EMT的發生[29]。由此可見，HIF被低氧激活后，參與調節Wnt/β-catenin信號通路，并在腫瘤的發生發展中參與誘發EMT的過程。
2.3 Notch信號通路
Notch信號通路在調節細胞諸多基本過程中發揮著重要作用，可調節干細胞更新和多向分化、胚胎器官組織發育，控制成人組織細胞分化、增殖和凋亡[30]。Notch信號通路可被相鄰細胞的受體配位基相互作用而激活。激活后，Notch被金屬蛋白酶TNF-α轉化酶(TNF-α-converting enzyme,TACE)和γ-分泌酶裂解，釋放Notch胞外域(Notch extracellular domain,NECD)和Notch胞內域(Notch intracellular domain,NICD)。NECD參與受體配位基綁定，NICD進入細胞核激活Notch靶基因的轉錄，如Hes1、Hey1和細胞周期蛋白D1[31]。Notch信號通路在腫瘤侵襲過程中發揮著關鍵作用，調節細胞增殖、凋亡、侵襲和EMT效應。
低氧可誘導HIF-1α激活Notch信號通路，促進腫瘤細胞增殖和侵襲[32]。在黑色素瘤中，低氧環境可促進細胞侵襲，敲除HIF-1α后細胞侵襲能力降低。Notch1在低氧環境中過表達，抑制其表達可阻斷低氧引起的細胞侵襲，Notch信號通路參與了低氧刺激EMT過程，從而增強細胞運動性和侵襲性[33-34]。抑制Notch信號通路能解除低氧介導的EMT和侵襲。另一方面，活化的Notch能代替低氧誘導該過程。研究發現，在低氧條件下，乳腺癌細胞中的Notch與EMT轉錄因子Snail呈正相關[35]。Notch通過兩種作用機制來協同控制Snail-1的表達，是EMT的關鍵調節器。首先，NICD募集到Snail-1啟動子上，直接上調Snail-1的表達。其次，Notch可加強HIF-1α募集到賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)啟動子上，促進低氧誘導LOX的上調，穩定Snail-1蛋白。這些研究表明低氧在調節EMT的過程中依賴Notch蛋白的作用。雖然Notch信號通路誘導腫瘤EMT已有研究報道，但其具體分子機制尚未清楚，還有待進一步研究。
2.4 NF-κB信號通路
在許多腫瘤中，NF-κB可以調控與細胞存活、增殖、侵襲、遷移及腫瘤轉移相關的基因的表達，促進EMT的發生。正常情況下，NF-κB的抑制基因IκB結合到NF-κB上，抑制NF-κB的核轉移，NF-κB蛋白隱藏在細胞質中。細胞一旦受到刺激，IκB蛋白在IκB激酶(IκB kinase,IKK)復合物作用下磷酸化、泛素化，在蛋白酶體的作用下降解，最后導致NF-κB核內聚集并激活目標基因的轉錄。低氧可激活很多細胞(包括腫瘤細胞)中的NF-κB信號通路[36]。NF-κB主要是炎癥和抗凋亡基因表達的調節器[37]。研究者推測低氧誘導NF-κB的活化，有利于腫瘤發生和發展過程中EMT特性的維持。HIF-1α介導NF-κB的活化，HIF-1α功能的缺失會降低NF-κB活化，而提高HIF-1α的表達會激活NF-κB[38]。被HIF-1α激活的NF-κB參與癌細胞的生存、侵襲和腫瘤生長[39]。因此在腫瘤微環境中，低氧活化HIF通路在調節NF-κB通路中發揮了重要作用。
研究表明低氧可通過激活IKK信號來誘導NF-κB的活化，尤其是IKK-β[40]。低氧可通過PHD 1的表達來激活IKK，因為IKK-β含有PHD 1羥基化的序列類似圖案。抑制PHD 1信號羥基化會增加NF-κB信號。在結直腸癌中，IKK-β磷酸化需要熱休克蛋白90 (heat shock protein 90,Hsp 90) ，PHD 3可阻止IKK-β和Hsp 90相互作用，從而抑制IKK-β和NF-κB蛋白磷酸化。敲除PHD 3可增加IKK信號并抑制這些癌細胞對TNF-α的抗性，促進腫瘤發生[41]。低氧誘導IKK激酶調節IKK的活化，導致NF-κB活化，條件性缺失IKK激酶可抑制低氧誘導IKK活化[42]。這些研究表明低氧可激活IKK，尤其是IKK-β，在腫瘤低氧微環境中NF-κB通路可能發揮了關鍵作用。體外實驗顯示，HIF和NF-κB通路相互作用誘導乳腺癌EMT和遷移，促進乳腺癌轉移[43]。因此，HIF和NF-κB信號通路相互作用在腫瘤微環境中發揮了重要作用，而其具體分子機制也尚不完全明確。
2.5 Hh信號通路
