微生物遍布于人體所有與外環境相通器官,尤以腸道微生物數量眾多,對人體有著非常重要的生理意義。但因其種類繁多、體型微小,增加了對其全面、深入認識的難度。隨著分子生物學、基因組學、生物信息學等學科的興起,大大促進了微生物組研究技術的發展。微生物組研究的重點:一是多樣性,包括分離、鑒定種類及定量;二是活性,即微生物在其所處環境中起何種功能作用。圍繞這一主題,微生物組研究方法可概括為傳統檢測方法、構建基因文庫法、遺傳指紋圖譜技術、分子雜交技術和DNA測序技術等。
引用本文： 趙蕊, 陳茂偉. 腸道微生物組的研究方法進展. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(5): 1150-1154. doi: 10.7507/1001-5515.20150204 復制
引言
微生物遍布于人體所有與外環境相通的器官。成人胃腸道黏膜表面積達300 m2，是與外界環境接觸并相互作用的最大區域，在其中定殖著約1×1014個微生物，數量是人體體細胞總數的10倍。腸道微生物參與宿主的能量吸收和儲存，幫助宿主降解并吸收食物中的營養成分，還能促進免疫細胞分化與成熟、激活腸道免疫系統[1-3]，具有非常重要的生理意義。但是由于人體腸道復雜的厭氧環境，40%～80%的腸道微生物難以在體外培養，僅憑培養手段進行微生物組研究會大大削弱腸道微生物的多樣性。隨著分子生物學技術的飛速發展，利用分子生物技術研究腸道微生物組的技術取得了極大的進展。掌握并運用這些新技術對腸道微生物組的研究十分關鍵，該文主要對腸道微生物組的現代分子生物學研究方法進行總結和介紹。
1 傳統純培養檢測方法
傳統微生物檢測方法是用各種培養基培養分離微生物，并通過革蘭染色、生物化學和血清學試驗等方法來確定微生物種類，通過倍比稀釋、菌落計數等方法來測定微生物數量。但由于傳統微生物培養技術中，菌株的富集或衰減不可避免，原始的微生態結構被改變，這會導致研究結果存在較大偏差。
Moore等[4]利用傳統培養方法對20例男性的糞便樣品中微生物種類和相對數量進行了研究，研究對象包括日本到夏威夷的60～80歲的健康個體，食譜包括東西方飲食，將取到的糞便樣品進行培養分析，得到1 147個純培養物，鑒定為113種不同的微生物。然而據報道，人體腸道至少存在400種微生物[4]，因此這種培養方法會漏掉多數的、營養條件要求更為苛刻的微生物。
2 傳統分子生物技術
2.1 腸道菌群DNA提取技術
從糞便樣品中提取高質量的、具有代表性的腸道菌群總DNA是腸道微生物分子生物技術研究的基礎。目前提取腸道菌群總DNA的方法主要有酚/氯仿抽提法、Chelex-100煮沸法、GuSCN/silica法以及一些商業試劑盒，如Fast DNA kit、Quantum Prep Aquapure Genomic DNA isolation kit、QIAamp DNA Stool Mini kit等。其中QIAamp DNA Stool Mini kit的提取效果得到較多肯定。試劑盒應用方便、快捷，但價格昂貴，處理大批樣品時科研成本太高。相較而言，酚/氯仿抽提法快速且成本低，適合用于腸道微生物研究中總DNA 提取，尤其適合處理大批量樣品。
2.2 構建基因文庫測序技術
2.2.1 構建16S rRNA基因文庫
16S rRNA基因克隆文庫通過擴增各種細菌共有基因序列片段對細菌進行定性定量分析，是一種有力的細菌學檢測分析手段，現已廣泛用于腸道和人體其他部位微生物多樣性研究[5-7]，并通過該方法發現了許多尚未培養到的菌種。
16S rRNA基因克隆文庫技術可以分析標本中的菌群結構，反映各種細菌的相對比例及數量，具有培養法難以比擬的優勢，不足之處是實際操作中技術環節多、影響因素復雜、不同實驗室操作條件難以標化以及對標本中的細菌數量有一定要求等。但相信隨著技術的不斷提高，16S rRNA基因序列分析將逐步成為微生物組結構研究的有力工具。
2.2.2 全基因組鳥槍測序分析技術
Gill等[8]利用全基因組鳥槍(Shot-gun)測序技術分析了兩名健康成年人糞便中的菌群，首次對人體腸道微生物多樣性進行了全面的描述。Qin等[9]運用深度Shot-gun測序法研究發現，Ⅱ型糖尿病患者的腸道菌群中度失調，產丁酸鹽細菌豐度降低，而致病微生物的功能增加。
