革蘭陰性菌細胞外膜成分脂多糖對于維持細菌的結構完整性非常重要。脂多糖被稱為內毒素,是革蘭陰性菌致病的物質基礎。脂多糖由三部分組成,包括O-特異多糖、核心多糖和類脂A,類脂A是脂多糖的毒性中心。脂多糖可導致機體發生嚴重感染,引起局部或全身性病理生理反應。脂多糖的毒性作用是通過其介導的信號途徑導致機體產生強烈免疫應答引起的。目前,對于脂多糖信號通路中的相關蛋白及受體的研究已取得了一定的進展。本文綜述了脂多糖及其所介導信號通路中主要相關蛋白及受體的研究現狀。
引用本文： 王嘉榕, 李燕, 孫紅賓. 脂多糖——針對革蘭陰性菌的藥物靶標. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(4): 910-913. doi: 10.7507/1001-5515.20150162 復制
引言
脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是所有革蘭陰性細菌外膜的主要組成部分，維持了細菌的結構完整性，并保護細菌膜免受某些化學物質的攻擊。LPS被稱為內毒素，是革蘭陰性菌主要致病成分，可引起強烈免疫反應，導致幾乎所有的真核細胞發生形態、代謝和基因表達變化，刺激宿主細胞因子失控性表達，發生嚴重感染[1-3]。敗血癥就是由LPS引發的重要疾病之一，敗血癥發作時，患者體內LPS濃度將極大提高，以至于身體出現災難性的炎癥反應。大量實驗證實，LPS、LPS結合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein，LBP)和LPS受體系統參與了炎癥反應的病理生理過程[4-5]，且LBP/LPS受體是體內增敏LPS細胞效應的重要系統。本文將LPS及LPS介導的信號通路中主要相關蛋白及受體的研究現狀作一概述。
1 LPS的結構
革蘭陰性細菌LPS由三部分組成，①是O-特異多糖(O-antigen)，由長度特定的重復單位首尾相連形成不同聚合度的聚合物，因細菌不同而存在差異，且通常具有良好的抗原性，又稱之為“O-抗原”；②是核心多糖，由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脫氧辛酸(KDO)組成，所有革蘭陰性菌都含有這種(在細菌種間略有差異)組分；③是類脂A(lipid A)，所有革蘭陰性菌的類脂A結構基本相似，也是其產生“毒性”的物質基礎[6]。對缺乏O-特異多糖僅由類脂A與核心多糖組成的LPS稱為粗糙型LPS，即Rough-LPS(R-LPS)，相反含有一定數量O-特異多糖的LPS稱為光滑型LPS，即Smooth-LPS(S-LPS)。E. coli O111來源的LPS對人巨噬細胞會產生不同的效應，表現在R-LPS和S-LPS具有不同的生物學活性；在體外，R-LPS激活人巨噬細胞先天性免疫應答更占優勢[7]。
2 類脂A結構的多樣性
類脂A是LPS的疏水性基團，可以將親水性的核心多糖和O-抗原黏附在革蘭陰性細菌外表面構成完整的細胞外膜。另外，類脂A也是LPS的活性成分，其結構在同一細菌的不同菌株之間比較保守。同時，類脂A的結構也富于多樣性，在不同種類的細菌中，類脂A 結構在細節上會有所不同。類脂A基本組成單位是以1′-6糖苷鍵相聯的D-葡萄糖胺雙糖，其中一個糖基的5位上連著核心寡糖，兩個糖基的1和4位上的羥基被磷酸取代，其他位置上的羥基和胺基都被脂肪酸取代。類脂A結構的修飾主要包括脂肪酸鏈和磷酸基團的修飾。除此之外，類脂A的形態也與LPS的生物學活性相關，Netea等[8]提出，類脂A圓錐形構象比圓柱形更具活性。Li等[9]的實驗結果表明，類脂A酰化水平越低，其對細胞膜的穿透能力更強，酰化程度也影響LPS誘導的細胞因子水平。
