心臟死亡供肝的質量與保存期間的能量代謝密切相關。體外機械灌注技術為心臟死亡供肝持續提供氧氣和營養物質，排出代謝廢物，有望改善器官保存質量，修復供肝缺血損傷，具有廣闊的應用前景。本文綜述了機械灌注技術在心臟死亡供肝保存及修復中的核心問題，以期為推進心臟死亡供肝移植的安全、廣泛應用提供參考依據。
引用本文： 向俊西, 鄭幸龍, 劉鵬, 董鼎輝, 劉學民, 呂毅. 機械灌注法在心臟死亡供肝保存及修復中的核心問題. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(1): 167-170. doi: 10.7507/1001-5515.20160030 復制
引言
中國是肝病高發國家，根據《2013中國衛生統計年鑒》和《中國腫瘤登記年報》，病毒性肝炎年新發病數137萬，居甲乙類傳染病首位；肝癌年新發病例為35.5萬，年死亡率高達26.26/10萬，居惡性腫瘤第二位；每年用于肝病的醫療保健費用數以百億元計，成為影響國民健康、經濟、社會發展的嚴重問題。
肝臟移植目前仍是針對終末期肝病最有效的治療手段，但受到供體嚴重缺乏的制約，大量患者在等待肝源的過程中死亡或喪失移植機會。拓展肝源供給成為肝移植臨床和基礎研究的熱點和難點。其中，心臟死亡器官捐獻(donation after cardiac death，DCD)是解決供肝嚴重短缺的有效途徑之一[1]。我國自2010年3月開展DCD器官捐獻工作以來，取得了豐富的成果和經驗，極大促進了移植事業的發展。然而，DCD供肝具有熱缺血時間長、不可控因素多、術后并發癥率高等特點。研究表明，不良事件的發生與供肝缺血期間氧和營養供應中斷、代謝產物堆積、現行低溫保存技術導致肝細胞能量代謝障礙等關系密切[2-3]。
體外機械灌注技術(ex vivo mechanical perfusion，EVMP)的發明為DCD來源供肝的保存和功能修復提供了新的思路。這一技術能為肝臟持續提供氧氣和營養物質，排出代謝廢物，有望改善器官保存期間的能量代謝狀態，一定程度上可修復DCD供肝缺血損傷，減少肝移植術后并發癥[4]。目前這一技術發展迅猛，但仍存在諸多懸而未決的爭議。本文對機械灌注法應用于DCD供肝保存的現狀及核心問題進行綜述，以期為進一步研究提供參考。
1 DCD供肝移植的特點和困境
國際通用的荷蘭Maastricht分類標準將DCD供體分為可控(M-Ⅲ)和不可控(M-Ⅰ、M-Ⅱ、M-Ⅳ、M-Ⅴ)兩大類型，其中可控型是指受到嚴重不可逆性損傷，但還未達到腦死亡的全套醫學標準，經家屬同意，有計劃地撤除生命支持，等待死亡發生。《中國心臟死亡器官捐獻工作指南》[5]將器官捐獻分為3類：C-Ⅰ即國際標準化腦死亡器官捐獻(donation after brain death，DBD)；C-Ⅱ即國際標準化DCD，包括M-Ⅰ～M-Ⅴ；C-Ⅲ即心腦雙死亡器官捐獻(donation after brain and cardiac death，DBCD)，指雖已符合DBD標準，但鑒于腦死亡立法缺失，現仍按DCD程序實施。新的觀點認為，熱缺血時間應從出現臨床低血壓而非心臟停跳開始計算[6]。由此可見，任何一種DCD供肝類型都很可能面臨熱缺血時間較長的問題，尤其是經過心肺復蘇的或不可控型DCD供體，將經歷較長時間的低血壓打擊，嚴重損傷供肝功能。