相較于傳統的基于rRNA的研究，Shot-gun測序分析技術可以找到更多的進化標記，得到更多的菌群信息，且Shot-gun技術不需PCR擴增，因此分析出的結果偏差較小；此外，通過序列數據分析，還可以對微生物基因表達及功能狀態情況進行研究。其缺點在于微生物系統組成復雜，將大量的序列信息正確地裝配成每個成員的基因組全序列，是一個較大的難題。
2.3 遺傳指紋圖譜技術
構建基因文庫的方法可以得到樣本中的菌群種類和相對進化信息，然而，我們常需要對整個腸道微生物組進行動態監測，構建基因文庫方法會顯得費時、費力，不能做出快速檢測，這時遺傳指紋圖譜技術可克服上述不足，快速靈敏地檢測生態系統的動態變化。
2.3.1 變性梯度凝膠電泳及其衍生技術
變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技術是由Fisher等發明的，Muyzer等首次將其應用于微生物群落結構研究，隨后Zoetendal將其用于人體腸道菌群的分析研究。后來在其基礎上衍生出溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophesis，TGGE)、瞬時溫度梯度電泳(temporal temperature gradient gel electrophesis，TTGE)、脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)和單鏈構象多態性檢測(single-stranded conformational polymorphisms，SSCP)等。此后，該技術被廣泛應用于消化道排泄物中微生物的分析[10-11]。
DGGE及其衍生技術既可以對比分析不同的微生物群落之間的差異，鑒別細菌種類，也可以研究同一個微生物群落隨時間和環境改變的動態變化過程。但該技術用通用引物進行 PCR 擴增時，可能會忽視一些數量較少的細菌，并且腸道微生物組種類繁多，最終獲得的電泳條帶復雜且擁擠，增加了結果分析的困難。
2.3.2 隨機擴增多態性DNA技術
隨機擴增多態性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)技術利用寡核苷酸序列在基因組上隨機配對的特性，經擴增得到一系列大小不同的產物，通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳便可得到一系列基于RAPD的指紋圖譜。因為不同模扳DNA產生的指紋圖譜有差異，因此可用于鑒定微生物種類，并且靈敏度高，常被用于細分微生物組內的種群差異[11-12]。
RAPD技術的缺點在于重復性和穩定性差，產生的圖譜條帶過于復雜，需要進行大量的篩選，從中找到較為合適的引物進行分析，較為費時。
2.3.3 末端限制性片斷長度多態性分析技術
末端限制性片斷長度多態性分析(terminal restriction fragment length polymorphisms，T-RFLP)技術通過自動測序儀分析酶切后的末端序列，達到定量的目的，因為末端序列來自16S rDNA，因此可用于復雜的腸道微生物群落結構的研究，快速靈敏地評估群落中微生物的多樣性，并給出微生物群落結構的指紋圖譜，是目前被廣泛采用的一種指紋圖譜技術，現已成功應用于各種微生物群落結構和多態性的比較分析[13-14]。
其缺點在于該技術只檢測末端序列，因此不可避免地會低估微生物群落結構多態性。同時它是基于PCR擴增技術，實驗過程影響因素較多，亦會對結果造成影響。
2.4 熒光原位雜交技術
除了上述技術外，分子雜交技術也被廣泛應用于腸道微生物組的研究中，同樣表現出應用潛力和優點。Giovannoni等首次應用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技術進行細菌學的研究。隨后Delong等使用熒光標記寡核苷酸探針檢測單個微生物細胞。經過不斷的豐富和完善，FISH技術已成為近年腸道微生物研究中一種重要的檢測工具[15-16]。其利用熒光素標記16S rRNA基因序列的寡聚核苷酸探針，與靶細菌雜交，通過檢測目標序列來鑒定微生物，具有敏感、快速、安全等優點。FISH技術還可用于鑒定和檢測未培養種屬和新種屬。其缺點在于FISH技術尚不能用于16S rRNA序列未知微生物的檢測，且在操作時易受到污染干擾，同時結果會受到微生物營養狀態的影響。由于腸道微生物組種類繁多，而聯合流式細胞學技術可進行高通量分析，已越來越多地應用于FISH信號檢測。