3 LPS信號通路主要相關受體
大量研究表明，由LPS所介導信號通路中的主要相關蛋白有LBP、白細胞分化抗原14(cluster of differentiation antigen 14，CD14)、髓樣分化因子2(myeloid differentiation factor 2，MD-2)、Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)等。其中，LBP為急相蛋白，能將LPS轉運到CD14并形成三元復合物[10]；CD14作為LPS/LBP復合物受體，介導LPS性細胞反應，且CD14還能調控TLR4依賴性的LPS內吞作用[11-12]；MD-2為分泌型糖蛋白，是LPS激活TLR4受體的細胞外銜接蛋白[13]；TLR4受體屬I型跨膜蛋白，與MD-2組成LPS受體復合物完成LPS信號轉導[14]。另外，近年來有研究者提出細胞質內也存在LPS受體，LPS與細胞內受體的結合可激活炎性酶Caspase-11，進而啟動巨噬細胞中的自我毀滅程序[15]。
3.1 LBP和CD14
血漿中的LBP在LPS轉運及其介導的細胞應答中發揮了重要作用。LBP是一種分子量為58~60 kDa的糖蛋白，可在多種動物體內合成，且不同動物種屬之間具有高度同源性，其主要由肝臟合成和分泌。當機體發生炎癥(如細菌性敗血癥)時，LBP在血漿中含量顯著增加，是陽性急相蛋白成分之一[16-17]。當細胞對LPS產生應答反應時，LBP可作為LPS發揮生物學功能的重要載體，即LBP將LPS單體從其聚集體中轉運到CD14，催化LPS與CD14的結合[18]。CD14可作為LPS/LBP復合物受體，介導LPS性細胞反應。CD14以兩種形式存在，即膜結合(membrane-bound CD14，mCD14)和可溶性CD14(soluble CD14，sCD14)。mCD14是一種53 kDa的糖蛋白，通過糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol,GPI)尾巴錨固于成熟的髓源性細胞膜表面；sCD14分布于動物血漿中，無GPI結構，分子量為48 kDa[19]。Kim等[20]首次解析了小鼠CD14的晶體結構，結構顯示其N-末端馬蹄形區域中含有一個大的疏水性口袋，此口袋邊緣富含正電荷氨基酸殘基，是LPS的結合位點。Kelley等[21]解析了人CD14晶體結構，與小鼠晶體結構非常相似，但與小鼠CD14的二聚體晶體結構相比，人CD14以單體形式結晶，其N-末端口袋伸展性更強，且口袋邊緣的氨基酸殘基也與小鼠CD14不同，反映了人CD14結合配體及細胞激活方式與小鼠CD14存在差異，這種差異可能與種屬相關。此外，有研究者發現CD14的N-末端在與LPS結合過程中也有部分親水性區域的參與[22]。CD14結構中不含有跨膜區，所以CD14自身不能完成LPS信號傳輸，需將LPS轉運到LPS受體復合物TLR4/MD-2，進而引起細胞對LPS一系列應答反應。然而，Watanabe等[23]的研究結果顯示：敲除CD14的小鼠能夠對LPS脂質體產生免疫應答，表明細胞中還存在CD14非依賴性的LPS-TLR4信號通路。
3.2 MD-2