研究表明，熱缺血時間及冷保存時間對DCD供肝質量及受體預后有重要影響。氧和營養物質來源的中斷以及代謝產物的堆積可能是導致熱缺血損傷最重要的因素，其必然結果是細胞的能量代謝障礙，肝組織三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)嚴重減少甚至耗竭，腺嘌呤核苷酸總量劇減，進一步引起氧自由基生成、細胞內鈣超載、細胞和細胞器功能出現紊亂、細胞凋亡[7]。目前普遍認為肝臟耐受熱缺血時間的上Ⅰ限為30 min，冷保存時間上限為12 h，超過此時限則可能導致原發性移植肝無功能、膽道缺血性損傷等并發癥發生率顯著增高[8]。
各國學者分別從供體預處理[9](涉及倫理問題)、改良供肝切取手術技術(無法避免低血壓期損傷)、優化器官保存方法[10]、受體藥物干預(影響機體其他系統功能)等方面努力嘗試提高DCD供肝質量，縮短熱/冷缺血時間，延長肝臟耐受缺血時限，以期改善DCD供肝移植效果。其中，優化器官保存方法因其適用性廣、可行性強、效果顯著等優點，成為最具應用前景的突破點。
2 體外持續機械灌注技術優化供肝保存效果
低溫(4 ℃)靜態保存是目前國際普遍采用的供肝保存方式。一般認為低溫能夠有效降低肝細胞新陳代謝及異化作用對肝臟離體保存的影響，溫度每下降10 ℃，代謝速率降低至原來的25%~35%[11]，從而減少ATP消耗及后續的肝細胞損傷。然而，即使在1 ℃的情況下仍然存在不可忽視的代謝活動，有研究表明，兔肝在冷保存6 h后ATP含量下降了84%[12]，雖然低溫不引起肝細胞組織學明顯改變，但可導致肝竇內皮細胞凋亡、Kupffer細胞活化、細胞內鈣超載等一系列病理變化，靜態保存亦會導致代謝產物蓄積，進一步損傷肝臟功能。
近年來體外持續機械灌注技術重新獲得廣泛的重視，機械灌注保存與靜態冷保存相比的主要優點體現在：①能持續給肝細胞提供維持代謝的能量底物(糖、氨基酸、核苷酸和氧等)，避免肝內ATP耗盡及其引起的損傷性瀑布效應[13]；②同時持續排出毒性代謝產物，阻斷生物降解的過程[14]；③具有更好的微循環灌注和保護效果；④便于即時監測肝臟活性及功能[15]。
灌注溫度(常溫、亞低溫、低溫)、灌注液的成分以及氧合途徑(稀釋血液、無血灌注液)是體外持續機械灌注技術的核心問題，但是目前均尚未得到解決，尤其是其針對DCD供肝的適用性和安全范圍尚不清楚。
機械灌注保存技術目前巨大的爭議之一在于灌注溫度選擇：包括低溫(4 ℃)、亞低溫(15~20 ℃)、常溫(37 ℃)，各種方式均有相應的理論和實驗證據證明其優勢。Guarrera等[16]于2010年報道了第一例低溫機械灌注保存的臨床試驗，將20例接受低溫機械灌注保存肝臟移植的病例與單純低溫保存肝臟移植病例進行對比，結果顯示低溫機械灌注保存組住院時間更短，血管并發癥、膽道并發癥和原發性移植物無功能發生率更低。目前已經上市的肝臟機械灌注保存產品多采用低溫灌注保存。Bruinsma等[17]的實驗則論證了亞低溫機械灌注對肝臟保存效果的優越性。與此同時，也有大量研究支持常溫機械灌注能更好地保存和修復肝臟功能，延長熱缺血耐受時限，減少并發癥的發生[18-20]。采用低溫保存除具有前述不足之外，還可能損傷細胞膜脂質雙分子層和細胞骨架，使離子交換泵失活引起細胞裂解，收縮微循環導致灌注不完全，故更傾向于采用常溫機械灌注的方式來保存及修復DCD供體肝臟。因此，進一步闡明常溫機械灌注技術修復DCD供肝缺血性損傷的機制，論證無血常溫灌注優化供肝保存的效果，對于促進DCD供肝的臨床應用和改善移植患者預后具有重要的意義。
3 開發適用于DCD供肝機械灌注保存液的必要性
3.1 器官保存液的研究現狀及瓶頸問題
