通過超聲造影時間信號曲線獲得人肺腺癌異位移植瘤血流灌注參數, 進一步探究腫瘤不同生長時間微血管生成特點。本文選取21只裸鼠, 建立人肺腺癌異位移植瘤模型, 于7d、14 d及28 d進行超聲造影(CEUS), 獲得腫瘤血流灌注圖像及時間信號參數, 包括上升時間(RT)、峰值強度(PI)和曲線下面積(AUC)。CD34免疫組化染色獲得腫瘤微血管密度(MVD)。實驗結果顯示, 7 d、14 d及28 d的PI與AUC逐漸降低(P < 0.05)。RT隨著腫瘤生長時間延長逐漸增高(P < 0.05)。在有壞死的腫瘤中, 非壞死區域的PI、AUC比壞死區域大(P < 0.05)。CD34染色發現壞死腫瘤的MVD較無壞死腫瘤低[(7.50±3.44)條vs. (12.44±5.74)條, P=0.034]。MVD與PI呈正相關(r=0.668, P=0.008)。本文研究結果表明, 超聲造影對人肺腺癌異位移植瘤血流灌注研究具有一定價值。時間信號曲線的PI、AUC及RT可以反映腫瘤的微血管生成情況。
引用本文： 許華燕, 莊華, 楊志剛, 李媛, 師軻. 超聲造影時間信號強度曲線對人肺腺癌裸鼠異位移植瘤微血管生成特點的定量研究. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(2): 332-336. doi: 10.7507/1001-5515.20160056 復制
引言
肺癌是全球發病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年上升趨勢。近年來，肺癌的診療水平有較大提高，但以外科手術為主的多學科綜合治療效果仍不理想，肺癌總的5年生存率仍然很低。隨著腫瘤分子生物學及細胞生物學的發展，肺癌靶向治療特別是以血管生成為靶點的血管靶向治療發展迅速。對于血管靶向治療的療效，即治療前后血管生成的變化，目前國內外仍然缺乏有效的評價手段。因此，借助生物建模等研究手段探索和建立更為有效的檢查方法和檢測指標，了解靶向治療前后腫瘤血管生成情況的變化，對腫瘤靶向治療的療效評價具有重要意義。超聲造影(contrast enhanced ultrasonography，CEUS)是一種理想的實質組織微循環血流灌注定量技術，與計算機斷層掃描(computed tomography，CT)及磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技術比較，具有無創、無輻射、可多次重復、實時成像等顯著優點，已被運用于多種器官及腫瘤組織的微循環血流灌注研究[1]。
本研究采用超聲造影系統獲得人肺腺癌異位移植瘤血流灌注圖像，通過圖像后處理獲得超聲造影時間信號曲線及灌注參數，以了解肺癌治療前不同時間點的微血管生長及演變趨勢。
1 材料與方法
1.1 人肺腺癌裸鼠異位移植瘤模型建立
選用4周齡、15～20 g重BALB/C裸鼠作為載體，將人肺腺癌A549細胞懸液按接種量5×106個細胞/只注入裸鼠背部皮下，鼓起皮丘為接種成功。最終接種成功瘤鼠21只，每兩天觀察一次腫瘤生長情況。接種成功后的瘤鼠平均分為3組，分別于3個不同時間點即7 d、14 d及28 d進行超聲造影檢查。
1.2 超聲造影檢查
使用Philips iU22 unit (Philips，Bothell，WA，USA)超聲系統，首先常規定位腫瘤并觀察腫瘤的形態及大小；將粉末狀管腔內造影劑(Tianxia，HuZhou，China)用0.9%生理鹽水按照1 000:50比例進行稀釋，以2.5 μL/g從鼠尾靜脈在2～4 s內注入造影劑，同時通過超聲探頭采集人肺腺癌異位移植瘤血流灌注動態圖像。
1.3 免疫組化染色及微血管密度計數方法