MD-2作為LPS激活TLR4受體的細胞外接頭蛋白，在LPS信號通路中表現出重要的生物學功能。MD-2 cDNA可編碼160個氨基酸殘基，其分子量為25~30 kDa。MD-2是一種分泌型糖蛋白，能被表達MD-2 的細胞直接分泌到細胞外，也能通過與TLR4 胞外區結合而定位于細胞表面。Visintin等[24]提出MD-2誘導TLR4受體的聚集對于LPS信號轉導起決定性作用，實驗中還發現，MD-2結構中的K128和K132在其與LPS結合過程中必不可少，但它們與TLR4的結合無關。另外，Da等[25]提出，MD-2有Asn26和Asn114兩個N-糖基化位點，實驗結果表明糖基化在MD-2 的分泌中不起重要作用，但其在LPS誘導的細胞因子通路中發揮重要功能。MD-2發揮功能還與其自身酪氨酸磷酸化相關，有研究者發現，MD-2的酪氨酸磷酸化發生在其轉運過程中而非細胞表面，并確定了其酪氨酸磷酸化位點Y22和Y131，將其突變后，蛋白磷酸化水平明顯減少，特別是影響了MD-2對NF-КB的激活[26]。
3.3 TLR4受體依賴性途徑
TLR是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁，也是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質分子。TLR共有13個成員(TLR1~13)，屬于I型跨膜蛋白，可分為胞外區、胞漿區和跨膜區三部分，其胞外區結構富含亮氨酸重復序列，負責識別不同的病原分子；胞漿區則負責受體活化后的信號轉導[14]。
TLR4是革蘭陰性菌LPS信號通路受體的一個組成部分，且在由LPS引發的信號傳導進入胞內過程中起重要作用。Park等[27]對TLR4/MD-2復合物結構進行了研究，LPS與TLR4/MD-2的結合形成了m-形受體多聚體，此結構中包含兩個對稱的TLR4/MD-2/LPS 復合體，是LPS信號轉導過程的必要條件。對于小鼠巨噬細胞，一旦TLR4缺失，細胞將停止LPS介導的轉錄應答，包括炎癥性細胞因子和干擾素[28]。盡管Toll樣受體在宿主防御微生物病原體侵襲并激活宿主先天性及獲得性免疫系統中起關鍵作用，但對其過度激活卻會干擾機體免疫系統的動態平衡，進而引起宿主產生自身免疫性和炎癥性疾病，由此，對Toll樣受體信號途徑的負調控顯得尤為重要[29]。針對LPS激活人TLR4受體過程，Tsukamoto等[30]構建了兩個單克隆抗體HT52和HT4，能夠有效地抑制這一信號途徑，實驗揭示出單克隆抗體可識別TLR4的不同空間區域，實驗還發現HT52和HT4不能阻止LPS結合到TLR4/MD-2受體復合物，而是抑制了LPS介導的TLR4信號轉導，為設計以TLR4為靶標的新型藥物提供了理論依據。
3.4 TLR4受體非依賴性途徑
LPS作為細菌內毒素能夠引起機體產生大量炎癥應答，這種炎癥反應與細胞表面的TLR4受體密切相關。但近年來，陸續有研究者提出細胞中還存在TLR4受體非依賴性LPS性應答途徑。LPS不僅能誘導CD14缺陷小鼠和TLR4缺陷小鼠的早期嗜中性粒細胞浸潤，對正常小鼠也有這種效應，而這種效應正是由機體對LPS產生先天性免疫應答引發的[31]。
近年來，關于LPS的TLR4受體非依賴性免疫應答的研究又取得了新進展。Kayagaki等[32]的實驗結果表明巨噬細胞內部能夠對LPS的六酰化類脂A做出應答，這種應答過程激活了caspase-11的生物學活性；反之，敲除caspase-11的小鼠對LPS誘發的致病性有拮抗能力，使得開發人類caspases 4 和 5(小鼠caspase-11的直系同源物)的拮抗劑，治療敗血癥成為可能。Hagar等[33]也提出小鼠細胞質中含有的LPS可激活caspase-11活性，且這種激活方式具有特異性，僅五酰化和六酰化類脂A可誘發caspase-11作出應答，與Kayagaki等的實驗結果相同，caspase-11缺陷小鼠同樣對LPS有拮抗。這些實驗結果都反映出細胞質中確實存在LPS受體，此受體介導的信號通路能夠激活caspase-11，進而引起細胞死亡，但其具體成分尚未闡明。
