以載體雙表達的方式構建監測環境中四環素類抗生素污染的重組酵母細胞。在表達載體中，用3-磷酸甘油醛脫氫酶（GPD）啟動子驅動四環素阻遏蛋白基因（TR）的表達，并使其與V5抗原表位編碼基因相融合。在報告載體中，用四環素效應元件（TRE）調控的Lac Z作為報告基因。將兩者轉化于酵母細胞中，構建成四環素類抗生素調控的重組Lac Z基因酵母細胞。用不同濃度的四環素類抗生素和非四環素類抗生素對重組酵母細胞分別進行敏感度和特異度研究。結果表明四環素類抗生素與該重組酵母細胞報告基因表達水平有明顯的劑量效應關系，說明對檢測四環素類抗生素有較好的敏感性，而非四環素類藥物與重組酵母細胞報告基因表達水平之間無明顯的劑量效應關系，說明其檢測具有良好的特異性。該重組基因酵母細胞可用于對環境四環素類抗生素污染程度的監測。
引用本文： 徐秀舉, 田永杰, 王超, 周天棋, 周羅晶, 李湘鳴. 快速檢測四環素類抗生素的重組Lac Z基因酵母細胞的建立. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(3): 481-487. doi: 10.7507/1001-5515.20160081 復制
引言
眾所周知，抗生素在治療感染性疾病方面發揮了巨大作用，保障了人類的生命健康。但是，抗生素的廣泛使用對人類和生態環境的負面效應也開始凸顯，如導致致病菌的耐藥性不斷增加[1-2]。在我國養殖業所使用的抗生素中，四環素類是使用最多的添加劑，這是由于其抗菌譜廣、具有良好的殺菌或抑菌作用，且價格低廉。現在已有1 000多種人工合成的衍生物，其中7種使用最多。據報道，在畜禽生產中使用的四環素類抗生素有30%～90%以母體化合物或以活性代謝物的形式隨糞便排出，有的甚至可高達95%[3-5]。因此，這類抗生素在畜禽生產中的使用量越大，畜禽糞便中殘留的抗生素量就越大，對環境特別是對土壤環境造成的污染也越嚴重。因此,監測環境中四環素類抗生素的污染具有十分重要的現實意義。
如何監測環境中四環素類抗生素的污染，目前所用的方法很多,但這些傳統的監測方法成本較高,操作復雜,不適用于經常性的常規監測。然而，使用生物傳感器檢測不失為一種較好的方法。研究發現細菌可通過四環素Tn10轉座子來實現對四環素類抗生素的耐藥性，而這一機制有可能用于對四環素類抗生素的監測。根據Tn10轉座子Tet-on/off(四環素開關)這一原理[6-7]，可將酵母3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GPD)啟動子與四環素阻遏蛋白(tetracycline repressor protein，tetR)基因相融合，使tetR在酵母細胞中高效表達，再將另一酵母CYC1(cytochrome oxidase 1，細胞色素氧化酶1) 啟動子與四環素反應元件(tetracycline responsive element，TRE)和Lac Z報告基因(β-半乳糖苷酶)相串聯，構建成四環素類抗生素調控的酵母細胞報告載體，轉化于酵母細胞。當四環素類抗生素作于該重組酵母細胞時，會使Lac Z報告基因發生表達，通過檢測β-半乳糖苷酶的表達量，可快速、方便地監測環境中四環素類抗生素的污染程度(見圖 1)。
圖1
四環素類抗生素調控的重組Lac Z酵母細胞
Figure1.
Scheme of the recombinant Lac Z yeast cell regulated by tetracycline
1 材料與方法
1.1 GPD驅動的V5與TR相融合的酵母表達載體的構建
以pcDNA/TR(Clontech公司)為模板，PCR擴增TR基因，上游引物為5′-GTGgaattc
圖2
pGPDV5-TR載體
Figure2.