進行超聲造影檢查后，取腫瘤組織進行CD34免疫組化染色。在光學顯微鏡(100×)下觀察每張組織切片，并人工計數腫瘤的微血管密度(Microvessel density，MVD)。MVD計數參照Weidnerd等計數方法，以染成棕黃色的內細胞簇或單個內皮細胞作為一根可計數血管，位置不同的血管內皮細胞均作為獨立血管進行計數；與鄰近微血管、腫瘤細胞或其他結締組織成分不相連、標記為棕黃色的內皮細胞或內皮細胞簇均作為1根可計數血管。每張切片在光鏡(100×)下尋找MVD最高的區域，即為熱點，然后在光學顯微鏡(200×)下對熱點進行血管計數，記錄6個視野內的微血管數，計算平均數值，取平均值作為該例標本的MVD數值[2-3]。
1.4 超聲造影圖像分析
采用離線軟件Q lab(Philips medical system，Bothell，WA，USA)對不同時間點的肺癌血流灌注圖像進行分析，選取腫瘤區域勾畫感興趣區，避開瘤鼠自身組織，采用y(t)=A×(t-t0)×exp(-alpha×(t-t0))+C進行曲線擬合，擬合過程中同時對運動干擾進行校正，最后軟件自動計算時間信號曲線如圖 1所示，得到血流灌注參數包括上升時間(Rise time，RT)、峰值強度(Peak intensity，PI)、曲線下面積(Area under the curve，AUC)。接下來，采用同樣的擬合曲線，在灌注圖片上同時勾畫壞死區域及非壞死區域兩個感興趣區，獲得壞死與非壞死區域灌注參數，其中壞死區域定義為超聲造影圖像上呈灌注缺損的區域[4]。
圖1
人肺腺癌異位移植瘤CEUS圖像及其時間信號曲線
Figure1.
CEUS of lung adenocarcinoma xenograft in nude mouse
1.5 統計分析
所有測量值以均數±標準差(
2 結果
2.1 不同時間點超聲造影及MVD結果
所有瘤鼠均成功進行超聲造影檢查。通過后處理軟件獲得所有腫瘤超聲灌注時間信號曲線及其參數，如表 1所示。14 d及28 d組腫瘤組織內出現不同程度壞死。不同時間組腫瘤的灌注參數均存在統計學差異(P < 0.05)。7 d組腫瘤的AUC和PI最高[分別為(1 011.39±125.15) dBs和(18.94±7.50) dB]。隨著腫瘤生長，瘤體發生不同程度壞死，14 d及28 d組的AUC [(955.52±368.72) dBs vs. (315.00±178.53) dBs，P=0.003]及PI [(15.26±3.90) dB vs. (10.94±3.65) dB，P=0.008]值逐漸降低。隨著腫瘤生長，其RT逐漸延長(P < 0.05)。CD34免疫組化染色可顯示腫瘤不同時間點的微血管生成情況如圖 2所示，并獲得不同時期腫瘤的MVD。MVD結果顯示，28 d組的MVD最小，而7d組MVD最大(P < 0.05)，如表 1所示。
表1
人肺腺癌異位移植瘤不同時間點CEUS時間信號曲線參數及MVD結果
Table1.
Time-intensity curve parameters of CEUS and MVD of lung adenocarcinoma xenograft model.
圖2
7 d組、14 d組及28 d組CD34免疫組化染色(200×)。箭頭：腫瘤內血管
Figure2.
CD34 immunohistochemisty stain for MVD. Arrow shows the microvessels of tumor
2.2 壞死區域與非壞死區域超聲造影結果比較
在壞死的腫瘤中，肉眼觀察非壞死區域的超聲顯影信號較強，而壞死區域成灌注缺損；兩個區域時間信號曲線比較發現，壞死區域的時間信號曲線比非壞死區域低，如圖 3所示。時間信號參數顯示非壞死部分的AUC[(328.19±182.45) dBs vs.(172.13±114.63) dBs，P=0.039]及PI[(17.08±3.38) dB vs. (11.03±6.55) dB，P=0.029]值高于壞死部分。通過計數腫瘤的MVD發現，CD34染色發現壞死腫瘤的MVD較非壞死腫瘤低[(7.50±3.44)條vs.(12.44±5.74)條，P=0.034]。
圖3
壞死腫瘤的超聲灌注成像。紅色：壞死區域；黃色：非壞死區域
Figure3.