器官保存液主要用于離體器官的功能保護，其基本原理包括：合適的滲透壓防止低溫引起的細胞水腫；緩沖體系糾正細胞內酸中毒；減少缺血-再灌注損傷；促進保存期間能量的產生。因此，器官保存液的成分選擇、滲透壓控制、離子濃度調配、氧合、能量底物等是當前研究的熱點和難點，具有極大的發展空間。
肝臟保存液可分為仿細胞內液型溶液、仿細胞外液型溶液、高滲性溶液、稀釋血液保存液和血漿類似液等類型[21]，目前應用較為廣泛的有UW(University of Wisconsin)液、HTK(histidine-tryptophan-ketoglutarate)液、施爾生液、高滲枸櫞酸鹽腺嘌呤溶液等。這些保存液均適用于離體器官的低溫靜態保存，其中UW液因其優異表現成為器官保存的“金標準”，能有效保存肝臟長達24~30 h,但高黏度、高鉀、穩定性不足等特點也影響了其使用，尤其對于有較長熱缺血時間的DCD供肝保存效果有限。部分研究通過添加三磷酸腺苷-氯化鎂(ATP-MgCl2)氧合晶體[22]、超氧化物歧化酶、鐵螯合劑[23]、血管擴張藥物等來改善器官保存效果，但未形成共識。
荷蘭學者發明的Polysol灌注液能為器官持續代謝提供充足的營養物質[24]；選用聚乙二醇作為膠體成分，在保護肝細胞功能、降低氧耗、保持微循環等方面取得了較好的效果，可能成為機械灌注保存的較好選擇；但其氧合效果尚不能滿足DCD供肝保存的要求。目前研究多以全血或稀釋血液作為氧載體灌注，其中的血細胞和血漿成分具有潛在的負面影響：炎性介質誘發炎癥或排斥反應、肝內微血栓形成、紅細胞崩解、感染風險；還存在血源緊張、長途運輸困難等實際操作障礙。因此，開發一種適用于DCD供肝的機械灌注保存液是實現體外無血常溫機械灌注器官保存及功能修復的必要條件，開發的保存液應具有常溫穩定性好、能量底物供應充分、氧合性能佳、能維持微循環及內環境穩態等特點。
3.2 利用人工血液改善器官保存液氧合效果
人工血液最初是作為血液替代品而被創造出來，用以應對血液供給的不足和輸血的副作用。理想的人工血液應具備以下特點[25]：①良好的氧合能力；②不與氧發生化學反應，不產生毒性代謝物；③無抗原性；④常溫下長期穩定；⑤能進行滅菌處理。以上特性恰好滿足常溫機械灌注器官保存的需要，使人工血液作為攜氧載體參與器官灌注保存成為較好的選擇。
目前人工血液的基礎材料主要有血紅蛋白基氧載體(hemoglobin based oxygen carriers，HBOCs)與氟碳化物(perfluorochemicals，PFCs)兩大類[26]。HBOCs以血紅蛋白為基礎經過提純和修飾(化學修飾、微囊包裹、基因重組等)獲得，但大多數臨床試驗結果并不滿意。其主要副作用包括循環血壓大幅升高、腎毒性、消化道痙攣和免疫原性等。
氟碳分子具有極高的攜帶O2和CO2的能力,溶解于氟碳液體中的O2很容易被組織攝取。PFCs通常采用卵磷脂或白蛋白進行乳化，乳化劑最終通過肝臟和腎臟代謝清除，而氟碳分子可在幾天內經由呼吸排出。第一代氟碳化物乳劑Fluosol-DA20，經美國食品藥品監督管理局(food and drug administration,FDA)許可用于冠狀動脈血管成形術中。第二代以Oxygent(Alliance Pharmaceutical，CA)為代表，基本成分是全氟溴烷，目前已在歐洲和北美完成Ⅲ期臨床試驗，可作為血液替代品，還對潛水減壓病、鐮狀細胞貧血等疾病有一定療效。PFCs最大的優勢在于它不依賴于人血或其它生物來源血液，可大量生產；它作為血液替代物的某些缺點(需要呼吸高濃度氧氣、有效作用時間短)恰好是肝臟常溫灌注保存所能利用的契合點；Oxygent乳液也沒有觀察到補體和吞噬細胞激活效應。因此，PFCs非常適用于作為無血常溫機械灌注保存液的攜氧載體。