3 新近發展的方法技術
3.1 基因芯片技術
基因芯片技術(DNA chips)原理是使探針分子在濾膜、硅片、玻璃等介質上排列成微矩陣，將待檢樣品標記后與微矩陣雜交，通過檢測樣品雜交信號強度即可獲得樣品中基因序列及數量等信息，具有快速、高效、低成本等優點，現已廣泛應用于微生物群落結構及功能的研究[17-19]，并且其敏感性和特異性已經得到了反復驗證[20-21]。
目前尚沒有應用基因芯片進行人體腸道微生物研究的報道，但基因芯片包括大量針對人體腸道微生物的功能基因，并且其子類型HummChip是專門針對人體微生物設計的，因此基因芯片技術應用于腸道微生物研究不存在技術問題。
3.2 宏基因組學技術
宏基因組學即將環境中全體微生物的遺傳物質看作一個整體，系統全面地研究微生物與其生存環境之間的關系。通過宏基因組測序技術可發現腸道菌群結構改變，結合其代謝特征可分析腸道微生物與代謝性疾病之間的聯系。宏基因組學還可用來發現新發傳染病病原以及未知病原。美國國立衛生研究院(National Institutes of Health,NIH)的人類微生物組計劃[22-23]利用宏基因組學技術分析了242個美國健康志愿者微生物基因組，獲得了近800個菌種的基因參考序列。
宏基因組學技術為腸道微生物組的研究提供了新的思路與方法，為充分認識和利用未培養微生物、完整地從群落水平上認識微生物開辟了新的道路。
3.3 第二代測序技術
2005年底Roche公司建立454測序技術，該技術結合DNA擴增乳膠和皮升級反應孔進行焦磷酸鹽測序，可對微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協作關系及與環境之間的關系進行研究，具有速度快、通量高、讀長長、準確性高、一致性好及簡便高效的優勢。Gosalbes等[24]運用454測序技術對10位健康人的腸道微生物群落結構和組成進行了研究，發現發現厚壁菌門占49.18%，擬桿菌門占31.42%，變形菌門占3.6%，放線菌門占0.4%。454 測序技術在腸道微生態研究中已經得到較為廣泛的運用[25]，然而454測序同樣存在著缺點，主要在于片段長度短，對連續單堿基重復區域測序準確性差，常會產生缺失或者插入誤差。但隨著454測序分析技術的發展成熟，終將得到更準確、可靠的結果。
相較于454測序技術，Illumina測序表現出低錯誤率、低成本和高通量等優勢[26-27]。但是，Illumina測序長度短，所獲得的序列數量巨大，呈數十倍增長，原有生物信息學分析工具無法計算，因此解決其運算問題是Illumina用于微生物群落分析的關鍵之處。隨著Illumina測序讀取長度的改善及新型分析工具的開發，預計Illumina測序技術將因其高性價比的優勢廣泛應用于腸道微生物組的研究。
4 展望
從1975年Woese等首次應用rRNA分析菌群以來，rRNA數據庫迅速擴大，16S rRNA基因作為細菌的標志，已逐漸成為臨床細菌分類、鑒定的金標準。傳統分子生物學技術多以16S rRNA基因為基礎，Shot-gun測序費用高昂且分析過程繁瑣復雜，目前難以大規模推廣使用，DGGE技術相對簡單高效，T-RFLP較為方便快捷。基因芯片用于個體間腸道菌群對比時靈敏性較好，且具有高通量特點，預計可廣泛應用于臨床檢驗。宏基因組測序可保留樣本中全部菌群的信息，在腸道菌群多樣性研究中正逐漸盛行。焦磷酸測序能自動化檢測大量的樣本，近年來發展迅速。然而分子生物學技術均為多學科技術融合滲透的成果，必然在某些方面存在不足和一些亟待解決的關鍵問題，且這些方法都受制于樣本中獲得的DNA質量及其PCR效果。但隨著科學技術的不斷發展，相信這些問題會得到解決，相關技術一定會在腸道微生物的研究中發揮更加重要的作用。