Contrast enhanced ultrasonography of lung adenocarcinoma xenograft nude mouse with necrosis. Red:necrotic part; Yellow:Non-necrotic part
2.3 腫瘤MVD與PI值得相關性分析
Pearson積矩相關性分析顯示腫瘤的MVD與PI成正相關(r=0.668，P=0.008)，如圖 4所示。
圖4
MVD與PI Pearson積矩相關性分析
Figure4.
Pearson correlation between MVD and PI
3 討論
超聲造影運用微泡造影劑進行組織顯像，可通過測定組織的信號強度直接反應其微血管灌注量，是測定腫瘤微血管灌注程度常用方法。超聲后處理軟件通過邏輯算法獲得時間信號曲線，可反應組織的微血管灌注狀態。時間信號曲線參數包括PI、RT及AUC[5]。PI為腫瘤顯影最明顯時的信號強度，可由腫瘤血管床中的微泡總量反應。RT指從腫瘤開始顯影到顯影達最大值所需時間。AUC是時間信號曲線下的面積[6]。
肺癌是一種富血供惡性腫瘤。有研究表明，惡性腫瘤的生長、侵襲性及轉移與腫瘤血管生成密切相關。雖然肺癌的診斷多依賴CT檢查，但是超聲對于靠近胸膜的周圍型肺癌及合并肺不張的中央型肺癌具有良好的診斷價值[4, 7-8]。與常規的CT檢查相比，超聲造影是一種無輻射、可重復性強、能實時顯像的輔助檢查技術，且超聲造影劑不進入組織間隙，能較好反應腫瘤的微血管生長情況，已廣泛運用于胃腸道、肝臟、乳腺及甲狀腺腫瘤等惡性腫瘤的科研及臨床診斷[9-13]。本研究采用超聲造影技術探究不同時間點人肺腺癌裸鼠異位移植瘤微血管灌注情況，從而獲得人肺腺癌裸鼠異位移植瘤中微血管隨時間的生長趨勢，為臨床抗血管藥物治療提供前期研究基礎。本研究發現7d組人肺腺癌裸鼠異位移植瘤的PI及AUC最大，隨著腫瘤的生長及壞死，14 d及28 d組腫瘤的PI和AUC逐漸降低，而RT呈逐漸延長趨勢。在有壞死的腫瘤中，肉眼觀察，非壞死區域的超聲顯影信號較強，根據量化結果表明壞死區域的PI和AUC均低于非壞死區域。本研究結果可表明早期人肺腺癌裸鼠異位移植瘤的微血管灌注較晚期強，也間接反映腫瘤的早期微血管生成情況較好。反映微血管密度的CD34染色發現早期腫瘤的MVD比晚期腫瘤豐富，壞死區域的MVD明顯低于非壞死區域，且7 d組、14 d組、28 d組的MVD逐漸降低。Pearson積矩相關顯示MVD與PI成正相關，即PI越大腫瘤MVD越高。CD34免疫組化染色是反映微血管生成的“金標準”，有研究表明CD34染色所得MVD與超聲造影參數成正相關，并證明超聲造影時間信號曲線的PI可以間接反映微血管生成情況[14]，這與本研究結果相似。由于CD34測定MVD不能多次反復進行，且為有創檢查，其在多個時間進行腫瘤血管生成監測及血管靶向藥物療效的評估存在一定限制，而超聲造影可較好地彌補這一不足，因而對于檢測腫瘤不同生長時期腫瘤血管生成以及血管靶向藥物療效的實時評估有極大的優勢。
綜上所述，超聲造影對人肺腺癌微血管灌注特點的研究具有一定價值。超聲灌注參數可以一定程度上反應腫瘤血管生成情況，早期腫瘤的微血管生成較晚期腫瘤好。雖然本實驗只是對人肺腺癌異位移植瘤3個時間點的血管生成情況進行監測，但由此獲得的人肺腺癌異位移植瘤血管生長趨勢，可為臨床抗血管靶向藥物治療肺腺癌提供一定指導作用。隨著超聲造影在肺癌領域的逐步運用，臨床上可運用超聲造影對肺癌患者血管生成情況進行檢測，并使抗血管生成靶向藥物療效的實時評價成為可能。
引言