Vector of pGPDV5-TR
1.2 TR在酵母細胞中的表達
將pGPDV5-TR用醋酸鋰(LiAC)方法轉化于感受態酵母細胞W303-1A(基因型：Matα,ade2-1,his3-11,leu2-3,trp1-1,ura3-1) ，轉化液均勻涂布于SD/-trp(缺乏色氨酸)選擇性培養板上，置于30 ℃培養3~4 d，篩選出陽性克隆，用保鮮膜密封，4 ℃保存備用。按文獻[9]所介紹的方法提取其酵母DNA，用PCR方法鑒定TR基因的存在，引物和擴增條件與上述1.1節相同。將PCR鑒定正確的重組基因酵母細胞(命名為W303-1A/TR)劃線接種于SD/-trp培養板，30 ℃培養3~4 d。挑取單菌落接種于SD/-trp酵母培養液，30 ℃振蕩培養，取對數生長期的酵母細胞培養液10 mL，按Invitrogen公司所介紹的方法提取蛋白質，用5%濃縮膠和10%分離膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(恒壓70 V)，用濕式電轉法(恒流250 mA)將凝膠分離的蛋白質轉至硝酸纖維膜，用5％脫脂奶粉封閉，用小鼠抗V5表位的單克隆抗體IgG2a(Invitrogen公司)4 ℃雜交過夜，用偶聯有辣根過氧化物酶的羊抗小鼠二抗(IgG-HRP，北京天根公司產)二次雜交，DAB(3，3-四鹽酸二氨基聯苯胺)試劑盒(武漢博士德公司)顯色，操作按照說明書進行。
1.3 TRE效應元件調控Lac Z報告載體的構建
pMP206載體的CYC1啟動子上有兩個TATA框，分別是α-和β-TATA框。用此載體分別構建2種TRE調控的Lac Z酵母報告載體：①將TRE調控元件插到α-和β-TATA框之間，命名為pTeton-Lac Z；②將TRE調控元件插到α-TATA框的下游，即CYC1啟動子與Lac Z報告基因之間，命名為pyTeton-Lac Z。
1.3.1 pTeton-Lac Z的構建
人工合成以下Tet On效應元件(TRE)，正向5′-gTCCCTATCAGTG ATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGAgcatg-3′，反向5′-cTCTCTATCACTGATAGGGAGAT CTCTATCACTGATAGGGActgca-3′，兩端分別設計Pst Ⅰ和Sph Ⅰ黏性末端(小寫黑字所示)。對pMP206用Pst Ⅰ和Sph Ⅰ雙酶切，酶切產物用1.0%瓊脂糖電泳析，用北京天根公司的試劑盒切膠回收。將TRE常規退火后[9]，將其插入到pMP206相應酶切位點，方法如同1.1節，將其命名為pTeton-Lac Z-1。
以pMP206為模板，PCR擴增Pst Ⅰ上游具有β-TATA框的CYC1啟動子部分，引物設計為上游5′-AAA
圖3
pTeton-Lac Z酵母報告載體
Figure3.
Scheme of pTeton-Lac Z yeast reporter vector
1.3.2 pyTeton-Lac Z的構建
人工合成TRE，正向5′-gatccTCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGA
圖4
pyTeton-Lac Z酵母報告載體
Figure4.
Scheme of pyTeton-Lac Z yeast reporter vector
1.4 TRE調控的Lac Z重組基因酵母細胞的篩選
用醋酸鋰轉化法，分別將pTeton-Lac Z和pyTeton-Lac Z轉化于酵母細胞W303-1A/TR，經SD/-trp,-ura(無色氨酸和尿嘧啶，美國Clontech公司產)選擇性培養板篩選出陽性轉化子克隆。隨機挑取10個酵母克隆，提取酵母質粒進行PCR鑒定，引物分別為擴增TR的上、下游引物和TRE正鏈及Lac Z部分序列(5′-TGGGTA CGCCAGGGTTTT-3′)作為上、下游引物。將PCR鑒定正確的2種不同重組酵母細胞分別命名為W303-1A/TR-Teton-Lac Z和W303-1A/TR-yTeton-Lac Z。前者TRE通過阻遏β-TATA框啟動子調控Lac Z的表達，后者通過阻遏α-和β-TATA框調控Lac Z的表達。
分別隨機選取4個PCR鑒定正確的酵母轉化子，用四環素進行劑量效應關系研究(見實驗研究部分)，發現W303-1A/TR-yTeton-Lac Z與四環素有明顯的劑量效應關系，故用該重組酵母細胞進行實驗研究，而W303-1A/TR-Teton-Lac Z與四環素無劑量效應關系(資料省略)，不進行相應的實驗研究。