4 展望
革蘭陰性菌的LPS與其相應受體作用后，啟動胞內信號傳遞鏈，引起細胞轉錄性或非轉錄性應答，啟動基因轉錄、表達和釋放多種細胞因子，發揮其毒性作用。雖然LPS誘導細胞活化的整個通路尚未得以闡明，但隨著LPS信號轉導通路中相關蛋白分子及其作用機制的發現，對于有針對性的開發新型拮抗劑或生物佐劑，治療相關疾病顯示出廣闊的開發應用前景[34-36]。
引言
脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是所有革蘭陰性細菌外膜的主要組成部分，維持了細菌的結構完整性，并保護細菌膜免受某些化學物質的攻擊。LPS被稱為內毒素，是革蘭陰性菌主要致病成分，可引起強烈免疫反應，導致幾乎所有的真核細胞發生形態、代謝和基因表達變化，刺激宿主細胞因子失控性表達，發生嚴重感染[1-3]。敗血癥就是由LPS引發的重要疾病之一，敗血癥發作時，患者體內LPS濃度將極大提高，以至于身體出現災難性的炎癥反應。大量實驗證實，LPS、LPS結合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein，LBP)和LPS受體系統參與了炎癥反應的病理生理過程[4-5]，且LBP/LPS受體是體內增敏LPS細胞效應的重要系統。本文將LPS及LPS介導的信號通路中主要相關蛋白及受體的研究現狀作一概述。
1 LPS的結構
革蘭陰性細菌LPS由三部分組成，①是O-特異多糖(O-antigen)，由長度特定的重復單位首尾相連形成不同聚合度的聚合物，因細菌不同而存在差異，且通常具有良好的抗原性，又稱之為“O-抗原”；②是核心多糖，由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脫氧辛酸(KDO)組成，所有革蘭陰性菌都含有這種(在細菌種間略有差異)組分；③是類脂A(lipid A)，所有革蘭陰性菌的類脂A結構基本相似，也是其產生“毒性”的物質基礎[6]。對缺乏O-特異多糖僅由類脂A與核心多糖組成的LPS稱為粗糙型LPS，即Rough-LPS(R-LPS)，相反含有一定數量O-特異多糖的LPS稱為光滑型LPS，即Smooth-LPS(S-LPS)。E. coli O111來源的LPS對人巨噬細胞會產生不同的效應，表現在R-LPS和S-LPS具有不同的生物學活性；在體外，R-LPS激活人巨噬細胞先天性免疫應答更占優勢[7]。
2 類脂A結構的多樣性
類脂A是LPS的疏水性基團，可以將親水性的核心多糖和O-抗原黏附在革蘭陰性細菌外表面構成完整的細胞外膜。另外，類脂A也是LPS的活性成分，其結構在同一細菌的不同菌株之間比較保守。同時，類脂A的結構也富于多樣性，在不同種類的細菌中，類脂A 結構在細節上會有所不同。類脂A基本組成單位是以1′-6糖苷鍵相聯的D-葡萄糖胺雙糖，其中一個糖基的5位上連著核心寡糖，兩個糖基的1和4位上的羥基被磷酸取代，其他位置上的羥基和胺基都被脂肪酸取代。類脂A結構的修飾主要包括脂肪酸鏈和磷酸基團的修飾。除此之外，類脂A的形態也與LPS的生物學活性相關，Netea等[8]提出，類脂A圓錐形構象比圓柱形更具活性。Li等[9]的實驗結果表明，類脂A酰化水平越低，其對細胞膜的穿透能力更強，酰化程度也影響LPS誘導的細胞因子水平。
3 LPS信號通路主要相關受體