肺癌是全球發病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年上升趨勢。近年來，肺癌的診療水平有較大提高，但以外科手術為主的多學科綜合治療效果仍不理想，肺癌總的5年生存率仍然很低。隨著腫瘤分子生物學及細胞生物學的發展，肺癌靶向治療特別是以血管生成為靶點的血管靶向治療發展迅速。對于血管靶向治療的療效，即治療前后血管生成的變化，目前國內外仍然缺乏有效的評價手段。因此，借助生物建模等研究手段探索和建立更為有效的檢查方法和檢測指標，了解靶向治療前后腫瘤血管生成情況的變化，對腫瘤靶向治療的療效評價具有重要意義。超聲造影(contrast enhanced ultrasonography，CEUS)是一種理想的實質組織微循環血流灌注定量技術，與計算機斷層掃描(computed tomography，CT)及磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技術比較，具有無創、無輻射、可多次重復、實時成像等顯著優點，已被運用于多種器官及腫瘤組織的微循環血流灌注研究[1]。
本研究采用超聲造影系統獲得人肺腺癌異位移植瘤血流灌注圖像，通過圖像后處理獲得超聲造影時間信號曲線及灌注參數，以了解肺癌治療前不同時間點的微血管生長及演變趨勢。
1 材料與方法
1.1 人肺腺癌裸鼠異位移植瘤模型建立
選用4周齡、15～20 g重BALB/C裸鼠作為載體，將人肺腺癌A549細胞懸液按接種量5×106個細胞/只注入裸鼠背部皮下，鼓起皮丘為接種成功。最終接種成功瘤鼠21只，每兩天觀察一次腫瘤生長情況。接種成功后的瘤鼠平均分為3組，分別于3個不同時間點即7 d、14 d及28 d進行超聲造影檢查。
1.2 超聲造影檢查
使用Philips iU22 unit (Philips，Bothell，WA，USA)超聲系統，首先常規定位腫瘤并觀察腫瘤的形態及大小；將粉末狀管腔內造影劑(Tianxia，HuZhou，China)用0.9%生理鹽水按照1 000:50比例進行稀釋，以2.5 μL/g從鼠尾靜脈在2～4 s內注入造影劑，同時通過超聲探頭采集人肺腺癌異位移植瘤血流灌注動態圖像。
1.3 免疫組化染色及微血管密度計數方法
進行超聲造影檢查后，取腫瘤組織進行CD34免疫組化染色。在光學顯微鏡(100×)下觀察每張組織切片，并人工計數腫瘤的微血管密度(Microvessel density，MVD)。MVD計數參照Weidnerd等計數方法，以染成棕黃色的內細胞簇或單個內皮細胞作為一根可計數血管，位置不同的血管內皮細胞均作為獨立血管進行計數；與鄰近微血管、腫瘤細胞或其他結締組織成分不相連、標記為棕黃色的內皮細胞或內皮細胞簇均作為1根可計數血管。每張切片在光鏡(100×)下尋找MVD最高的區域，即為熱點，然后在光學顯微鏡(200×)下對熱點進行血管計數，記錄6個視野內的微血管數，計算平均數值，取平均值作為該例標本的MVD數值[2-3]。
1.4 超聲造影圖像分析
采用離線軟件Q lab(Philips medical system，Bothell，WA，USA)對不同時間點的肺癌血流灌注圖像進行分析，選取腫瘤區域勾畫感興趣區，避開瘤鼠自身組織，采用y(t)=A×(t-t0)×exp(-alpha×(t-t0))+C進行曲線擬合，擬合過程中同時對運動干擾進行校正，最后軟件自動計算時間信號曲線如圖 1所示，得到血流灌注參數包括上升時間(Rise time，RT)、峰值強度(Peak intensity，PI)、曲線下面積(Area under the curve，AUC)。接下來，采用同樣的擬合曲線，在灌注圖片上同時勾畫壞死區域及非壞死區域兩個感興趣區，獲得壞死與非壞死區域灌注參數，其中壞死區域定義為超聲造影圖像上呈灌注缺損的區域[4]。
圖1
人肺腺癌異位移植瘤CEUS圖像及其時間信號曲線
Figure1.