1.5 實驗研究
1.5.1 敏感性研究
選用以下四環素類藥物對W303-1A/TR-yTeton-Lac Z重組酵母細胞進行敏感性研究：四環素(tetracycline)、土霉素(oxytetracycline)和鹽酸多西環素(doxycycline)。
從SD/-trp,-ura平板挑取W303-1A/TR-yTeton-Lac Z酵母克隆于SD/-trp,-ura培養液中，30 ℃振蕩培養過夜，使其OD600位于1.5～2.0之間；取9只5 mL消毒瓶，加入1.5 mL SD/-trp,-ura培養液和0.5 mL振蕩培養過夜的303-1A/TR-yTeton-Lac Z培養液，再依次加入用生理鹽水配制不同濃度的四環素類藥物溶液10 μL，使其終濃度分別為：0(對照，10 μL生理鹽水)、1.6、3.1、6.25、12.5、25、50和100 μg/mL，30 ℃繼續振蕩培養12 h。
取受試物作用的W303-1A/TR-yTeton-Lac Z酵母細胞1.5 mL，于2 mL離心管中，13 000 r/min離心30 s，棄上清收集細胞，用Z緩沖液1 mL懸浮，加入氯仿50 μL和0.1% SDS Z緩沖液15 μL，混勻，于37 ℃放置15 min后，再加入鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷 (ONPG )200 μL(4 mg/mL，Z緩沖液配制)，于37 ℃ 30 min內顯色，記錄顯色時間，用1 mol/L Na2CO3 0.5 mL中止，13 000 r/min離心30 s，取上清200 μL于透明酶標板內(3個復孔)，用多功能酶標儀測OD405光密度。
同時將受試物作用的W303-1A/TR-yTeton-Lac Z混勻，取100 μL于透明酶標板內(做3個復孔)，于600 nm測細胞密度(OD600)，用OD405/OD600比值表示重組酵母細胞表達的β-半乳糖苷酶活性。
1.5.2 特異性研究
用以下非四環素類藥物對W303-1A/TR-yTeton-Lac Z重組酵母細胞進行特異性研究：利福平、氯霉素和卡那霉素。劑量設計和方法同上述四環素類藥物。
1.6 資料的分析與處理
用Excel統計軟件分別計算酶活性的均數±標準差(x±s)。在進行劑量效應分析時，為消除時間、細胞數量不同對β-半乳糖苷酶活性的影響，用試驗組與空白對照組所誘導的酶活性之比即誘導倍數，進行統計制圖分析。
2 結果
2.1 pGPD-V5-TR酵母表達載體
TR基因全長663 bp，如果TR插入pGDPV5的相應酶切位點之間，經用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后，應產生663 bp和4 850 bp兩條帶。由圖 5可見，電泳分析發現1、5號克隆與對照明顯不同。對1號克隆測序發現TR閱讀框正確，并與V5相融合(資料省略)。
圖5
pGPD-V5-TR轉化子質粒的酶切電泳鑒定
1~7：不同轉化子質粒；對照:pGDPV5
Figure5. Enzyme digestion forpGPD-V5-TR transformant plasmid1-7 band：the plasmids for different transformant; control: pGDPV5
2.2 TRE調控的Lac Z酵母報告載體
CYC1酵母基本啟動子為280 bp，當TRE插入到Pst Ⅰ和SphⅠ之間時，就會取代120 bp的CYC1啟動子序列，這樣pTeton-Lac Z-1轉化子質粒用的EcoR Ⅰ與Pst Ⅰ雙切后，應產生160 bp和8 000 bp的兩條帶，而對照應產生280 bp和8 000 bp兩條帶。由圖 6可見，酶切產物經用2.0%瓊脂糖電泳分析，發現1、2和3號克隆陽性，并經測序發現TRE序列正確插入到Pst Ⅰ和Sph Ⅰ之間(資料省略)。
圖6
pTeton-Lac Z-1轉化子質粒的酶切電泳鑒定
1~5：不同轉化子質粒；對照：pMP206
Figure6. Enzyme digestion for pTeton-Lac Z-1 transformant plasmid1-5 band： the plasmids for different transformant; control： pMP206
