蛛絲蛋白特殊的序列結構使其具有獨特的理化性能、力學性能和優良的生物學性能。隨著蜘蛛絲在多領域功能性材料應用價值的發掘,采用基因重組技術,利用多種宿主表達重組蛛絲蛋白的研究獲得一定進展,所制備的重組蛛絲蛋白既能加工成高性能纖維,又能加工成范圍廣泛的非纖維狀形貌,結合其良好的生物相容性和低免疫原性,是諸如生物醫學應用等的理想選擇。本文綜述了對重組蛛絲蛋白的體外加工、化學和基因工程修飾的過程和機制。
引用本文： 劉斌, 王濤, 劉小兵, 羅友根. 重組蛛絲蛋白的加工和修飾. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(4): 933-939. doi: 10.7507/1001-5515.20150167 復制
引言
蛛絲是目前已知的最為堅韌的天然纖維之一[1]。優良的機械性能使蜘蛛絲具備高性能復合材料的潛質，可應用于工業、國防軍事、航空航天等領域[2]，加之良好的生物相容性和生物可降解性，令其在生物醫學材料如藥物控釋載體、手術縫合線、細胞培養支架、器官移植等方面的應用研究也得到越來越多的開展[3-5]。雖然蜘蛛絲的應用前景廣闊，但由于蜘蛛同類相食，使其無法象蠶那樣群體飼養，且天然蜘蛛絲的產量較低以至于難以大量收集，限制了對蜘蛛絲的研究和利用[6-7]，因此，蛛絲蛋白的重組生產顯得尤為迫切。
國內外科研工作者多以園蛛屬的十字園蛛(Araneus diadematus)和絡新婦屬的金紡蜘蛛(Nephila clavipe)為研究對象，因其大壺狀腺產生的牽引絲和鞭毛狀腺產生的橫絲相對易得且力學性能優異。相比較而言，大壺狀腺所產牽引絲在強度和彈性上具有綜合性能好的特點，鞭毛狀腺所產橫絲上有微小的膠滴包裹，致使其剛性低而彈性強。近些年對蛛絲蛋白序列及結構的研究已取得很大進展，但由于蛛絲蛋白基因序列較長且多重復序列，使得獲得的基因序列大多不完整，尤其對于編碼絲蛋白的cDNA序列，往往只獲得了基因結構的部分信息。而且，不同蛛絲蛋白中出現的重復序列結構和重復次數與蛛絲蛋白性能的關系還需要進一步闡明，有關C-末端和N-末端非重復序列對蛛絲蛋白基因的轉錄、翻譯及后加工，對蛛絲蛋白的二級結構及溶解性的影響，以及這些非重復序列在蛛絲纖維力學性能中發揮的作用也還需要更深入的研究[8]。同時，在這些研究成果的基礎上，進行了重組生產蛛絲蛋白的研究。多以牽引絲和鞭毛狀絲為研究對象，通過對其特征模塊[9-10]的改造和拼接，表達出串聯的重組蛛絲蛋白[11-12]。
科研工作者采用化學合成蛛絲蛋白基因或從蜘蛛絲腺cDNA文庫中克隆蛛絲蛋白基因，并選擇植物、動物及微生物等不同的表達系統進行重組蛛絲蛋白的表達，嘗試紡制性能優越的蛛絲蛋白纖維[6, 13]。植物表達系統在基因表達與修飾及安全性方面有特別的優勢，而且植物可以利用天然的原材料制造自身的氨基酸。目前，已成功在煙草(Nicotiana tabacum L.)、馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)、擬南芥(Arabidopsis thaliana L.)等植物體中表達或分離得到了重組蛛絲蛋白，但是到目前為止，還沒能利用從植物中獲得的重組蛛絲蛋白制造出高強度纖維。動物細胞能克服原核表達系統中發生的蛛絲蛋白基因在表達過程中出現的轉錄、翻譯等提前終止的現象，表達量也比其它載體系統有很大的提高。通過轉基因技術，利用家蠶(Bombyx mori)表達分泌和紡絲系統生產重組蜘蛛絲纖維的研究方興未艾[14]。但由于動物細胞和植物細胞表達系統均存在培養難度大及大規模生產成本高的缺陷，因此近年來采用微生物發酵方法進行表達的方式因技術相對成熟，且易于規模化大生產受到廣泛關注。隨著重組蛋白表達技術方法的不斷改進，大腸桿菌(Escherichia coli)表達系統可有效表達的蛋白長度已有很大的提高。Xia等[15]用提高了glycyl-tRNA庫的大腸桿菌表達出與天然蛛絲蛋白大小相近的284.9 kD的重組絡新婦屬蛛絲蛋白，紡絲得到與天然蜘蛛絲機械性能接近的重組蛛絲。采用巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統表達重組蛛絲蛋白的研究也得到深入開展[16]，該表達系統可避免細菌表達系統普遍存在的缺點，并保證表達產物經過足夠的翻譯后修飾，包括羥基化和糖基化等。
研究者可通過人工方法，在體外對重組蛛絲蛋白進行加工，以賦予其特殊的性能，制備成新型的生物材料，包括納米纖維、薄膜、水凝膠、多孔海綿、微球及微膠囊等，最終可應用于藥物可控釋放、組織工程支架等材料[13]。此外，還可對重組蜘蛛絲蛋白進行化學以及基因工程修飾以產生新型功能聚合物[17]。本文對此加工制備、化學及基因工程修飾的過程及機制展開綜述。
1 重組蛛絲蛋白的加工
1.1 重組蛛絲蛋白纖維