總之，腸道微生物組研究主要包括微生物組的多樣性和功能活性等兩方面。傳統微生物培養的研究方法和現代分子生物學技術是目前主要的兩大研究手段，其中現代分子生物學技術具有快速、高效的特點，尤其是對于不能被培養的微生物的研究具有傳統微生物培養方法無法替代的優勢。而傳統的微生物培養方法，可通過培養、分離、鑒定獲得存活的純微生物，進而在微生物整體水平上進行研究。因此，綜合應用各種腸道微生物組的研究方法和技術才能進一步加快對腸道微生物組多樣性及其功能的研究和認識。
引言
微生物遍布于人體所有與外環境相通的器官。成人胃腸道黏膜表面積達300 m2，是與外界環境接觸并相互作用的最大區域，在其中定殖著約1×1014個微生物，數量是人體體細胞總數的10倍。腸道微生物參與宿主的能量吸收和儲存，幫助宿主降解并吸收食物中的營養成分，還能促進免疫細胞分化與成熟、激活腸道免疫系統[1-3]，具有非常重要的生理意義。但是由于人體腸道復雜的厭氧環境，40%～80%的腸道微生物難以在體外培養，僅憑培養手段進行微生物組研究會大大削弱腸道微生物的多樣性。隨著分子生物學技術的飛速發展，利用分子生物技術研究腸道微生物組的技術取得了極大的進展。掌握并運用這些新技術對腸道微生物組的研究十分關鍵，該文主要對腸道微生物組的現代分子生物學研究方法進行總結和介紹。
1 傳統純培養檢測方法
傳統微生物檢測方法是用各種培養基培養分離微生物，并通過革蘭染色、生物化學和血清學試驗等方法來確定微生物種類，通過倍比稀釋、菌落計數等方法來測定微生物數量。但由于傳統微生物培養技術中，菌株的富集或衰減不可避免，原始的微生態結構被改變，這會導致研究結果存在較大偏差。
Moore等[4]利用傳統培養方法對20例男性的糞便樣品中微生物種類和相對數量進行了研究，研究對象包括日本到夏威夷的60～80歲的健康個體，食譜包括東西方飲食，將取到的糞便樣品進行培養分析，得到1 147個純培養物，鑒定為113種不同的微生物。然而據報道，人體腸道至少存在400種微生物[4]，因此這種培養方法會漏掉多數的、營養條件要求更為苛刻的微生物。
2 傳統分子生物技術
2.1 腸道菌群DNA提取技術
從糞便樣品中提取高質量的、具有代表性的腸道菌群總DNA是腸道微生物分子生物技術研究的基礎。目前提取腸道菌群總DNA的方法主要有酚/氯仿抽提法、Chelex-100煮沸法、GuSCN/silica法以及一些商業試劑盒，如Fast DNA kit、Quantum Prep Aquapure Genomic DNA isolation kit、QIAamp DNA Stool Mini kit等。其中QIAamp DNA Stool Mini kit的提取效果得到較多肯定。試劑盒應用方便、快捷，但價格昂貴，處理大批樣品時科研成本太高。相較而言，酚/氯仿抽提法快速且成本低，適合用于腸道微生物研究中總DNA 提取，尤其適合處理大批量樣品。
2.2 構建基因文庫測序技術
2.2.1 構建16S rRNA基因文庫
16S rRNA基因克隆文庫通過擴增各種細菌共有基因序列片段對細菌進行定性定量分析，是一種有力的細菌學檢測分析手段，現已廣泛用于腸道和人體其他部位微生物多樣性研究[5-7]，并通過該方法發現了許多尚未培養到的菌種。
16S rRNA基因克隆文庫技術可以分析標本中的菌群結構，反映各種細菌的相對比例及數量，具有培養法難以比擬的優勢，不足之處是實際操作中技術環節多、影響因素復雜、不同實驗室操作條件難以標化以及對標本中的細菌數量有一定要求等。但相信隨著技術的不斷提高，16S rRNA基因序列分析將逐步成為微生物組結構研究的有力工具。
2.2.2 全基因組鳥槍測序分析技術
Gill等[8]利用全基因組鳥槍(Shot-gun)測序技術分析了兩名健康成年人糞便中的菌群，首次對人體腸道微生物多樣性進行了全面的描述。Qin等[9]運用深度Shot-gun測序法研究發現，Ⅱ型糖尿病患者的腸道菌群中度失調，產丁酸鹽細菌豐度降低，而致病微生物的功能增加。
相較于傳統的基于rRNA的研究，Shot-gun測序分析技術可以找到更多的進化標記，得到更多的菌群信息，且Shot-gun技術不需PCR擴增，因此分析出的結果偏差較小；此外，通過序列數據分析，還可以對微生物基因表達及功能狀態情況進行研究。其缺點在于微生物系統組成復雜，將大量的序列信息正確地裝配成每個成員的基因組全序列，是一個較大的難題。