在pMP206載體上，有3個Nde Ⅰ酶切位點，分別位于CYC1啟動子的α-TATA框的上游、Lac Z報告基因的下游及Ura選擇性標志的下游。如果α-TATA框上游的CYC1啟動子插入到pTeton-LacZ-1載體，用Nde Ⅰ酶切后應產生3條帶，分別為1 181 bp(4 401－3 220) 、 3 946 bp(8 347－4 401) 和3 220 bp，所以，由圖 7可見，1、2、3、6號pTeton-Lac Z轉化子克隆質粒鑒定為陽性。對1號克隆測序證實pTeton-Lac Z構建成功(資料省略)。
圖7
pTeton-Lac Z轉化子質粒的Nde Ⅰ酶切電泳鑒定
1~10：不同轉化子質粒；M：DNA marker
Figure7. Nde Ⅰ digestion for pyTeton-Lac Z transformant plasmid1-10 band： the plasmids for different transformant; M： DNA marker
TRE含有Bgl Ⅱ唯一酶切點，用Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切后應產生2條帶，分別為約300 bp和8 000 bp(見圖 8)，可見1和3號克隆為陽性。對1號克隆測序發現TRE已正確插入CYC1啟動子和Lac Z報告基因之間(資料省略)，命名為pyTeton-LacZ。
圖8
Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ對pyTeton-LacZ轉化子質粒的酶切電泳鑒定
1~9:不同轉化子質粒；對照：pMP206
Figure8. Bgl Ⅱ and Hind Ⅲ double digestion for pyTeton-Lac Z transformant plasmid1-9 band： the plasmids for different transformant; control: pMP206
2.3 GPD驅動TR在酵母中的表達
tetR分子量為22 kD。圖 9為對tetR在酵母細胞中表達的Western blot分析，可見經PCR鑒定的陽性克隆，均見有一特異性條帶，提示tetR在酵母細胞中成功表達。
圖9
W303-1A/TR酵母細胞提取蛋白的Western blot分析
1~6：PCR鑒定陽性的W303-1A/TR酵母細胞克隆
Figure9. Western blot analysis of protein from W303-1A/TR yeast extract1-6 band: the positive clones of W303-1A/TR by Western blot
2.4 重組酵母細胞的實驗研究
由圖 10可見，W303-1A/TR-yTeton-Lac Z重組酵母細胞與土霉素的劑量效應關系最明顯，在1.6 μg/mL以上濃度時，β-半乳糖苷酶活性開始增加，在25 μg/mL時達高峰，以后由于對細胞毒性的增加，酶活性受到抑制；四環素亦與重組酵母細胞呈現劑量效應關系，但在6.25 μg/mL時酶活性達高峰，細胞毒性亦較強，在12.5 μg/mL以上濃度組，呈現酶活性低于對照組的現象；多西環素(強力霉素)在12.5 μg/mL以上濃度組時，酶活性開始有所增加，25 μg/mL時達高峰，以后因細胞毒性酶活性受到抑制，但仍高于對照組。
圖10
W303-1A/TR-yTeton-Lac Z與四環素類抗生素的劑量效應關系分析
Figure10.
Analysis of dose-effect relationships between W303-1A/TR-yTeton-Lac Z and tetracycline antibiotics
由圖 11可見，W303-1A/TR-yTeton-Lac Z與非四環素類抗生素(利福平、氯霉素和卡那霉素)之間無劑量效應關系，劑量效應曲線呈隨機波動，說明該重組酵母細胞的特異性較高。
圖11
W303-1A/TR-yTeton-Lac Z與非四環素類抗生素的劑量效應關系分析
Figure11.
Analysis of dose-effect relationships between W303-1A/TR-yTeton-Lac Z and non-tetracycline antibiotics
3 討論
研究四環素類抗生素對土壤環境的污染程度，常用的檢測方法是免疫分析法、高效液相色譜法、氣相色譜法和色/質聯用分析法等[8-10]，但這些方法對檢測操作人員要求高，需經過專門培訓，需要比較精密的檢測儀器，對待測樣品的純度要求較高，而且成本較高，受檢測場地等因素的限制，不便于攜帶，使用時會受到一定程度的限制，因此，不適用于經常性的、常規的環境監測。