CEUS of lung adenocarcinoma xenograft in nude mouse
1.5 統計分析
所有測量值以均數±標準差(
2 結果
2.1 不同時間點超聲造影及MVD結果
所有瘤鼠均成功進行超聲造影檢查。通過后處理軟件獲得所有腫瘤超聲灌注時間信號曲線及其參數，如表 1所示。14 d及28 d組腫瘤組織內出現不同程度壞死。不同時間組腫瘤的灌注參數均存在統計學差異(P < 0.05)。7 d組腫瘤的AUC和PI最高[分別為(1 011.39±125.15) dBs和(18.94±7.50) dB]。隨著腫瘤生長，瘤體發生不同程度壞死，14 d及28 d組的AUC [(955.52±368.72) dBs vs. (315.00±178.53) dBs，P=0.003]及PI [(15.26±3.90) dB vs. (10.94±3.65) dB，P=0.008]值逐漸降低。隨著腫瘤生長，其RT逐漸延長(P < 0.05)。CD34免疫組化染色可顯示腫瘤不同時間點的微血管生成情況如圖 2所示，并獲得不同時期腫瘤的MVD。MVD結果顯示，28 d組的MVD最小，而7d組MVD最大(P < 0.05)，如表 1所示。
表1
人肺腺癌異位移植瘤不同時間點CEUS時間信號曲線參數及MVD結果
Table1.
Time-intensity curve parameters of CEUS and MVD of lung adenocarcinoma xenograft model.
圖2
7 d組、14 d組及28 d組CD34免疫組化染色(200×)。箭頭：腫瘤內血管
Figure2.
CD34 immunohistochemisty stain for MVD. Arrow shows the microvessels of tumor
2.2 壞死區域與非壞死區域超聲造影結果比較
在壞死的腫瘤中，肉眼觀察非壞死區域的超聲顯影信號較強，而壞死區域成灌注缺損；兩個區域時間信號曲線比較發現，壞死區域的時間信號曲線比非壞死區域低，如圖 3所示。時間信號參數顯示非壞死部分的AUC[(328.19±182.45) dBs vs.(172.13±114.63) dBs，P=0.039]及PI[(17.08±3.38) dB vs. (11.03±6.55) dB，P=0.029]值高于壞死部分。通過計數腫瘤的MVD發現，CD34染色發現壞死腫瘤的MVD較非壞死腫瘤低[(7.50±3.44)條vs.(12.44±5.74)條，P=0.034]。
圖3
壞死腫瘤的超聲灌注成像。紅色：壞死區域；黃色：非壞死區域
Figure3.
Contrast enhanced ultrasonography of lung adenocarcinoma xenograft nude mouse with necrosis. Red:necrotic part; Yellow:Non-necrotic part
2.3 腫瘤MVD與PI值得相關性分析
Pearson積矩相關性分析顯示腫瘤的MVD與PI成正相關(r=0.668，P=0.008)，如圖 4所示。
圖4
MVD與PI Pearson積矩相關性分析
Figure4.