通常成熟的天然蛛絲蛋白含有三重組成：一個非重復N末端結構域(在折疊部分約含130個氨基酸殘基[18])，一個由蛛絲特有的重復單元構成的廣泛區域，和一個約含110個氨基酸殘基的非重復折疊的C-末端結構域[19]。以牽引絲為例，牽引絲產生于成對的大壺狀腺，每一個大壺狀腺與一條通向位于腹部腹面的噴絲頭的S形的分泌道連接。蛋白產生后，經由單層上皮細胞外排入內腔。蛋白可以貯存于腺管腔作為紡絲原液，直到它們在分泌管的末端被轉換成固體纖維[20]。牽引絲的主要成分是兩種相似的牽引絲蛋白(major ampullate spidroin,MaSp)MaSp1和MaSp2，在絡新婦蛛，MaSp1均勻地出現在纖芯中，MaSp2并不在外圍出現，而是在某些核心區域形成集群。不同種蜘蛛的MaSp1和MaSp2在纖維中的比例不同，在同一種內不同個體間也不同，甚至于同一個體，在不同場合所紡的牽引絲也不同[21]。在重復區域中，由富含甘氨酸的重復段及緊隨其后的丙氨酸塊構成的串聯重復單位連續出現約100次，丙氨酸和甘氨酸是目前所知在蛛絲蛋白中含量最為豐富的氨基酸殘基，占整個序列的比例大于60%。一些特有的基序，如(Ala)n(n=6~14)、Gly-Gly-X和Gly-Pro-Gly-X-X(X為任意一種氨基酸)，構成纖維中特定的二級結構，分別為β-折疊、3I-螺旋和β-螺旋，它們與機械特性相關[13]。在其它蛋白質分子的共同參與下，丙氨酸塊可以在纖維中堆疊形成結晶結構的β-折疊。在纖維中結晶的水平取決于蛛絲蛋白中丙氨酸塊的比例，并與纖維的強度相關。此外，更多的富含甘氨酸區域中的無定形結構則與擴展性和靈活性相關。因此，重復區的性質決定了纖維的力學性能[13, 17]。經檢測，苗圃織網蜘蛛(Euprosthenops australis)是擁有最強牽引絲(拉伸強度=1.5 GPa)的蜘蛛之一，也擁有最長的多聚丙氨酸塊[22]，這些數據與上述理論相符。然而，之后的多聚丙氨酸納米晶體的分子動力學研究表明，含有約5至10個多聚丙氨酸殘基的晶體才能獲得最佳的整體機械性能[23]。此外，最近有研究者[10]提出，蜘蛛大壺狀腺絲蛋白除了無定形晶格以及分散其中的定向β-折疊的納米晶體兩種狀態以外，還存在一種中間狀態的β-折疊結構，這種中間狀態位于晶體的兩端，分析認為蜘蛛絲中的中間態β-折疊結構含量高可能與其強韌性相關。
總之，目前認為，影響蛛絲蛋白溶解和纖維形成的決定因素包括：①蛛絲蛋白高度濃縮原液在囊中的存儲，其形成可能涉及N-末端結構域，和發生在多聚丙氨酸片段折疊成α-螺旋時產生的靜電排斥力，而富含絲氨酸的C-末端結構域的極性性質和膠束的形成也可能為蛛絲蛋白的高水溶性做出了貢獻；②隨著pH值的降低(約低于6.4)和鹽的成分沿擠出管的改變，N-和C-末端結構域轉變成組裝介質，從而把蛛絲蛋白聚合在一起；③剪切力在收窄管中誘導了多聚丙氨酸從α-螺旋向β-折疊的轉換，使得大量的蛛絲蛋白迅速產生。這些事件最終將蛛絲蛋白轉變為由被更柔韌的富含甘氨酸區域包圍的結晶狀β-折疊構成的纖維[20]。基于這些影響因素，科研人員開展了以重組蛛絲蛋白模擬天然蛛絲形成的研究。
以重組蛛絲蛋白制備絲纖維，采用六氟異丙醇為溶劑在技術上較容易實現。將重組蛛絲蛋白溶解在六氟異丙醇中，控制其濃度在25%至30%(w/v)范圍，然后通過注射針頭擠入凝固浴(90%的異丙醇)中即可形成纖維。另一種方法是使用水性溶劑而不是有機溶劑，此過程參照蛛絲蛋白的天然屬性，通過模仿蜘蛛體內發生的過程實現仿生絲的自組裝。Rammensee 等[24]使用微流控裝置檢測溶劑和剪切力的變化，研究了對重組蛛絲蛋白纖維形成的影響因素，結果表明，疏水性強的工程蛛絲蛋白eADF4(engineered Araneus diadematus fibroin 4，47 kD，其特征在于只有一部分的重復域)形成球形顆粒，而親水性強的eADF3(engineered Araneus diadematus fibroin 3，106 kD，包括部分的重復結構域和羧基末端非重復結構域)在特定環境條件下形成了纖維。而如果在相分離前進行蛋白質的混合，eADF4也可以納入eADF3的絲纖維中。這項研究突出顯示，需要剪切力和pH同時轉換才能啟動纖維的組裝。重組蛛絲蛋白的聚合之所以顯著受到剪切力的影響，關鍵在于C-末端結構域。C-末端在結構上是一種二聚體平行五螺旋束，帶C-末端的eADF3更容易發生聚合，而類似大小的不含C-末端結構域的蛋白則不易發生聚合，這顯示了帶C-末端的eADF3在剪切應力下有進一步增加蛋白質聚合的傾向，其結果有可能以對齊的β-折疊方式產生較長的纖維狀結構，若不存在C-末端，則僅僅形成無取向的含不明確β-折疊片的聚集體。因此，C-末端的這種正確定位重復區域的行為，可以保證有序的纖維狀集合體的形成[19]。此外，重組蛛絲蛋白的N-末端受控于pH值的變化。挪威奧斯陸大學Askarieh等[18]將苗圃織網蜘蛛牽引絲MaSp1蛋白的N-末端區域連接到了小型蛛絲蛋白上，此N-末端區域為一個兩極性的同源二聚體，由反向平行的5個非同源螺旋亞基組成，當溶液的pH值從7.2降低到6.0時，N-末端結構域發生二聚化，這意味著N-末端對pH值的變化高度敏感，這一pH值變化現象也發生在蜘蛛的紡絲腺中[18, 25]。