4 總結及展望
綜上所述，體外持續機械灌注技術的發展和規范化將會積極促進DCD供肝的安全、合理利用，改善移植患者的生存率及生存質量，具有重大的科學意義和社會效益。進一步研究需要關注機械灌注方案的溫度、灌注液開發、氧合途徑等核心問題，為推進DCD供體肝移植的安全、廣泛應用提供實驗依據和優化方案。
引言
中國是肝病高發國家，根據《2013中國衛生統計年鑒》和《中國腫瘤登記年報》，病毒性肝炎年新發病數137萬，居甲乙類傳染病首位；肝癌年新發病例為35.5萬，年死亡率高達26.26/10萬，居惡性腫瘤第二位；每年用于肝病的醫療保健費用數以百億元計，成為影響國民健康、經濟、社會發展的嚴重問題。
肝臟移植目前仍是針對終末期肝病最有效的治療手段，但受到供體嚴重缺乏的制約，大量患者在等待肝源的過程中死亡或喪失移植機會。拓展肝源供給成為肝移植臨床和基礎研究的熱點和難點。其中，心臟死亡器官捐獻(donation after cardiac death，DCD)是解決供肝嚴重短缺的有效途徑之一[1]。我國自2010年3月開展DCD器官捐獻工作以來，取得了豐富的成果和經驗，極大促進了移植事業的發展。然而，DCD供肝具有熱缺血時間長、不可控因素多、術后并發癥率高等特點。研究表明，不良事件的發生與供肝缺血期間氧和營養供應中斷、代謝產物堆積、現行低溫保存技術導致肝細胞能量代謝障礙等關系密切[2-3]。
體外機械灌注技術(ex vivo mechanical perfusion，EVMP)的發明為DCD來源供肝的保存和功能修復提供了新的思路。這一技術能為肝臟持續提供氧氣和營養物質，排出代謝廢物，有望改善器官保存期間的能量代謝狀態，一定程度上可修復DCD供肝缺血損傷，減少肝移植術后并發癥[4]。目前這一技術發展迅猛，但仍存在諸多懸而未決的爭議。本文對機械灌注法應用于DCD供肝保存的現狀及核心問題進行綜述，以期為進一步研究提供參考。
1 DCD供肝移植的特點和困境
國際通用的荷蘭Maastricht分類標準將DCD供體分為可控(M-Ⅲ)和不可控(M-Ⅰ、M-Ⅱ、M-Ⅳ、M-Ⅴ)兩大類型，其中可控型是指受到嚴重不可逆性損傷，但還未達到腦死亡的全套醫學標準，經家屬同意，有計劃地撤除生命支持，等待死亡發生。《中國心臟死亡器官捐獻工作指南》[5]將器官捐獻分為3類：C-Ⅰ即國際標準化腦死亡器官捐獻(donation after brain death，DBD)；C-Ⅱ即國際標準化DCD，包括M-Ⅰ～M-Ⅴ；C-Ⅲ即心腦雙死亡器官捐獻(donation after brain and cardiac death，DBCD)，指雖已符合DBD標準，但鑒于腦死亡立法缺失，現仍按DCD程序實施。新的觀點認為，熱缺血時間應從出現臨床低血壓而非心臟停跳開始計算[6]。由此可見，任何一種DCD供肝類型都很可能面臨熱缺血時間較長的問題，尤其是經過心肺復蘇的或不可控型DCD供體，將經歷較長時間的低血壓打擊，嚴重損傷供肝功能。
研究表明，熱缺血時間及冷保存時間對DCD供肝質量及受體預后有重要影響。氧和營養物質來源的中斷以及代謝產物的堆積可能是導致熱缺血損傷最重要的因素，其必然結果是細胞的能量代謝障礙，肝組織三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)嚴重減少甚至耗竭，腺嘌呤核苷酸總量劇減，進一步引起氧自由基生成、細胞內鈣超載、細胞和細胞器功能出現紊亂、細胞凋亡[7]。目前普遍認為肝臟耐受熱缺血時間的上Ⅰ限為30 min，冷保存時間上限為12 h，超過此時限則可能導致原發性移植肝無功能、膽道缺血性損傷等并發癥發生率顯著增高[8]。