Tet-on/off系統具有高效、特異、低毒和能嚴密開關目的基因的特點，具有良好的調控基因表達效果。國外有研究者用大腸桿菌作為宿主細胞，用細菌熒光素酶作用報告基因，將Tet-on/off這一調控系統轉染于大腸桿菌,用于監測環境中的四環素類抗生素的污染[11]。但是，原核細胞對抗生素的抵抗力差，而且，細菌熒光素酶底物較貴，測定時需要較為昂貴的儀器，所以在實際應用時會有許多不便。酵母是最簡單的真核細胞，對多數抗生素有較強的抵抗力，其生長條件又與原核細胞相似，因此，用酵母作為宿主細胞構建四環素類藥物傳感器是理想的選擇。所用的報告基因為Lac Z基因，是目前最常用的報告基因，其轉錄后翻譯產物β-半乳糖苷酶可分解底物鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷，生成半乳糖和黃色的鄰-硝基苯酚，因此可以通過顏色的變化測知β-半乳糖苷酶的活性。由于β-半乳糖苷酶的活性測定所需設備為常見的光電比色儀，加之成本不高及操作也相對簡單，所以Lac Z基因成為目前分子生物學技術中最常見的報告基因。
由于TRE只有53 bp，酶切鑒定其正確插入較為困難，但可利用其存在的特異酶切位點或通過插入后造成的某種酶切位點間的DNA大小變化進行酶切鑒定。在用Tet-on/off這一系統調控下游報告基因的表達時，四環素反應元件TRE插入的位點非常重要，最好將其置于啟動子與報告基因之間，這樣tetR與其結合后，可以有效地阻遏下游基因的轉錄表達，這是因為TRE不是增強子，對下游基因沒有順式調控效果。CYC1啟動子是酵母基本啟動子。當將TRE插入到TATA之間時，下游的α-TATA框仍然可以有效地發揮啟動效果，這是重組酵母細胞(W303-1A/Teton-Lac Z)為何無明顯劑量效應的原因。
引言
眾所周知，抗生素在治療感染性疾病方面發揮了巨大作用，保障了人類的生命健康。但是，抗生素的廣泛使用對人類和生態環境的負面效應也開始凸顯，如導致致病菌的耐藥性不斷增加[1-2]。在我國養殖業所使用的抗生素中，四環素類是使用最多的添加劑，這是由于其抗菌譜廣、具有良好的殺菌或抑菌作用，且價格低廉。現在已有1 000多種人工合成的衍生物，其中7種使用最多。據報道，在畜禽生產中使用的四環素類抗生素有30%～90%以母體化合物或以活性代謝物的形式隨糞便排出，有的甚至可高達95%[3-5]。因此，這類抗生素在畜禽生產中的使用量越大，畜禽糞便中殘留的抗生素量就越大，對環境特別是對土壤環境造成的污染也越嚴重。因此,監測環境中四環素類抗生素的污染具有十分重要的現實意義。
如何監測環境中四環素類抗生素的污染，目前所用的方法很多,但這些傳統的監測方法成本較高,操作復雜,不適用于經常性的常規監測。然而，使用生物傳感器檢測不失為一種較好的方法。研究發現細菌可通過四環素Tn10轉座子來實現對四環素類抗生素的耐藥性，而這一機制有可能用于對四環素類抗生素的監測。根據Tn10轉座子Tet-on/off(四環素開關)這一原理[6-7]，可將酵母3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GPD)啟動子與四環素阻遏蛋白(tetracycline repressor protein，tetR)基因相融合，使tetR在酵母細胞中高效表達，再將另一酵母CYC1(cytochrome oxidase 1，細胞色素氧化酶1) 啟動子與四環素反應元件(tetracycline responsive element，TRE)和Lac Z報告基因(β-半乳糖苷酶)相串聯，構建成四環素類抗生素調控的酵母細胞報告載體，轉化于酵母細胞。當四環素類抗生素作于該重組酵母細胞時，會使Lac Z報告基因發生表達，通過檢測β-半乳糖苷酶的表達量，可快速、方便地監測環境中四環素類抗生素的污染程度(見圖 1)。
圖1
四環素類抗生素調控的重組Lac Z酵母細胞
Figure1.
Scheme of the recombinant Lac Z yeast cell regulated by tetracycline
1 材料與方法
1.1 GPD驅動的V5與TR相融合的酵母表達載體的構建
以pcDNA/TR(Clontech公司)為模板，PCR擴增TR基因，上游引物為5′-GTGgaattc
圖2
pGPDV5-TR載體
Figure2.