近來，采用靜電紡絲法仿生制備蜘蛛絲纖維被認為具有良好的應用前景。將重組蜘蛛絲蛋白(如MaSp1蛋白)置于含有Tris緩沖液及鹽的尿素中制得紡絲原液，然后通過靜電紡絲法制得蜘蛛絲纖維，成品直徑為10~60 μm，分子取向及機械性能與天然的蜘蛛絲相當[26]。
1.2 其它形貌的重組蛛絲蛋白
除了纖維，還可以利用水溶液或有機溶劑，再加上其它條件如pH、溫度、蛋白質濃度、離子強度和成分等，將重組蛛絲蛋白加工成不同的形貌。通過對上述條件的多功能組合，已成功制備微球、薄膜、膠囊和水凝膠等[17]。
1.2.1 重組蛛絲蛋白微球
可以通過兩種方法加工制備重組蛛絲蛋白微球，一種是通過溶劑與蛋白質之間關聯的親水性，另一種是通過鹽析過程。第一種方法被用于來自棒絡新婦(Nephila clavata L.)的MaSp1重組蛛絲蛋白，它包含1到6個重復模塊。在這種蛛絲蛋白中，隨著富含丙氨酸塊重復的次數增加β-折疊的含量也增加，而球體的形成與溶劑的環境相關，在水中，而不是在異丙醇中，較短的蛋白質也可形成球體[27]。第二種方法被用于eADF4，其可在僅高于臨界的磷酸鉀緩沖液的濃度下獨立地形成微球，球體形成后緊隨著一個鹽析過程，這是一個液-液相的分離過程，在蛋白質富集階段，首先形成一個核心，這一核心誘導了伴隨微球生長而產生的關聯蛋白的結構轉變。當蛋白質富集階段中的蛋白質濃度低于平衡的溶解度時微球停止生長，至此，球體直徑不再進一步增加。已有實驗證實，球體的大小(250 nm~3 μm)取決于蛋白質濃度和混合條件[28]。
微球將是一類具有多種潛在應用價值的新型材料，例如，可以作為藥物輸送系統，將水溶性藥物或水不溶性藥物封裝入微球實現藥物輸送[29-30]。以eADF4為例，由于eADF4以可溶性形式伸展，使得其容易與疏水性表面發生相互作用，因此，一種可能的應用是將水不溶性藥物(如β-胡蘿卜素)封裝入膠囊。首先，可溶性eADF4保證了由β-胡蘿卜素顆粒所形成膠體的穩定，之后是誘導了裝載著β-胡蘿卜素的eADF4微球的形成，然后，隨著腸液對eADF4蛋白微球的消化降解，β-胡蘿卜素得以釋放，而微球在胃液中是保持不變的。這類控釋方式突出了絲制微球作為藥物輸送系統的潛在用途，保證了藥物在胃內的完好和在小腸中的釋放[31]。另外，微球也可用于封裝水溶性藥物。帶正凈電荷的水溶性小分子在靜電相互作用驅使下，可以擴散到帶負電荷的蜘蛛絲蛋白基質中。有幾個模型藥物已得到應用，其裝載效率依賴于藥物分子的屬性，如分配系數和離解常數。此外，關于絲蛋白載體的裝卸效率，釋放動力學和生物降解的研究證明了蛛絲蛋白微球作為藥物載體的潛力，因為作為藥物載體，其物理韌性足夠保證生物降解的緩慢發生[29]。
1.2.2 重組蛛絲蛋白薄膜
可以通過蒸發掉重組蛛絲蛋白溶液中的溶劑后獲得薄膜，溶劑既可以是水，也可以是有機溶劑，溶劑的性質可影響薄膜的結構[32]。常用的溶劑是水相緩沖液，六氟異丙醇和甲酸，已應用于幾種重組蛛絲蛋白薄膜的澆鑄。從六氟異丙醇溶液中澆鑄的蛋白膜的二級結構主要是α-螺旋和無規卷曲，類似于從相同的溶劑或水溶液中澆鑄的蠶絲素膜，而從甲酸溶液制備的薄膜中則含有豐富的β-折疊結構[33]。對富含α-螺旋/無規卷曲的由甲醇溶液或含離液序列低的磷酸根離子的溶液制備的薄膜，進行后處理會導致蛋白質脫水，誘導富含β-折疊結構的形成。值得注意的是，β-折疊豐富的膜在水中很穩定，甚至可抵抗非常強的蛋白變性劑如8 mol/L尿素或6 mol/L鹽酸胍的溶解，從而具備接近天然牽引絲纖維的化學穩定性。一般情況下，增加β-折疊含量可導致彈性模量增加，但彈性下降。不過，也有不同的觀點，Renault等[34]在對溶解的蜘蛛大壺狀絲纖維在空氣-水界面形成的界面膜研究時發現：最終的β-折疊片的含量主要取決于一級結構，而不是后續的形成過程。在其研究中，分子量似乎也是一個關鍵因素，因為由天然蛛絲蛋白制備的的界面膜在強度和黏度上分別大約是以較短的重組蛋白制備的膜的7倍和3倍，因此重組蛋白雖然與天然蜘蛛絲蛋白相似，但其自組裝成具有優異機械性能有序材料的能力更弱。
蜘蛛絲膜的機械性能，還會由于環境的相對濕度和添加吸濕性增塑劑而變得更有彈性，比如，添加作為吸濕性增塑劑的甘油，可改變分子間的相互作用，從而增加膜的彈性。文獻顯示[33]：40%(w/v)的甘油含量使得一種eADF4膜的彈性增加了約十倍，但強度也略微下降。
1.2.3 重組蛛絲蛋白膠囊
兩親特性的基因工程蜘蛛絲蛋白可以在空氣/水或有機溶劑/水的界面處發生自發組裝[35]。在甲苯中乳化的eADF4水溶液導致了微米大小的膠囊的迅速形成，此過程只受控于蛋白質的擴散速率和與甲苯相互作用后形成的富含β-折疊的結構[36]。此過程可在30 s內完成，然后，通過離心分離得到可轉移到水溶液中的機械性能穩定的膠囊。這種形成膠囊的快速和有效的方法適用于對高分子量活性成分的包封。可以很方便地對微膠囊的大小(1～30 μm)進行調控，通過改變乳液中剪切速率實現對乳液液滴大小的調節，進而調控微膠囊的大小。由于膠囊是多孔的，小分子可以自由通過膜進行擴散，這些膠囊中活性物質的釋放可以通過控制蛛絲蛋白水解而觸發。
由于材料的強度、生物相容性和受控的降解或釋放行為與微球類似，蛛絲膠囊在靶向藥物輸送系統上具有較高的發展潛力[37]。