各國學者分別從供體預處理[9](涉及倫理問題)、改良供肝切取手術技術(無法避免低血壓期損傷)、優化器官保存方法[10]、受體藥物干預(影響機體其他系統功能)等方面努力嘗試提高DCD供肝質量，縮短熱/冷缺血時間，延長肝臟耐受缺血時限，以期改善DCD供肝移植效果。其中，優化器官保存方法因其適用性廣、可行性強、效果顯著等優點，成為最具應用前景的突破點。
2 體外持續機械灌注技術優化供肝保存效果
低溫(4 ℃)靜態保存是目前國際普遍采用的供肝保存方式。一般認為低溫能夠有效降低肝細胞新陳代謝及異化作用對肝臟離體保存的影響，溫度每下降10 ℃，代謝速率降低至原來的25%~35%[11]，從而減少ATP消耗及后續的肝細胞損傷。然而，即使在1 ℃的情況下仍然存在不可忽視的代謝活動，有研究表明，兔肝在冷保存6 h后ATP含量下降了84%[12]，雖然低溫不引起肝細胞組織學明顯改變，但可導致肝竇內皮細胞凋亡、Kupffer細胞活化、細胞內鈣超載等一系列病理變化，靜態保存亦會導致代謝產物蓄積，進一步損傷肝臟功能。
近年來體外持續機械灌注技術重新獲得廣泛的重視，機械灌注保存與靜態冷保存相比的主要優點體現在：①能持續給肝細胞提供維持代謝的能量底物(糖、氨基酸、核苷酸和氧等)，避免肝內ATP耗盡及其引起的損傷性瀑布效應[13]；②同時持續排出毒性代謝產物，阻斷生物降解的過程[14]；③具有更好的微循環灌注和保護效果；④便于即時監測肝臟活性及功能[15]。
灌注溫度(常溫、亞低溫、低溫)、灌注液的成分以及氧合途徑(稀釋血液、無血灌注液)是體外持續機械灌注技術的核心問題，但是目前均尚未得到解決，尤其是其針對DCD供肝的適用性和安全范圍尚不清楚。
機械灌注保存技術目前巨大的爭議之一在于灌注溫度選擇：包括低溫(4 ℃)、亞低溫(15~20 ℃)、常溫(37 ℃)，各種方式均有相應的理論和實驗證據證明其優勢。Guarrera等[16]于2010年報道了第一例低溫機械灌注保存的臨床試驗，將20例接受低溫機械灌注保存肝臟移植的病例與單純低溫保存肝臟移植病例進行對比，結果顯示低溫機械灌注保存組住院時間更短，血管并發癥、膽道并發癥和原發性移植物無功能發生率更低。目前已經上市的肝臟機械灌注保存產品多采用低溫灌注保存。Bruinsma等[17]的實驗則論證了亞低溫機械灌注對肝臟保存效果的優越性。與此同時，也有大量研究支持常溫機械灌注能更好地保存和修復肝臟功能，延長熱缺血耐受時限，減少并發癥的發生[18-20]。采用低溫保存除具有前述不足之外，還可能損傷細胞膜脂質雙分子層和細胞骨架，使離子交換泵失活引起細胞裂解，收縮微循環導致灌注不完全，故更傾向于采用常溫機械灌注的方式來保存及修復DCD供體肝臟。因此，進一步闡明常溫機械灌注技術修復DCD供肝缺血性損傷的機制，論證無血常溫灌注優化供肝保存的效果，對于促進DCD供肝的臨床應用和改善移植患者預后具有重要的意義。
3 開發適用于DCD供肝機械灌注保存液的必要性
3.1 器官保存液的研究現狀及瓶頸問題
器官保存液主要用于離體器官的功能保護，其基本原理包括：合適的滲透壓防止低溫引起的細胞水腫；緩沖體系糾正細胞內酸中毒；減少缺血-再灌注損傷；促進保存期間能量的產生。因此，器官保存液的成分選擇、滲透壓控制、離子濃度調配、氧合、能量底物等是當前研究的熱點和難點，具有極大的發展空間。