Vector of pGPDV5-TR
1.2 TR在酵母細胞中的表達
將pGPDV5-TR用醋酸鋰(LiAC)方法轉化于感受態酵母細胞W303-1A(基因型：Matα,ade2-1,his3-11,leu2-3,trp1-1,ura3-1) ，轉化液均勻涂布于SD/-trp(缺乏色氨酸)選擇性培養板上，置于30 ℃培養3~4 d，篩選出陽性克隆，用保鮮膜密封，4 ℃保存備用。按文獻[9]所介紹的方法提取其酵母DNA，用PCR方法鑒定TR基因的存在，引物和擴增條件與上述1.1節相同。將PCR鑒定正確的重組基因酵母細胞(命名為W303-1A/TR)劃線接種于SD/-trp培養板，30 ℃培養3~4 d。挑取單菌落接種于SD/-trp酵母培養液，30 ℃振蕩培養，取對數生長期的酵母細胞培養液10 mL，按Invitrogen公司所介紹的方法提取蛋白質，用5%濃縮膠和10%分離膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(恒壓70 V)，用濕式電轉法(恒流250 mA)將凝膠分離的蛋白質轉至硝酸纖維膜，用5％脫脂奶粉封閉，用小鼠抗V5表位的單克隆抗體IgG2a(Invitrogen公司)4 ℃雜交過夜，用偶聯有辣根過氧化物酶的羊抗小鼠二抗(IgG-HRP，北京天根公司產)二次雜交，DAB(3，3-四鹽酸二氨基聯苯胺)試劑盒(武漢博士德公司)顯色，操作按照說明書進行。
1.3 TRE效應元件調控Lac Z報告載體的構建
pMP206載體的CYC1啟動子上有兩個TATA框，分別是α-和β-TATA框。用此載體分別構建2種TRE調控的Lac Z酵母報告載體：①將TRE調控元件插到α-和β-TATA框之間，命名為pTeton-Lac Z；②將TRE調控元件插到α-TATA框的下游，即CYC1啟動子與Lac Z報告基因之間，命名為pyTeton-Lac Z。
1.3.1 pTeton-Lac Z的構建
人工合成以下Tet On效應元件(TRE)，正向5′-gTCCCTATCAGTG ATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGAgcatg-3′，反向5′-cTCTCTATCACTGATAGGGAGAT CTCTATCACTGATAGGGActgca-3′，兩端分別設計Pst Ⅰ和Sph Ⅰ黏性末端(小寫黑字所示)。對pMP206用Pst Ⅰ和Sph Ⅰ雙酶切，酶切產物用1.0%瓊脂糖電泳析，用北京天根公司的試劑盒切膠回收。將TRE常規退火后[9]，將其插入到pMP206相應酶切位點，方法如同1.1節，將其命名為pTeton-Lac Z-1。
以pMP206為模板，PCR擴增Pst Ⅰ上游具有β-TATA框的CYC1啟動子部分，引物設計為上游5′-AAA
圖3
pTeton-Lac Z酵母報告載體
Figure3.
Scheme of pTeton-Lac Z yeast reporter vector
1.3.2 pyTeton-Lac Z的構建
人工合成TRE，正向5′-gatccTCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGA
圖4
pyTeton-Lac Z酵母報告載體
Figure4.
Scheme of pyTeton-Lac Z yeast reporter vector
1.4 TRE調控的Lac Z重組基因酵母細胞的篩選
用醋酸鋰轉化法，分別將pTeton-Lac Z和pyTeton-Lac Z轉化于酵母細胞W303-1A/TR，經SD/-trp,-ura(無色氨酸和尿嘧啶，美國Clontech公司產)選擇性培養板篩選出陽性轉化子克隆。隨機挑取10個酵母克隆，提取酵母質粒進行PCR鑒定，引物分別為擴增TR的上、下游引物和TRE正鏈及Lac Z部分序列(5′-TGGGTA CGCCAGGGTTTT-3′)作為上、下游引物。將PCR鑒定正確的2種不同重組酵母細胞分別命名為W303-1A/TR-Teton-Lac Z和W303-1A/TR-yTeton-Lac Z。前者TRE通過阻遏β-TATA框啟動子調控Lac Z的表達，后者通過阻遏α-和β-TATA框調控Lac Z的表達。
分別隨機選取4個PCR鑒定正確的酵母轉化子，用四環素進行劑量效應關系研究(見實驗研究部分)，發現W303-1A/TR-yTeton-Lac Z與四環素有明顯的劑量效應關系，故用該重組酵母細胞進行實驗研究，而W303-1A/TR-Teton-Lac Z與四環素無劑量效應關系(資料省略)，不進行相應的實驗研究。
1.5 實驗研究
1.5.1 敏感性研究
選用以下四環素類藥物對W303-1A/TR-yTeton-Lac Z重組酵母細胞進行敏感性研究：四環素(tetracycline)、土霉素(oxytetracycline)和鹽酸多西環素(doxycycline)。