1.2.4 重組蛛絲蛋白水凝膠
以重組生產的蜘蛛絲蛋白eADF4制備水凝膠時，在低磷酸鉀濃度下經自組裝形成納米纖維，此為水凝膠的內在形式，在高磷酸鉀濃度下形成微球，在中等磷酸鉀濃度下則這兩種形貌共存。原因是低濃度的磷酸鉀(<300 mmol/L)抑制了eADF4中帶負電荷的谷氨酸殘基間的庫侖斥力，導致eADF4自組裝成納米原纖維。原子力顯微鏡分析顯示，風干的絲原纖維的直徑為(3.3±1)nm，類似于淀粉樣原纖維。FT-IR光譜和X-射線衍射圖譜也證實存在淀粉樣的β-交聯結構，在β-交聯結構中，β-折疊以氫鍵鍵合，并與纖維軸垂直。納米纖維似乎是半柔性的，其持續長度與本身的長度處于同一數量級[38]。許多納米纖維似乎也通過物理交聯(疏水相互作用)組裝成分支化結構，導致水凝膠的形成，實現對溶劑化水的固定，這種自組裝形成的水凝膠會被攪拌或剪切所破壞[39]。由于蜘蛛絲水凝膠穩定的時間超過了數周，并且即使在低體積分數下也具有高的彈性模量，因此非常適用于多種不同的組織工程應用[40]。此外，重組蛋白濃度、化學交聯劑、熒光素等在水凝膠的形成中起重要作用，Rammensee等[39]以過氧二硫酸銨和三(2，2′-聯吡啶)二氯化釕(II)(一種光誘導交聯劑)化學交聯制備水凝膠，控制重組蛋白濃度為10 mg/mL，產生了具有線性材料響應的、穩定的、并具更大模量和強度的水凝膠。Schacht等[41]則證明熒光素可強烈影響水凝膠性質(如孔隙體積和力學性能)及其形成過程。
2 重組蜘蛛絲蛋白的修飾
重組蜘蛛絲蛋白普遍以牽引絲的序列基序，如聚丙氨酸、Gly-Gly-Xaa和Gly-Pro-Gly-Xaa-Xaa(X為任意一種氨基酸)為主體構成，除此以外，還可通過化學以及基因工程修飾對其特性進行微調，以確保修飾后的蛋白質的潛在應用價值。
2.1 重組蜘蛛絲蛋白的化學修飾
在水溶液中蛛絲蛋白的核心域是伸展的，使得對蛛絲蛋白的化學修飾變得簡化，在溶液中的耦合也有利于小功能分子摻入到大的材料中。對蛛絲進一步加工后再進行耦合則對于固定較大的分子有意義，例如，對于敏感的酶，其活性必須得到保存以實現后續功能。修飾的位點在于重組蛛絲蛋白羧基端的谷氨酸和天冬氨酸殘基，以及羥基端的絲氨酸和酪氨酸殘基。針對此修飾位點，通過碳化二亞胺/羥基琥珀酰亞胺介導，可以在eADF4制成的膜表面耦合上模擬酶β-半乳糖苷酶，或通過使用碳二亞胺活化的乙二胺鏈接器，熒光素-5-異硫氰酸酯也被錨定在eADF4膜的表面[42]。
對于不含有反應性側鏈蛋白質的化學修飾，則可通過基因工程方法，在不能發生化學修飾的初始蛋白上引入某種天然的反應性基團來實現。可采用通過兩個獨立的路徑引入含有半胱氨酸的模塊實現對eADF4的修飾，一種方法是對eADF4的基本重復模塊中的絲氨酸殘基用半胱氨酸殘基替換，這樣的新模塊可以添加到現有蛋白質的任一端。另一種方法是融合一個含一個半胱氨酸殘基的柔性肽鏈所組成的N-末端標記，此半胱氨酸以及蛋白質可以通過具有較高特異性的硫醇基團進行化學修飾[42]。已經采用此基因工程方法實現對膜的修飾，將β-半乳糖苷酶固定至膜上，此膜可以作為新型生物傳感器應用于生命科學領域[43]。
2.2 重組蜘蛛絲蛋白的基因工程修飾
除了化學方法，重組蜘蛛絲蛋白的功能特性可以在分子水平上通過用功能肽或蛋白質的序列與絲的序列進行融合加以擴展[44]。這種混合絲不僅可獲得新的、完整的功能，還避免了之后的化學修飾步驟。為獲得強度與天然蜘蛛絲纖維相當的重組蜘蛛絲蛋白采用了若干種修飾方法，例如：利用轉基因蠶表達蠶/蜘蛛嵌合絲蛋白，重組的蛛絲能穩定地嵌合到其吐出的蠶絲中，而且，這種復合絲纖維的韌性平均而言比親本家蠶絲纖維強，甚至與天然的蜘蛛絲纖維相當[45]；利用蛋白質內含子的體外剪接反應，在體外讓融合蛋白質內含子的蛛絲蛋白相互剪接產生Flag蛋白的串聯體，可將產物分子量提高到約300 kD[46]，從而提高重組蛛絲蛋白的分子量。為獲得具有形狀記憶功能的新型聚合物，可通過耦合反應將短鏈聚丙氨酸(short-chain polyalanine，PA)引入至含有聚ε-己內酯段的多塊生物高聚物中，生物高聚物中的PA段形成與天然蛛絲蛋白類似的β-折疊片的結晶，這些新的生物高聚物呈現近乎完整的形狀恢復能力和極高的形狀固定性，以及顯著改善的熱穩定性[47]。為獲得抗菌功能的生物醫學涂料，可將銀結合短肽與來自金紡蜘蛛蛛絲的序列結合構建基因工程融合蛋白，在此，絲蛋白提供了一個穩定的模板，可以被加工成薄膜、纖維和三維支架，所得絲制膜可以抑制革蘭陽性和革蘭陰性細菌在瓊脂平板上，以及在液體培養基中的生長[48]。為實現對被重金屬鈾污染環境的修復，可在金紡蜘蛛的絲蛋白上重復嵌合源于第四雙小核草履蟲的發生了33個殘基突變的鈣調蛋白的鈾肽識別基序，得到的蛛絲嵌合蛋白可以富集鈾，再利用酶對絲蛋白進行消化，最終實現鈾的回收[49]。
3 總結與展望