另一個和調節HIF通路相關的重要信號通路是Hh信號通路，Hh對細胞增殖和分化發揮了關鍵作用，Hh信號的活化能誘導腫瘤發生。Hh信號通路是細胞分化、組織極性和細胞增殖的重要調節器[44]。Hh蛋白包括三個分泌蛋白，包括sonic hedgehog (Shh)、desert hedgehog (Dhh)和indian hedgehog (Ihh)。Hh蛋白被多個過程激活，包括分裂、脂化修飾。Patched (PTCH)蛋白是細胞表面Hh信號受體蛋白，可與Hh結合，也可抑制Smoothened (Smo)蛋白。Smo蛋白是Hh信號轉換器。Gli蛋白為Hh信號通路的鋅指核轉錄因子，可與下游基因的特定序列結合，調控Hh信號通路下游靶基因的轉錄表達。在沒有Hh信號時，PTCH與Smo結合，抑制Smo的活化，蛋白激酶A (proteinkinase A,PKA)催化Gli蛋白磷酸化，抑制下游靶基因的轉錄。當Hh結合到其受體PTCH上，解除對Smo的抑制，隨后激活轉錄因子Gli蛋白進入核內激活下游靶基因的表達。
活化的Hh信號存在于基底細胞癌、成神經管細胞瘤、白血病、腎癌、腸胃癌、肺癌、宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌等多種惡性腫瘤疾病中。低氧能夠誘導腫瘤侵襲、EMT發生，并活化Hh通路[45]。在胰腺癌細胞中，缺氧以非配體依賴性的方式上調Smo、Gli 1和基質金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9,MMP 9) 的基因表達，激活Hh信號通路并增強胰腺導管癌的侵襲性[46]。在低氧環境中條件性敲除Smo可減少Hh下游目標基因Gli 1和MMP 9的轉錄，并抑制腫瘤侵襲性。在宮頸癌中，Shh表達的升高和Smo表達的降低，都與臨床腫瘤低氧指標HP5相關[47]。這些數據表明低氧可能介導腫瘤微環境中的Hh信號通路，Smo可能是一個有效的治療靶點。
2.6 PI3K/Akt信號通路
PI3K/Akt/mTOR在各種細胞過程中發揮了關鍵作用，包括細胞增殖、黏附、遷移、侵襲、新陳代謝和存活[48]。在微環境的刺激下，PI3K發生磷酸化作用[49]，促進3、4-二磷酸脂酰肌醇(PIP2) 轉化為3、4、5-三磷酸脂酰肌醇(PIP3) ，致Akt活化，引起mTOR的磷酸化(激活狀態)，從而導致基因轉錄和翻譯的上調。腫瘤抑制蛋白人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)作為一個抑制PI3K活性的磷酸酶，可下調Akt的活化水平，減少mTOR信號[50]。在許多腫瘤中發現有PI3K/Akt/mTOR信號通路的異常激活，且與腫瘤侵襲有關，通過多個細胞信號通路介導EMT過程。實驗發現，前列腺癌經放療處理后具有輻射抗性，細胞增強了集落形成、侵襲能力及球狀體形成能力[51]。此外，還增強了EMT發生和PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白的表達。PI3K/mTOR抑制劑和放療共同作用于這種具有輻射抗性的前列腺癌細胞后，細胞凋亡增強，且EMT標志物和PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白的表達減少。由此可見，前列腺癌發生EMT與PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化相關，聯合抑制劑和放療將是一種克服前列腺癌抗輻射的有前景的方法。
HIF和PI3K/Akt信號通路在腫瘤低氧微環境中可引起EMT，導致腫瘤侵襲。在低氧條件下這兩個信號通路間可交互作用。早期研究顯示在多種細胞(包括癌細胞)中，Akt信號通路參與HIF-1α活性的調節[52]。活化的GSK3可使HIF-1α磷酸化，加速其降解。短暫缺氧可活化PI3K-Akt通路，抑制GSK3的活性，阻止HIF-1α的降解。長期缺氧抑制PI3K-Akt通路，GSK3促進HIF-1α的降解[53]。在正常氧和低氧條件下，Akt/mTOR上調HIF-1α的表達，穩定HIF-1α，增加HIF-1α在各種細胞中的合成。PI3K、Akt或mTOR的特定抑制劑可降低HIF-1α的水平，并且抑制低氧誘導的HIF-1α的激活和VEGF的表達，從而減少血管生成[54]。相比有抑癌基因PTEN表達的前列腺癌細胞中，PTEN表達減少后會促進HIF-1介導的基因表達，引起腫瘤炎癥微環境[55]。HIF信號通路參與PI3K/Akt/mTOR信號通路的調節，從而促進細胞增殖和存活及腫瘤生長。
3 結語
低氧在腫瘤的發展中發揮了重要作用，可以調節EMT過程中的多個相關因素。本文重點總結了腫瘤和上皮間質轉化、HIF信號通路及與低氧相關的信號通路對腫瘤EMT的影響。低氧條件下HIF對腫瘤的發展具有促進作用，深入探索HIF通路靶向抑制劑作為抗腫瘤藥物具有良好的應用前景，可以探索相關藥物阻斷HIF在基因水平的表達，并抑制HIF在蛋白水平的翻譯。而多種信號通路和HIF信號通路相互作用促進腫瘤發展，因此，可以同時抑制其他信號通路和HIF信號通路以達到抑制低氧引起的腫瘤惡化。雖然已發現一些信號通路特異性抑制劑可阻斷促進EMT發生的信號通路，從而抑制腫瘤發展，但是，由于腫瘤發生發展機制錯綜復雜，與低氧相關信號通路抑制劑作用的分子機制還有待進一步研究揭示。