從SD/-trp,-ura平板挑取W303-1A/TR-yTeton-Lac Z酵母克隆于SD/-trp,-ura培養液中，30 ℃振蕩培養過夜，使其OD600位于1.5～2.0之間；取9只5 mL消毒瓶，加入1.5 mL SD/-trp,-ura培養液和0.5 mL振蕩培養過夜的303-1A/TR-yTeton-Lac Z培養液，再依次加入用生理鹽水配制不同濃度的四環素類藥物溶液10 μL，使其終濃度分別為：0(對照，10 μL生理鹽水)、1.6、3.1、6.25、12.5、25、50和100 μg/mL，30 ℃繼續振蕩培養12 h。
取受試物作用的W303-1A/TR-yTeton-Lac Z酵母細胞1.5 mL，于2 mL離心管中，13 000 r/min離心30 s，棄上清收集細胞，用Z緩沖液1 mL懸浮，加入氯仿50 μL和0.1% SDS Z緩沖液15 μL，混勻，于37 ℃放置15 min后，再加入鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷 (ONPG )200 μL(4 mg/mL，Z緩沖液配制)，于37 ℃ 30 min內顯色，記錄顯色時間，用1 mol/L Na2CO3 0.5 mL中止，13 000 r/min離心30 s，取上清200 μL于透明酶標板內(3個復孔)，用多功能酶標儀測OD405光密度。
同時將受試物作用的W303-1A/TR-yTeton-Lac Z混勻，取100 μL于透明酶標板內(做3個復孔)，于600 nm測細胞密度(OD600)，用OD405/OD600比值表示重組酵母細胞表達的β-半乳糖苷酶活性。
1.5.2 特異性研究
用以下非四環素類藥物對W303-1A/TR-yTeton-Lac Z重組酵母細胞進行特異性研究：利福平、氯霉素和卡那霉素。劑量設計和方法同上述四環素類藥物。
1.6 資料的分析與處理
用Excel統計軟件分別計算酶活性的均數±標準差(x±s)。在進行劑量效應分析時，為消除時間、細胞數量不同對β-半乳糖苷酶活性的影響，用試驗組與空白對照組所誘導的酶活性之比即誘導倍數，進行統計制圖分析。
2 結果
2.1 pGPD-V5-TR酵母表達載體
TR基因全長663 bp，如果TR插入pGDPV5的相應酶切位點之間，經用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后，應產生663 bp和4 850 bp兩條帶。由圖 5可見，電泳分析發現1、5號克隆與對照明顯不同。對1號克隆測序發現TR閱讀框正確，并與V5相融合(資料省略)。
圖5
pGPD-V5-TR轉化子質粒的酶切電泳鑒定
1~7：不同轉化子質粒；對照:pGDPV5
Figure5. Enzyme digestion forpGPD-V5-TR transformant plasmid1-7 band：the plasmids for different transformant; control: pGDPV5
2.2 TRE調控的Lac Z酵母報告載體
CYC1酵母基本啟動子為280 bp，當TRE插入到Pst Ⅰ和SphⅠ之間時，就會取代120 bp的CYC1啟動子序列，這樣pTeton-Lac Z-1轉化子質粒用的EcoR Ⅰ與Pst Ⅰ雙切后，應產生160 bp和8 000 bp的兩條帶，而對照應產生280 bp和8 000 bp兩條帶。由圖 6可見，酶切產物經用2.0%瓊脂糖電泳分析，發現1、2和3號克隆陽性，并經測序發現TRE序列正確插入到Pst Ⅰ和Sph Ⅰ之間(資料省略)。
圖6
pTeton-Lac Z-1轉化子質粒的酶切電泳鑒定
1~5：不同轉化子質粒；對照：pMP206
Figure6. Enzyme digestion for pTeton-Lac Z-1 transformant plasmid1-5 band： the plasmids for different transformant; control： pMP206
在pMP206載體上，有3個Nde Ⅰ酶切位點，分別位于CYC1啟動子的α-TATA框的上游、Lac Z報告基因的下游及Ura選擇性標志的下游。如果α-TATA框上游的CYC1啟動子插入到pTeton-LacZ-1載體，用Nde Ⅰ酶切后應產生3條帶，分別為1 181 bp(4 401－3 220) 、 3 946 bp(8 347－4 401) 和3 220 bp，所以，由圖 7可見，1、2、3、6號pTeton-Lac Z轉化子克隆質粒鑒定為陽性。對1號克隆測序證實pTeton-Lac Z構建成功(資料省略)。
圖7
pTeton-Lac Z轉化子質粒的Nde Ⅰ酶切電泳鑒定
1~10：不同轉化子質粒；M：DNA marker
Figure7. Nde Ⅰ digestion for pyTeton-Lac Z transformant plasmid1-10 band： the plasmids for different transformant; M： DNA marker
TRE含有Bgl Ⅱ唯一酶切點，用Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切后應產生2條帶，分別為約300 bp和8 000 bp(見圖 8)，可見1和3號克隆為陽性。對1號克隆測序發現TRE已正確插入CYC1啟動子和Lac Z報告基因之間(資料省略)，命名為pyTeton-LacZ。