肝臟保存液可分為仿細胞內液型溶液、仿細胞外液型溶液、高滲性溶液、稀釋血液保存液和血漿類似液等類型[21]，目前應用較為廣泛的有UW(University of Wisconsin)液、HTK(histidine-tryptophan-ketoglutarate)液、施爾生液、高滲枸櫞酸鹽腺嘌呤溶液等。這些保存液均適用于離體器官的低溫靜態保存，其中UW液因其優異表現成為器官保存的“金標準”，能有效保存肝臟長達24~30 h,但高黏度、高鉀、穩定性不足等特點也影響了其使用，尤其對于有較長熱缺血時間的DCD供肝保存效果有限。部分研究通過添加三磷酸腺苷-氯化鎂(ATP-MgCl2)氧合晶體[22]、超氧化物歧化酶、鐵螯合劑[23]、血管擴張藥物等來改善器官保存效果，但未形成共識。
荷蘭學者發明的Polysol灌注液能為器官持續代謝提供充足的營養物質[24]；選用聚乙二醇作為膠體成分，在保護肝細胞功能、降低氧耗、保持微循環等方面取得了較好的效果，可能成為機械灌注保存的較好選擇；但其氧合效果尚不能滿足DCD供肝保存的要求。目前研究多以全血或稀釋血液作為氧載體灌注，其中的血細胞和血漿成分具有潛在的負面影響：炎性介質誘發炎癥或排斥反應、肝內微血栓形成、紅細胞崩解、感染風險；還存在血源緊張、長途運輸困難等實際操作障礙。因此，開發一種適用于DCD供肝的機械灌注保存液是實現體外無血常溫機械灌注器官保存及功能修復的必要條件，開發的保存液應具有常溫穩定性好、能量底物供應充分、氧合性能佳、能維持微循環及內環境穩態等特點。
3.2 利用人工血液改善器官保存液氧合效果
人工血液最初是作為血液替代品而被創造出來，用以應對血液供給的不足和輸血的副作用。理想的人工血液應具備以下特點[25]：①良好的氧合能力；②不與氧發生化學反應，不產生毒性代謝物；③無抗原性；④常溫下長期穩定；⑤能進行滅菌處理。以上特性恰好滿足常溫機械灌注器官保存的需要，使人工血液作為攜氧載體參與器官灌注保存成為較好的選擇。
目前人工血液的基礎材料主要有血紅蛋白基氧載體(hemoglobin based oxygen carriers，HBOCs)與氟碳化物(perfluorochemicals，PFCs)兩大類[26]。HBOCs以血紅蛋白為基礎經過提純和修飾(化學修飾、微囊包裹、基因重組等)獲得，但大多數臨床試驗結果并不滿意。其主要副作用包括循環血壓大幅升高、腎毒性、消化道痙攣和免疫原性等。
氟碳分子具有極高的攜帶O2和CO2的能力,溶解于氟碳液體中的O2很容易被組織攝取。PFCs通常采用卵磷脂或白蛋白進行乳化，乳化劑最終通過肝臟和腎臟代謝清除，而氟碳分子可在幾天內經由呼吸排出。第一代氟碳化物乳劑Fluosol-DA20，經美國食品藥品監督管理局(food and drug administration,FDA)許可用于冠狀動脈血管成形術中。第二代以Oxygent(Alliance Pharmaceutical，CA)為代表，基本成分是全氟溴烷，目前已在歐洲和北美完成Ⅲ期臨床試驗，可作為血液替代品，還對潛水減壓病、鐮狀細胞貧血等疾病有一定療效。PFCs最大的優勢在于它不依賴于人血或其它生物來源血液，可大量生產；它作為血液替代物的某些缺點(需要呼吸高濃度氧氣、有效作用時間短)恰好是肝臟常溫灌注保存所能利用的契合點；Oxygent乳液也沒有觀察到補體和吞噬細胞激活效應。因此，PFCs非常適用于作為無血常溫機械灌注保存液的攜氧載體。
4 總結及展望
綜上所述，體外持續機械灌注技術的發展和規范化將會積極促進DCD供肝的安全、合理利用，改善移植患者的生存率及生存質量，具有重大的科學意義和社會效益。進一步研究需要關注機械灌注方案的溫度、灌注液開發、氧合途徑等核心問題，為推進DCD供體肝移植的安全、廣泛應用提供實驗依據和優化方案。