重組蛛絲蛋白既能加工成高性能纖維，又能加工成薄膜、水凝膠、多孔海綿、微球及微膠囊等多種非纖維狀形貌，加之其優良的生物相容性和低免疫原性，是理想的生物醫學材料，因此，這些材料在細胞培養和藥物輸送等領域的應用研究正在有條不紊的進行中。此外，對蛛絲分子結構的理解也激發了科研工作者的廣泛研究，通過利用蛛絲的重復模塊與其他化學基序相結合以開發新型材料。最后，蛛絲的分子組裝過程也激發了對基于這些概念的材料領域的研究，即人們試圖利用相似的組裝機制仿生制備新型高性能材料[50]。對蜘蛛絲及其應用的研究可能會在未來很長一段時間持續，因為這是一個有趣的和有競爭力的研究領域。
引言
蛛絲是目前已知的最為堅韌的天然纖維之一[1]。優良的機械性能使蜘蛛絲具備高性能復合材料的潛質，可應用于工業、國防軍事、航空航天等領域[2]，加之良好的生物相容性和生物可降解性，令其在生物醫學材料如藥物控釋載體、手術縫合線、細胞培養支架、器官移植等方面的應用研究也得到越來越多的開展[3-5]。雖然蜘蛛絲的應用前景廣闊，但由于蜘蛛同類相食，使其無法象蠶那樣群體飼養，且天然蜘蛛絲的產量較低以至于難以大量收集，限制了對蜘蛛絲的研究和利用[6-7]，因此，蛛絲蛋白的重組生產顯得尤為迫切。
國內外科研工作者多以園蛛屬的十字園蛛(Araneus diadematus)和絡新婦屬的金紡蜘蛛(Nephila clavipe)為研究對象，因其大壺狀腺產生的牽引絲和鞭毛狀腺產生的橫絲相對易得且力學性能優異。相比較而言，大壺狀腺所產牽引絲在強度和彈性上具有綜合性能好的特點，鞭毛狀腺所產橫絲上有微小的膠滴包裹，致使其剛性低而彈性強。近些年對蛛絲蛋白序列及結構的研究已取得很大進展，但由于蛛絲蛋白基因序列較長且多重復序列，使得獲得的基因序列大多不完整，尤其對于編碼絲蛋白的cDNA序列，往往只獲得了基因結構的部分信息。而且，不同蛛絲蛋白中出現的重復序列結構和重復次數與蛛絲蛋白性能的關系還需要進一步闡明，有關C-末端和N-末端非重復序列對蛛絲蛋白基因的轉錄、翻譯及后加工，對蛛絲蛋白的二級結構及溶解性的影響，以及這些非重復序列在蛛絲纖維力學性能中發揮的作用也還需要更深入的研究[8]。同時，在這些研究成果的基礎上，進行了重組生產蛛絲蛋白的研究。多以牽引絲和鞭毛狀絲為研究對象，通過對其特征模塊[9-10]的改造和拼接，表達出串聯的重組蛛絲蛋白[11-12]。
科研工作者采用化學合成蛛絲蛋白基因或從蜘蛛絲腺cDNA文庫中克隆蛛絲蛋白基因，并選擇植物、動物及微生物等不同的表達系統進行重組蛛絲蛋白的表達，嘗試紡制性能優越的蛛絲蛋白纖維[6, 13]。植物表達系統在基因表達與修飾及安全性方面有特別的優勢，而且植物可以利用天然的原材料制造自身的氨基酸。目前，已成功在煙草(Nicotiana tabacum L.)、馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)、擬南芥(Arabidopsis thaliana L.)等植物體中表達或分離得到了重組蛛絲蛋白，但是到目前為止，還沒能利用從植物中獲得的重組蛛絲蛋白制造出高強度纖維。動物細胞能克服原核表達系統中發生的蛛絲蛋白基因在表達過程中出現的轉錄、翻譯等提前終止的現象，表達量也比其它載體系統有很大的提高。通過轉基因技術，利用家蠶(Bombyx mori)表達分泌和紡絲系統生產重組蜘蛛絲纖維的研究方興未艾[14]。但由于動物細胞和植物細胞表達系統均存在培養難度大及大規模生產成本高的缺陷，因此近年來采用微生物發酵方法進行表達的方式因技術相對成熟，且易于規模化大生產受到廣泛關注。隨著重組蛋白表達技術方法的不斷改進，大腸桿菌(Escherichia coli)表達系統可有效表達的蛋白長度已有很大的提高。Xia等[15]用提高了glycyl-tRNA庫的大腸桿菌表達出與天然蛛絲蛋白大小相近的284.9 kD的重組絡新婦屬蛛絲蛋白，紡絲得到與天然蜘蛛絲機械性能接近的重組蛛絲。采用巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統表達重組蛛絲蛋白的研究也得到深入開展[16]，該表達系統可避免細菌表達系統普遍存在的缺點，并保證表達產物經過足夠的翻譯后修飾，包括羥基化和糖基化等。
研究者可通過人工方法，在體外對重組蛛絲蛋白進行加工，以賦予其特殊的性能，制備成新型的生物材料，包括納米纖維、薄膜、水凝膠、多孔海綿、微球及微膠囊等，最終可應用于藥物可控釋放、組織工程支架等材料[13]。此外，還可對重組蜘蛛絲蛋白進行化學以及基因工程修飾以產生新型功能聚合物[17]。本文對此加工制備、化學及基因工程修飾的過程及機制展開綜述。
1 重組蛛絲蛋白的加工
1.1 重組蛛絲蛋白纖維