圖8
Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ對pyTeton-LacZ轉化子質粒的酶切電泳鑒定
1~9:不同轉化子質粒；對照：pMP206
Figure8. Bgl Ⅱ and Hind Ⅲ double digestion for pyTeton-Lac Z transformant plasmid1-9 band： the plasmids for different transformant; control: pMP206
2.3 GPD驅動TR在酵母中的表達
tetR分子量為22 kD。圖 9為對tetR在酵母細胞中表達的Western blot分析，可見經PCR鑒定的陽性克隆，均見有一特異性條帶，提示tetR在酵母細胞中成功表達。
圖9
W303-1A/TR酵母細胞提取蛋白的Western blot分析
1~6：PCR鑒定陽性的W303-1A/TR酵母細胞克隆
Figure9. Western blot analysis of protein from W303-1A/TR yeast extract1-6 band: the positive clones of W303-1A/TR by Western blot
2.4 重組酵母細胞的實驗研究
由圖 10可見，W303-1A/TR-yTeton-Lac Z重組酵母細胞與土霉素的劑量效應關系最明顯，在1.6 μg/mL以上濃度時，β-半乳糖苷酶活性開始增加，在25 μg/mL時達高峰，以后由于對細胞毒性的增加，酶活性受到抑制；四環素亦與重組酵母細胞呈現劑量效應關系，但在6.25 μg/mL時酶活性達高峰，細胞毒性亦較強，在12.5 μg/mL以上濃度組，呈現酶活性低于對照組的現象；多西環素(強力霉素)在12.5 μg/mL以上濃度組時，酶活性開始有所增加，25 μg/mL時達高峰，以后因細胞毒性酶活性受到抑制，但仍高于對照組。
圖10
W303-1A/TR-yTeton-Lac Z與四環素類抗生素的劑量效應關系分析
Figure10.
Analysis of dose-effect relationships between W303-1A/TR-yTeton-Lac Z and tetracycline antibiotics
由圖 11可見，W303-1A/TR-yTeton-Lac Z與非四環素類抗生素(利福平、氯霉素和卡那霉素)之間無劑量效應關系，劑量效應曲線呈隨機波動，說明該重組酵母細胞的特異性較高。
圖11
W303-1A/TR-yTeton-Lac Z與非四環素類抗生素的劑量效應關系分析
Figure11.
Analysis of dose-effect relationships between W303-1A/TR-yTeton-Lac Z and non-tetracycline antibiotics
3 討論
研究四環素類抗生素對土壤環境的污染程度，常用的檢測方法是免疫分析法、高效液相色譜法、氣相色譜法和色/質聯用分析法等[8-10]，但這些方法對檢測操作人員要求高，需經過專門培訓，需要比較精密的檢測儀器，對待測樣品的純度要求較高，而且成本較高，受檢測場地等因素的限制，不便于攜帶，使用時會受到一定程度的限制，因此，不適用于經常性的、常規的環境監測。
Tet-on/off系統具有高效、特異、低毒和能嚴密開關目的基因的特點，具有良好的調控基因表達效果。國外有研究者用大腸桿菌作為宿主細胞，用細菌熒光素酶作用報告基因，將Tet-on/off這一調控系統轉染于大腸桿菌,用于監測環境中的四環素類抗生素的污染[11]。但是，原核細胞對抗生素的抵抗力差，而且，細菌熒光素酶底物較貴，測定時需要較為昂貴的儀器，所以在實際應用時會有許多不便。酵母是最簡單的真核細胞，對多數抗生素有較強的抵抗力，其生長條件又與原核細胞相似，因此，用酵母作為宿主細胞構建四環素類藥物傳感器是理想的選擇。所用的報告基因為Lac Z基因，是目前最常用的報告基因，其轉錄后翻譯產物β-半乳糖苷酶可分解底物鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷，生成半乳糖和黃色的鄰-硝基苯酚，因此可以通過顏色的變化測知β-半乳糖苷酶的活性。由于β-半乳糖苷酶的活性測定所需設備為常見的光電比色儀，加之成本不高及操作也相對簡單，所以Lac Z基因成為目前分子生物學技術中最常見的報告基因。
由于TRE只有53 bp，酶切鑒定其正確插入較為困難，但可利用其存在的特異酶切位點或通過插入后造成的某種酶切位點間的DNA大小變化進行酶切鑒定。在用Tet-on/off這一系統調控下游報告基因的表達時，四環素反應元件TRE插入的位點非常重要，最好將其置于啟動子與報告基因之間，這樣tetR與其結合后，可以有效地阻遏下游基因的轉錄表達，這是因為TRE不是增強子，對下游基因沒有順式調控效果。CYC1啟動子是酵母基本啟動子。當將TRE插入到TATA之間時，下游的α-TATA框仍然可以有效地發揮啟動效果，這是重組酵母細胞(W303-1A/Teton-Lac Z)為何無明顯劑量效應的原因。