大量研究表明，由LPS所介導信號通路中的主要相關蛋白有LBP、白細胞分化抗原14(cluster of differentiation antigen 14，CD14)、髓樣分化因子2(myeloid differentiation factor 2，MD-2)、Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)等。其中，LBP為急相蛋白，能將LPS轉運到CD14并形成三元復合物[10]；CD14作為LPS/LBP復合物受體，介導LPS性細胞反應，且CD14還能調控TLR4依賴性的LPS內吞作用[11-12]；MD-2為分泌型糖蛋白，是LPS激活TLR4受體的細胞外銜接蛋白[13]；TLR4受體屬I型跨膜蛋白，與MD-2組成LPS受體復合物完成LPS信號轉導[14]。另外，近年來有研究者提出細胞質內也存在LPS受體，LPS與細胞內受體的結合可激活炎性酶Caspase-11，進而啟動巨噬細胞中的自我毀滅程序[15]。
3.1 LBP和CD14
血漿中的LBP在LPS轉運及其介導的細胞應答中發揮了重要作用。LBP是一種分子量為58~60 kDa的糖蛋白，可在多種動物體內合成，且不同動物種屬之間具有高度同源性，其主要由肝臟合成和分泌。當機體發生炎癥(如細菌性敗血癥)時，LBP在血漿中含量顯著增加，是陽性急相蛋白成分之一[16-17]。當細胞對LPS產生應答反應時，LBP可作為LPS發揮生物學功能的重要載體，即LBP將LPS單體從其聚集體中轉運到CD14，催化LPS與CD14的結合[18]。CD14可作為LPS/LBP復合物受體，介導LPS性細胞反應。CD14以兩種形式存在，即膜結合(membrane-bound CD14，mCD14)和可溶性CD14(soluble CD14，sCD14)。mCD14是一種53 kDa的糖蛋白，通過糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol,GPI)尾巴錨固于成熟的髓源性細胞膜表面；sCD14分布于動物血漿中，無GPI結構，分子量為48 kDa[19]。Kim等[20]首次解析了小鼠CD14的晶體結構，結構顯示其N-末端馬蹄形區域中含有一個大的疏水性口袋，此口袋邊緣富含正電荷氨基酸殘基，是LPS的結合位點。Kelley等[21]解析了人CD14晶體結構，與小鼠晶體結構非常相似，但與小鼠CD14的二聚體晶體結構相比，人CD14以單體形式結晶，其N-末端口袋伸展性更強，且口袋邊緣的氨基酸殘基也與小鼠CD14不同，反映了人CD14結合配體及細胞激活方式與小鼠CD14存在差異，這種差異可能與種屬相關。此外，有研究者發現CD14的N-末端在與LPS結合過程中也有部分親水性區域的參與[22]。CD14結構中不含有跨膜區，所以CD14自身不能完成LPS信號傳輸，需將LPS轉運到LPS受體復合物TLR4/MD-2，進而引起細胞對LPS一系列應答反應。然而，Watanabe等[23]的研究結果顯示：敲除CD14的小鼠能夠對LPS脂質體產生免疫應答，表明細胞中還存在CD14非依賴性的LPS-TLR4信號通路。
3.2 MD-2
MD-2作為LPS激活TLR4受體的細胞外接頭蛋白，在LPS信號通路中表現出重要的生物學功能。MD-2 cDNA可編碼160個氨基酸殘基，其分子量為25~30 kDa。MD-2是一種分泌型糖蛋白，能被表達MD-2 的細胞直接分泌到細胞外，也能通過與TLR4 胞外區結合而定位于細胞表面。Visintin等[24]提出MD-2誘導TLR4受體的聚集對于LPS信號轉導起決定性作用，實驗中還發現，MD-2結構中的K128和K132在其與LPS結合過程中必不可少，但它們與TLR4的結合無關。另外，Da等[25]提出，MD-2有Asn26和Asn114兩個N-糖基化位點，實驗結果表明糖基化在MD-2 的分泌中不起重要作用，但其在LPS誘導的細胞因子通路中發揮重要功能。MD-2發揮功能還與其自身酪氨酸磷酸化相關，有研究者發現，MD-2的酪氨酸磷酸化發生在其轉運過程中而非細胞表面，并確定了其酪氨酸磷酸化位點Y22和Y131，將其突變后，蛋白磷酸化水平明顯減少，特別是影響了MD-2對NF-КB的激活[26]。