通常成熟的天然蛛絲蛋白含有三重組成：一個非重復N末端結構域(在折疊部分約含130個氨基酸殘基[18])，一個由蛛絲特有的重復單元構成的廣泛區域，和一個約含110個氨基酸殘基的非重復折疊的C-末端結構域[19]。以牽引絲為例，牽引絲產生于成對的大壺狀腺，每一個大壺狀腺與一條通向位于腹部腹面的噴絲頭的S形的分泌道連接。蛋白產生后，經由單層上皮細胞外排入內腔。蛋白可以貯存于腺管腔作為紡絲原液，直到它們在分泌管的末端被轉換成固體纖維[20]。牽引絲的主要成分是兩種相似的牽引絲蛋白(major ampullate spidroin,MaSp)MaSp1和MaSp2，在絡新婦蛛，MaSp1均勻地出現在纖芯中，MaSp2并不在外圍出現，而是在某些核心區域形成集群。不同種蜘蛛的MaSp1和MaSp2在纖維中的比例不同，在同一種內不同個體間也不同，甚至于同一個體，在不同場合所紡的牽引絲也不同[21]。在重復區域中，由富含甘氨酸的重復段及緊隨其后的丙氨酸塊構成的串聯重復單位連續出現約100次，丙氨酸和甘氨酸是目前所知在蛛絲蛋白中含量最為豐富的氨基酸殘基，占整個序列的比例大于60%。一些特有的基序，如(Ala)n(n=6~14)、Gly-Gly-X和Gly-Pro-Gly-X-X(X為任意一種氨基酸)，構成纖維中特定的二級結構，分別為β-折疊、3I-螺旋和β-螺旋，它們與機械特性相關[13]。在其它蛋白質分子的共同參與下，丙氨酸塊可以在纖維中堆疊形成結晶結構的β-折疊。在纖維中結晶的水平取決于蛛絲蛋白中丙氨酸塊的比例，并與纖維的強度相關。此外，更多的富含甘氨酸區域中的無定形結構則與擴展性和靈活性相關。因此，重復區的性質決定了纖維的力學性能[13, 17]。經檢測，苗圃織網蜘蛛(Euprosthenops australis)是擁有最強牽引絲(拉伸強度=1.5 GPa)的蜘蛛之一，也擁有最長的多聚丙氨酸塊[22]，這些數據與上述理論相符。然而，之后的多聚丙氨酸納米晶體的分子動力學研究表明，含有約5至10個多聚丙氨酸殘基的晶體才能獲得最佳的整體機械性能[23]。此外，最近有研究者[10]提出，蜘蛛大壺狀腺絲蛋白除了無定形晶格以及分散其中的定向β-折疊的納米晶體兩種狀態以外，還存在一種中間狀態的β-折疊結構，這種中間狀態位于晶體的兩端，分析認為蜘蛛絲中的中間態β-折疊結構含量高可能與其強韌性相關。
總之，目前認為，影響蛛絲蛋白溶解和纖維形成的決定因素包括：①蛛絲蛋白高度濃縮原液在囊中的存儲，其形成可能涉及N-末端結構域，和發生在多聚丙氨酸片段折疊成α-螺旋時產生的靜電排斥力，而富含絲氨酸的C-末端結構域的極性性質和膠束的形成也可能為蛛絲蛋白的高水溶性做出了貢獻；②隨著pH值的降低(約低于6.4)和鹽的成分沿擠出管的改變，N-和C-末端結構域轉變成組裝介質，從而把蛛絲蛋白聚合在一起；③剪切力在收窄管中誘導了多聚丙氨酸從α-螺旋向β-折疊的轉換，使得大量的蛛絲蛋白迅速產生。這些事件最終將蛛絲蛋白轉變為由被更柔韌的富含甘氨酸區域包圍的結晶狀β-折疊構成的纖維[20]。基于這些影響因素，科研人員開展了以重組蛛絲蛋白模擬天然蛛絲形成的研究。
以重組蛛絲蛋白制備絲纖維，采用六氟異丙醇為溶劑在技術上較容易實現。將重組蛛絲蛋白溶解在六氟異丙醇中，控制其濃度在25%至30%(w/v)范圍，然后通過注射針頭擠入凝固浴(90%的異丙醇)中即可形成纖維。另一種方法是使用水性溶劑而不是有機溶劑，此過程參照蛛絲蛋白的天然屬性，通過模仿蜘蛛體內發生的過程實現仿生絲的自組裝。Rammensee 等[24]使用微流控裝置檢測溶劑和剪切力的變化，研究了對重組蛛絲蛋白纖維形成的影響因素，結果表明，疏水性強的工程蛛絲蛋白eADF4(engineered Araneus diadematus fibroin 4，47 kD，其特征在于只有一部分的重復域)形成球形顆粒，而親水性強的eADF3(engineered Araneus diadematus fibroin 3，106 kD，包括部分的重復結構域和羧基末端非重復結構域)在特定環境條件下形成了纖維。而如果在相分離前進行蛋白質的混合，eADF4也可以納入eADF3的絲纖維中。這項研究突出顯示，需要剪切力和pH同時轉換才能啟動纖維的組裝。重組蛛絲蛋白的聚合之所以顯著受到剪切力的影響，關鍵在于C-末端結構域。C-末端在結構上是一種二聚體平行五螺旋束，帶C-末端的eADF3更容易發生聚合，而類似大小的不含C-末端結構域的蛋白則不易發生聚合，這顯示了帶C-末端的eADF3在剪切應力下有進一步增加蛋白質聚合的傾向，其結果有可能以對齊的β-折疊方式產生較長的纖維狀結構，若不存在C-末端，則僅僅形成無取向的含不明確β-折疊片的聚集體。因此，C-末端的這種正確定位重復區域的行為，可以保證有序的纖維狀集合體的形成[19]。此外，重組蛛絲蛋白的N-末端受控于pH值的變化。挪威奧斯陸大學Askarieh等[18]將苗圃織網蜘蛛牽引絲MaSp1蛋白的N-末端區域連接到了小型蛛絲蛋白上，此N-末端區域為一個兩極性的同源二聚體，由反向平行的5個非同源螺旋亞基組成，當溶液的pH值從7.2降低到6.0時，N-末端結構域發生二聚化，這意味著N-末端對pH值的變化高度敏感，這一pH值變化現象也發生在蜘蛛的紡絲腺中[18, 25]。
近來，采用靜電紡絲法仿生制備蜘蛛絲纖維被認為具有良好的應用前景。將重組蜘蛛絲蛋白(如MaSp1蛋白)置于含有Tris緩沖液及鹽的尿素中制得紡絲原液，然后通過靜電紡絲法制得蜘蛛絲纖維，成品直徑為10~60 μm，分子取向及機械性能與天然的蜘蛛絲相當[26]。
1.2 其它形貌的重組蛛絲蛋白
除了纖維，還可以利用水溶液或有機溶劑，再加上其它條件如pH、溫度、蛋白質濃度、離子強度和成分等，將重組蛛絲蛋白加工成不同的形貌。通過對上述條件的多功能組合，已成功制備微球、薄膜、膠囊和水凝膠等[17]。