Pearson correlation between MVD and PI
3 討論
超聲造影運用微泡造影劑進行組織顯像，可通過測定組織的信號強度直接反應其微血管灌注量，是測定腫瘤微血管灌注程度常用方法。超聲后處理軟件通過邏輯算法獲得時間信號曲線，可反應組織的微血管灌注狀態。時間信號曲線參數包括PI、RT及AUC[5]。PI為腫瘤顯影最明顯時的信號強度，可由腫瘤血管床中的微泡總量反應。RT指從腫瘤開始顯影到顯影達最大值所需時間。AUC是時間信號曲線下的面積[6]。
肺癌是一種富血供惡性腫瘤。有研究表明，惡性腫瘤的生長、侵襲性及轉移與腫瘤血管生成密切相關。雖然肺癌的診斷多依賴CT檢查，但是超聲對于靠近胸膜的周圍型肺癌及合并肺不張的中央型肺癌具有良好的診斷價值[4, 7-8]。與常規的CT檢查相比，超聲造影是一種無輻射、可重復性強、能實時顯像的輔助檢查技術，且超聲造影劑不進入組織間隙，能較好反應腫瘤的微血管生長情況，已廣泛運用于胃腸道、肝臟、乳腺及甲狀腺腫瘤等惡性腫瘤的科研及臨床診斷[9-13]。本研究采用超聲造影技術探究不同時間點人肺腺癌裸鼠異位移植瘤微血管灌注情況，從而獲得人肺腺癌裸鼠異位移植瘤中微血管隨時間的生長趨勢，為臨床抗血管藥物治療提供前期研究基礎。本研究發現7d組人肺腺癌裸鼠異位移植瘤的PI及AUC最大，隨著腫瘤的生長及壞死，14 d及28 d組腫瘤的PI和AUC逐漸降低，而RT呈逐漸延長趨勢。在有壞死的腫瘤中，肉眼觀察，非壞死區域的超聲顯影信號較強，根據量化結果表明壞死區域的PI和AUC均低于非壞死區域。本研究結果可表明早期人肺腺癌裸鼠異位移植瘤的微血管灌注較晚期強，也間接反映腫瘤的早期微血管生成情況較好。反映微血管密度的CD34染色發現早期腫瘤的MVD比晚期腫瘤豐富，壞死區域的MVD明顯低于非壞死區域，且7 d組、14 d組、28 d組的MVD逐漸降低。Pearson積矩相關顯示MVD與PI成正相關，即PI越大腫瘤MVD越高。CD34免疫組化染色是反映微血管生成的“金標準”，有研究表明CD34染色所得MVD與超聲造影參數成正相關，并證明超聲造影時間信號曲線的PI可以間接反映微血管生成情況[14]，這與本研究結果相似。由于CD34測定MVD不能多次反復進行，且為有創檢查，其在多個時間進行腫瘤血管生成監測及血管靶向藥物療效的評估存在一定限制，而超聲造影可較好地彌補這一不足，因而對于檢測腫瘤不同生長時期腫瘤血管生成以及血管靶向藥物療效的實時評估有極大的優勢。
綜上所述，超聲造影對人肺腺癌微血管灌注特點的研究具有一定價值。超聲灌注參數可以一定程度上反應腫瘤血管生成情況，早期腫瘤的微血管生成較晚期腫瘤好。雖然本實驗只是對人肺腺癌異位移植瘤3個時間點的血管生成情況進行監測，但由此獲得的人肺腺癌異位移植瘤血管生長趨勢，可為臨床抗血管靶向藥物治療肺腺癌提供一定指導作用。隨著超聲造影在肺癌領域的逐步運用，臨床上可運用超聲造影對肺癌患者血管生成情況進行檢測，并使抗血管生成靶向藥物療效的實時評價成為可能。