2.3 遺傳指紋圖譜技術
構建基因文庫的方法可以得到樣本中的菌群種類和相對進化信息，然而，我們常需要對整個腸道微生物組進行動態監測，構建基因文庫方法會顯得費時、費力，不能做出快速檢測，這時遺傳指紋圖譜技術可克服上述不足，快速靈敏地檢測生態系統的動態變化。
2.3.1 變性梯度凝膠電泳及其衍生技術
變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技術是由Fisher等發明的，Muyzer等首次將其應用于微生物群落結構研究，隨后Zoetendal將其用于人體腸道菌群的分析研究。后來在其基礎上衍生出溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophesis，TGGE)、瞬時溫度梯度電泳(temporal temperature gradient gel electrophesis，TTGE)、脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)和單鏈構象多態性檢測(single-stranded conformational polymorphisms，SSCP)等。此后，該技術被廣泛應用于消化道排泄物中微生物的分析[10-11]。
DGGE及其衍生技術既可以對比分析不同的微生物群落之間的差異，鑒別細菌種類，也可以研究同一個微生物群落隨時間和環境改變的動態變化過程。但該技術用通用引物進行 PCR 擴增時，可能會忽視一些數量較少的細菌，并且腸道微生物組種類繁多，最終獲得的電泳條帶復雜且擁擠，增加了結果分析的困難。
2.3.2 隨機擴增多態性DNA技術
隨機擴增多態性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)技術利用寡核苷酸序列在基因組上隨機配對的特性，經擴增得到一系列大小不同的產物，通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳便可得到一系列基于RAPD的指紋圖譜。因為不同模扳DNA產生的指紋圖譜有差異，因此可用于鑒定微生物種類，并且靈敏度高，常被用于細分微生物組內的種群差異[11-12]。
RAPD技術的缺點在于重復性和穩定性差，產生的圖譜條帶過于復雜，需要進行大量的篩選，從中找到較為合適的引物進行分析，較為費時。
2.3.3 末端限制性片斷長度多態性分析技術
末端限制性片斷長度多態性分析(terminal restriction fragment length polymorphisms，T-RFLP)技術通過自動測序儀分析酶切后的末端序列，達到定量的目的，因為末端序列來自16S rDNA，因此可用于復雜的腸道微生物群落結構的研究，快速靈敏地評估群落中微生物的多樣性，并給出微生物群落結構的指紋圖譜，是目前被廣泛采用的一種指紋圖譜技術，現已成功應用于各種微生物群落結構和多態性的比較分析[13-14]。
其缺點在于該技術只檢測末端序列，因此不可避免地會低估微生物群落結構多態性。同時它是基于PCR擴增技術，實驗過程影響因素較多，亦會對結果造成影響。
2.4 熒光原位雜交技術
除了上述技術外，分子雜交技術也被廣泛應用于腸道微生物組的研究中，同樣表現出應用潛力和優點。Giovannoni等首次應用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技術進行細菌學的研究。隨后Delong等使用熒光標記寡核苷酸探針檢測單個微生物細胞。經過不斷的豐富和完善，FISH技術已成為近年腸道微生物研究中一種重要的檢測工具[15-16]。其利用熒光素標記16S rRNA基因序列的寡聚核苷酸探針，與靶細菌雜交，通過檢測目標序列來鑒定微生物，具有敏感、快速、安全等優點。FISH技術還可用于鑒定和檢測未培養種屬和新種屬。其缺點在于FISH技術尚不能用于16S rRNA序列未知微生物的檢測，且在操作時易受到污染干擾，同時結果會受到微生物營養狀態的影響。由于腸道微生物組種類繁多，而聯合流式細胞學技術可進行高通量分析，已越來越多地應用于FISH信號檢測。
3 新近發展的方法技術