3.3 TLR4受體依賴性途徑
TLR是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁，也是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質分子。TLR共有13個成員(TLR1~13)，屬于I型跨膜蛋白，可分為胞外區、胞漿區和跨膜區三部分，其胞外區結構富含亮氨酸重復序列，負責識別不同的病原分子；胞漿區則負責受體活化后的信號轉導[14]。
TLR4是革蘭陰性菌LPS信號通路受體的一個組成部分，且在由LPS引發的信號傳導進入胞內過程中起重要作用。Park等[27]對TLR4/MD-2復合物結構進行了研究，LPS與TLR4/MD-2的結合形成了m-形受體多聚體，此結構中包含兩個對稱的TLR4/MD-2/LPS 復合體，是LPS信號轉導過程的必要條件。對于小鼠巨噬細胞，一旦TLR4缺失，細胞將停止LPS介導的轉錄應答，包括炎癥性細胞因子和干擾素[28]。盡管Toll樣受體在宿主防御微生物病原體侵襲并激活宿主先天性及獲得性免疫系統中起關鍵作用，但對其過度激活卻會干擾機體免疫系統的動態平衡，進而引起宿主產生自身免疫性和炎癥性疾病，由此，對Toll樣受體信號途徑的負調控顯得尤為重要[29]。針對LPS激活人TLR4受體過程，Tsukamoto等[30]構建了兩個單克隆抗體HT52和HT4，能夠有效地抑制這一信號途徑，實驗揭示出單克隆抗體可識別TLR4的不同空間區域，實驗還發現HT52和HT4不能阻止LPS結合到TLR4/MD-2受體復合物，而是抑制了LPS介導的TLR4信號轉導，為設計以TLR4為靶標的新型藥物提供了理論依據。
3.4 TLR4受體非依賴性途徑
LPS作為細菌內毒素能夠引起機體產生大量炎癥應答，這種炎癥反應與細胞表面的TLR4受體密切相關。但近年來，陸續有研究者提出細胞中還存在TLR4受體非依賴性LPS性應答途徑。LPS不僅能誘導CD14缺陷小鼠和TLR4缺陷小鼠的早期嗜中性粒細胞浸潤，對正常小鼠也有這種效應，而這種效應正是由機體對LPS產生先天性免疫應答引發的[31]。
近年來，關于LPS的TLR4受體非依賴性免疫應答的研究又取得了新進展。Kayagaki等[32]的實驗結果表明巨噬細胞內部能夠對LPS的六酰化類脂A做出應答，這種應答過程激活了caspase-11的生物學活性；反之，敲除caspase-11的小鼠對LPS誘發的致病性有拮抗能力，使得開發人類caspases 4 和 5(小鼠caspase-11的直系同源物)的拮抗劑，治療敗血癥成為可能。Hagar等[33]也提出小鼠細胞質中含有的LPS可激活caspase-11活性，且這種激活方式具有特異性，僅五酰化和六酰化類脂A可誘發caspase-11作出應答，與Kayagaki等的實驗結果相同，caspase-11缺陷小鼠同樣對LPS有拮抗。這些實驗結果都反映出細胞質中確實存在LPS受體，此受體介導的信號通路能夠激活caspase-11，進而引起細胞死亡，但其具體成分尚未闡明。
4 展望
革蘭陰性菌的LPS與其相應受體作用后，啟動胞內信號傳遞鏈，引起細胞轉錄性或非轉錄性應答，啟動基因轉錄、表達和釋放多種細胞因子，發揮其毒性作用。雖然LPS誘導細胞活化的整個通路尚未得以闡明，但隨著LPS信號轉導通路中相關蛋白分子及其作用機制的發現，對于有針對性的開發新型拮抗劑或生物佐劑，治療相關疾病顯示出廣闊的開發應用前景[34-36]。