1.2.1 重組蛛絲蛋白微球
可以通過兩種方法加工制備重組蛛絲蛋白微球，一種是通過溶劑與蛋白質之間關聯的親水性，另一種是通過鹽析過程。第一種方法被用于來自棒絡新婦(Nephila clavata L.)的MaSp1重組蛛絲蛋白，它包含1到6個重復模塊。在這種蛛絲蛋白中，隨著富含丙氨酸塊重復的次數增加β-折疊的含量也增加，而球體的形成與溶劑的環境相關，在水中，而不是在異丙醇中，較短的蛋白質也可形成球體[27]。第二種方法被用于eADF4，其可在僅高于臨界的磷酸鉀緩沖液的濃度下獨立地形成微球，球體形成后緊隨著一個鹽析過程，這是一個液-液相的分離過程，在蛋白質富集階段，首先形成一個核心，這一核心誘導了伴隨微球生長而產生的關聯蛋白的結構轉變。當蛋白質富集階段中的蛋白質濃度低于平衡的溶解度時微球停止生長，至此，球體直徑不再進一步增加。已有實驗證實，球體的大小(250 nm~3 μm)取決于蛋白質濃度和混合條件[28]。
微球將是一類具有多種潛在應用價值的新型材料，例如，可以作為藥物輸送系統，將水溶性藥物或水不溶性藥物封裝入微球實現藥物輸送[29-30]。以eADF4為例，由于eADF4以可溶性形式伸展，使得其容易與疏水性表面發生相互作用，因此，一種可能的應用是將水不溶性藥物(如β-胡蘿卜素)封裝入膠囊。首先，可溶性eADF4保證了由β-胡蘿卜素顆粒所形成膠體的穩定，之后是誘導了裝載著β-胡蘿卜素的eADF4微球的形成，然后，隨著腸液對eADF4蛋白微球的消化降解，β-胡蘿卜素得以釋放，而微球在胃液中是保持不變的。這類控釋方式突出了絲制微球作為藥物輸送系統的潛在用途，保證了藥物在胃內的完好和在小腸中的釋放[31]。另外，微球也可用于封裝水溶性藥物。帶正凈電荷的水溶性小分子在靜電相互作用驅使下，可以擴散到帶負電荷的蜘蛛絲蛋白基質中。有幾個模型藥物已得到應用，其裝載效率依賴于藥物分子的屬性，如分配系數和離解常數。此外，關于絲蛋白載體的裝卸效率，釋放動力學和生物降解的研究證明了蛛絲蛋白微球作為藥物載體的潛力，因為作為藥物載體，其物理韌性足夠保證生物降解的緩慢發生[29]。
1.2.2 重組蛛絲蛋白薄膜
可以通過蒸發掉重組蛛絲蛋白溶液中的溶劑后獲得薄膜，溶劑既可以是水，也可以是有機溶劑，溶劑的性質可影響薄膜的結構[32]。常用的溶劑是水相緩沖液，六氟異丙醇和甲酸，已應用于幾種重組蛛絲蛋白薄膜的澆鑄。從六氟異丙醇溶液中澆鑄的蛋白膜的二級結構主要是α-螺旋和無規卷曲，類似于從相同的溶劑或水溶液中澆鑄的蠶絲素膜，而從甲酸溶液制備的薄膜中則含有豐富的β-折疊結構[33]。對富含α-螺旋/無規卷曲的由甲醇溶液或含離液序列低的磷酸根離子的溶液制備的薄膜，進行后處理會導致蛋白質脫水，誘導富含β-折疊結構的形成。值得注意的是，β-折疊豐富的膜在水中很穩定，甚至可抵抗非常強的蛋白變性劑如8 mol/L尿素或6 mol/L鹽酸胍的溶解，從而具備接近天然牽引絲纖維的化學穩定性。一般情況下，增加β-折疊含量可導致彈性模量增加，但彈性下降。不過，也有不同的觀點，Renault等[34]在對溶解的蜘蛛大壺狀絲纖維在空氣-水界面形成的界面膜研究時發現：最終的β-折疊片的含量主要取決于一級結構，而不是后續的形成過程。在其研究中，分子量似乎也是一個關鍵因素，因為由天然蛛絲蛋白制備的的界面膜在強度和黏度上分別大約是以較短的重組蛋白制備的膜的7倍和3倍，因此重組蛋白雖然與天然蜘蛛絲蛋白相似，但其自組裝成具有優異機械性能有序材料的能力更弱。
蜘蛛絲膜的機械性能，還會由于環境的相對濕度和添加吸濕性增塑劑而變得更有彈性，比如，添加作為吸濕性增塑劑的甘油，可改變分子間的相互作用，從而增加膜的彈性。文獻顯示[33]：40%(w/v)的甘油含量使得一種eADF4膜的彈性增加了約十倍，但強度也略微下降。
1.2.3 重組蛛絲蛋白膠囊
兩親特性的基因工程蜘蛛絲蛋白可以在空氣/水或有機溶劑/水的界面處發生自發組裝[35]。在甲苯中乳化的eADF4水溶液導致了微米大小的膠囊的迅速形成，此過程只受控于蛋白質的擴散速率和與甲苯相互作用后形成的富含β-折疊的結構[36]。此過程可在30 s內完成，然后，通過離心分離得到可轉移到水溶液中的機械性能穩定的膠囊。這種形成膠囊的快速和有效的方法適用于對高分子量活性成分的包封。可以很方便地對微膠囊的大小(1～30 μm)進行調控，通過改變乳液中剪切速率實現對乳液液滴大小的調節，進而調控微膠囊的大小。由于膠囊是多孔的，小分子可以自由通過膜進行擴散，這些膠囊中活性物質的釋放可以通過控制蛛絲蛋白水解而觸發。
由于材料的強度、生物相容性和受控的降解或釋放行為與微球類似，蛛絲膠囊在靶向藥物輸送系統上具有較高的發展潛力[37]。
1.2.4 重組蛛絲蛋白水凝膠