3.1 基因芯片技術
基因芯片技術(DNA chips)原理是使探針分子在濾膜、硅片、玻璃等介質上排列成微矩陣，將待檢樣品標記后與微矩陣雜交，通過檢測樣品雜交信號強度即可獲得樣品中基因序列及數量等信息，具有快速、高效、低成本等優點，現已廣泛應用于微生物群落結構及功能的研究[17-19]，并且其敏感性和特異性已經得到了反復驗證[20-21]。
目前尚沒有應用基因芯片進行人體腸道微生物研究的報道，但基因芯片包括大量針對人體腸道微生物的功能基因，并且其子類型HummChip是專門針對人體微生物設計的，因此基因芯片技術應用于腸道微生物研究不存在技術問題。
3.2 宏基因組學技術
宏基因組學即將環境中全體微生物的遺傳物質看作一個整體，系統全面地研究微生物與其生存環境之間的關系。通過宏基因組測序技術可發現腸道菌群結構改變，結合其代謝特征可分析腸道微生物與代謝性疾病之間的聯系。宏基因組學還可用來發現新發傳染病病原以及未知病原。美國國立衛生研究院(National Institutes of Health,NIH)的人類微生物組計劃[22-23]利用宏基因組學技術分析了242個美國健康志愿者微生物基因組，獲得了近800個菌種的基因參考序列。
宏基因組學技術為腸道微生物組的研究提供了新的思路與方法，為充分認識和利用未培養微生物、完整地從群落水平上認識微生物開辟了新的道路。
3.3 第二代測序技術
2005年底Roche公司建立454測序技術，該技術結合DNA擴增乳膠和皮升級反應孔進行焦磷酸鹽測序，可對微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協作關系及與環境之間的關系進行研究，具有速度快、通量高、讀長長、準確性高、一致性好及簡便高效的優勢。Gosalbes等[24]運用454測序技術對10位健康人的腸道微生物群落結構和組成進行了研究，發現發現厚壁菌門占49.18%，擬桿菌門占31.42%，變形菌門占3.6%，放線菌門占0.4%。454 測序技術在腸道微生態研究中已經得到較為廣泛的運用[25]，然而454測序同樣存在著缺點，主要在于片段長度短，對連續單堿基重復區域測序準確性差，常會產生缺失或者插入誤差。但隨著454測序分析技術的發展成熟，終將得到更準確、可靠的結果。
相較于454測序技術，Illumina測序表現出低錯誤率、低成本和高通量等優勢[26-27]。但是，Illumina測序長度短，所獲得的序列數量巨大，呈數十倍增長，原有生物信息學分析工具無法計算，因此解決其運算問題是Illumina用于微生物群落分析的關鍵之處。隨著Illumina測序讀取長度的改善及新型分析工具的開發，預計Illumina測序技術將因其高性價比的優勢廣泛應用于腸道微生物組的研究。
4 展望
從1975年Woese等首次應用rRNA分析菌群以來，rRNA數據庫迅速擴大，16S rRNA基因作為細菌的標志，已逐漸成為臨床細菌分類、鑒定的金標準。傳統分子生物學技術多以16S rRNA基因為基礎，Shot-gun測序費用高昂且分析過程繁瑣復雜，目前難以大規模推廣使用，DGGE技術相對簡單高效，T-RFLP較為方便快捷。基因芯片用于個體間腸道菌群對比時靈敏性較好，且具有高通量特點，預計可廣泛應用于臨床檢驗。宏基因組測序可保留樣本中全部菌群的信息，在腸道菌群多樣性研究中正逐漸盛行。焦磷酸測序能自動化檢測大量的樣本，近年來發展迅速。然而分子生物學技術均為多學科技術融合滲透的成果，必然在某些方面存在不足和一些亟待解決的關鍵問題，且這些方法都受制于樣本中獲得的DNA質量及其PCR效果。但隨著科學技術的不斷發展，相信這些問題會得到解決，相關技術一定會在腸道微生物的研究中發揮更加重要的作用。
總之，腸道微生物組研究主要包括微生物組的多樣性和功能活性等兩方面。傳統微生物培養的研究方法和現代分子生物學技術是目前主要的兩大研究手段，其中現代分子生物學技術具有快速、高效的特點，尤其是對于不能被培養的微生物的研究具有傳統微生物培養方法無法替代的優勢。而傳統的微生物培養方法，可通過培養、分離、鑒定獲得存活的純微生物，進而在微生物整體水平上進行研究。因此，綜合應用各種腸道微生物組的研究方法和技術才能進一步加快對腸道微生物組多樣性及其功能的研究和認識。