以重組生產的蜘蛛絲蛋白eADF4制備水凝膠時，在低磷酸鉀濃度下經自組裝形成納米纖維，此為水凝膠的內在形式，在高磷酸鉀濃度下形成微球，在中等磷酸鉀濃度下則這兩種形貌共存。原因是低濃度的磷酸鉀(<300 mmol/L)抑制了eADF4中帶負電荷的谷氨酸殘基間的庫侖斥力，導致eADF4自組裝成納米原纖維。原子力顯微鏡分析顯示，風干的絲原纖維的直徑為(3.3±1)nm，類似于淀粉樣原纖維。FT-IR光譜和X-射線衍射圖譜也證實存在淀粉樣的β-交聯結構，在β-交聯結構中，β-折疊以氫鍵鍵合，并與纖維軸垂直。納米纖維似乎是半柔性的，其持續長度與本身的長度處于同一數量級[38]。許多納米纖維似乎也通過物理交聯(疏水相互作用)組裝成分支化結構，導致水凝膠的形成，實現對溶劑化水的固定，這種自組裝形成的水凝膠會被攪拌或剪切所破壞[39]。由于蜘蛛絲水凝膠穩定的時間超過了數周，并且即使在低體積分數下也具有高的彈性模量，因此非常適用于多種不同的組織工程應用[40]。此外，重組蛋白濃度、化學交聯劑、熒光素等在水凝膠的形成中起重要作用，Rammensee等[39]以過氧二硫酸銨和三(2，2′-聯吡啶)二氯化釕(II)(一種光誘導交聯劑)化學交聯制備水凝膠，控制重組蛋白濃度為10 mg/mL，產生了具有線性材料響應的、穩定的、并具更大模量和強度的水凝膠。Schacht等[41]則證明熒光素可強烈影響水凝膠性質(如孔隙體積和力學性能)及其形成過程。
2 重組蜘蛛絲蛋白的修飾
重組蜘蛛絲蛋白普遍以牽引絲的序列基序，如聚丙氨酸、Gly-Gly-Xaa和Gly-Pro-Gly-Xaa-Xaa(X為任意一種氨基酸)為主體構成，除此以外，還可通過化學以及基因工程修飾對其特性進行微調，以確保修飾后的蛋白質的潛在應用價值。
2.1 重組蜘蛛絲蛋白的化學修飾
在水溶液中蛛絲蛋白的核心域是伸展的，使得對蛛絲蛋白的化學修飾變得簡化，在溶液中的耦合也有利于小功能分子摻入到大的材料中。對蛛絲進一步加工后再進行耦合則對于固定較大的分子有意義，例如，對于敏感的酶，其活性必須得到保存以實現后續功能。修飾的位點在于重組蛛絲蛋白羧基端的谷氨酸和天冬氨酸殘基，以及羥基端的絲氨酸和酪氨酸殘基。針對此修飾位點，通過碳化二亞胺/羥基琥珀酰亞胺介導，可以在eADF4制成的膜表面耦合上模擬酶β-半乳糖苷酶，或通過使用碳二亞胺活化的乙二胺鏈接器，熒光素-5-異硫氰酸酯也被錨定在eADF4膜的表面[42]。
對于不含有反應性側鏈蛋白質的化學修飾，則可通過基因工程方法，在不能發生化學修飾的初始蛋白上引入某種天然的反應性基團來實現。可采用通過兩個獨立的路徑引入含有半胱氨酸的模塊實現對eADF4的修飾，一種方法是對eADF4的基本重復模塊中的絲氨酸殘基用半胱氨酸殘基替換，這樣的新模塊可以添加到現有蛋白質的任一端。另一種方法是融合一個含一個半胱氨酸殘基的柔性肽鏈所組成的N-末端標記，此半胱氨酸以及蛋白質可以通過具有較高特異性的硫醇基團進行化學修飾[42]。已經采用此基因工程方法實現對膜的修飾，將β-半乳糖苷酶固定至膜上，此膜可以作為新型生物傳感器應用于生命科學領域[43]。
2.2 重組蜘蛛絲蛋白的基因工程修飾
除了化學方法，重組蜘蛛絲蛋白的功能特性可以在分子水平上通過用功能肽或蛋白質的序列與絲的序列進行融合加以擴展[44]。這種混合絲不僅可獲得新的、完整的功能，還避免了之后的化學修飾步驟。為獲得強度與天然蜘蛛絲纖維相當的重組蜘蛛絲蛋白采用了若干種修飾方法，例如：利用轉基因蠶表達蠶/蜘蛛嵌合絲蛋白，重組的蛛絲能穩定地嵌合到其吐出的蠶絲中，而且，這種復合絲纖維的韌性平均而言比親本家蠶絲纖維強，甚至與天然的蜘蛛絲纖維相當[45]；利用蛋白質內含子的體外剪接反應，在體外讓融合蛋白質內含子的蛛絲蛋白相互剪接產生Flag蛋白的串聯體，可將產物分子量提高到約300 kD[46]，從而提高重組蛛絲蛋白的分子量。為獲得具有形狀記憶功能的新型聚合物，可通過耦合反應將短鏈聚丙氨酸(short-chain polyalanine，PA)引入至含有聚ε-己內酯段的多塊生物高聚物中，生物高聚物中的PA段形成與天然蛛絲蛋白類似的β-折疊片的結晶，這些新的生物高聚物呈現近乎完整的形狀恢復能力和極高的形狀固定性，以及顯著改善的熱穩定性[47]。為獲得抗菌功能的生物醫學涂料，可將銀結合短肽與來自金紡蜘蛛蛛絲的序列結合構建基因工程融合蛋白，在此，絲蛋白提供了一個穩定的模板，可以被加工成薄膜、纖維和三維支架，所得絲制膜可以抑制革蘭陽性和革蘭陰性細菌在瓊脂平板上，以及在液體培養基中的生長[48]。為實現對被重金屬鈾污染環境的修復，可在金紡蜘蛛的絲蛋白上重復嵌合源于第四雙小核草履蟲的發生了33個殘基突變的鈣調蛋白的鈾肽識別基序，得到的蛛絲嵌合蛋白可以富集鈾，再利用酶對絲蛋白進行消化，最終實現鈾的回收[49]。
3 總結與展望
重組蛛絲蛋白既能加工成高性能纖維，又能加工成薄膜、水凝膠、多孔海綿、微球及微膠囊等多種非纖維狀形貌，加之其優良的生物相容性和低免疫原性，是理想的生物醫學材料，因此，這些材料在細胞培養和藥物輸送等領域的應用研究正在有條不紊的進行中。此外，對蛛絲分子結構的理解也激發了科研工作者的廣泛研究，通過利用蛛絲的重復模塊與其他化學基序相結合以開發新型材料。最后，蛛絲的分子組裝過程也激發了對基于這些概念的材料領域的研究，即人們試圖利用相似的組裝機制仿生制備新型高性能材料[50]。對蜘蛛絲及其應用的研究可能會在未來很長一段時間持續，因為這是一個有趣的和有競爭力的研究領域。