在角膜組織修復過程中,設計長時間保持透明的生物活性材料,是角膜修復材料研究的前沿問題。本文討論了甲酰胺/絲素復合膜作為角膜基質修復材料的研究。將絲素蛋白和甲酰胺以不同比例共混后鼓風干燥獲得透明絲素蛋白膜。甲酰胺/絲素復合膜(1:10)具備優異的力學性能、細胞相容性和長時間保持透明的特性。將兔角膜基質細胞接種于復合膜5 h后,細胞黏附率達90%以上,復合膜與培養板上的細胞增殖率沒有顯著差異。甲酰胺/絲素復合膜作為角膜基質修復材料值得進一步探討研究。
引用本文： 張珊珊, 李姣姣, 張芳, 張曉峰, 盧神州. 角膜修復用絲素蛋白膜的研制. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(4): 867-873,886. doi: 10.7507/1001-5515.20150155 復制
引言
角膜主要由內皮層、基質細胞層和上皮細胞層組成。在角膜移植中，角膜上皮細胞完全被受體角膜緣干細胞替代，供體角膜內皮細胞則被解體吸收，而可長期存活的角膜基質細胞就在角膜移植修復中起到重大作用。在正常生理環境下，角膜基質細胞能分泌多種蛋白質及多糖來維持角膜組織的透明性。當角膜受到損傷時，角膜基質細胞可以通過向成纖維細胞轉化實現角膜損傷的修復[1-2]。絲素蛋白細膩滑爽，透氣性好，與人體皮膚有良好的親和力。絲素纖維在形成過程中可以實現由水溶性變成水不溶性的多尺度結構[3]，因此家蠶絲素蛋白纖維用作角膜修復生物材料具有可行性[4]。人角膜成纖維細胞可以在絲素膜及多孔絲素材料上增殖生長，這為絲素蛋白材料用于修復受損角膜提供了基礎[5]。純絲素溶液成膜后，得到的絲素膜不僅脆性大，而且在去離子水中浸泡后會發生溶解崩裂[6]。因此，如何改善絲素蛋白膜的水溶性及長時間穩定性，使其滿足受損角膜對移植材料各項性能的要求，是目前角膜研究的一個難點。目前已經有一些關于絲素材料構建組織工程角膜的研究[7]。有報道采用乙醇處理所得絲素膜用做角膜替代材料，此方法獲得的絲素膜與細胞相容性好，但是乙醇處理絲素不易降解，植入體內限制了其生物應用性能[8]。絲素蛋白與山梨醇共混所得共混膜只能在干態下保持較好的透光率，濕態時透光率降低，不是理想的角膜移植材料[9]。以殼聚糖、硫酸軟骨素共混膜作為載體進行角膜內皮細胞移植的實驗研究表明，這種共混膜可以暫時改善動物角膜的透明性，但是透明穩定性不明[10] 。國內外對絲素共混膜的制備、結構和性能已進行過大量的研究，但往往膜的各項性能不能同時符合角膜材料所要求的條件。
本文以與絲素蛋白具有相似結構的甲酰胺與絲素蛋白按不同比例共混制備甲酰胺/絲素復合膜，分析探討該復合膜作為角膜基質修復材料的可行性。
1 材料與方法
1.1 主要材料與試劑
家蠶生絲(蘇州絲瑞寶生物技術有限公司)；溴化鋰(天成化工有限公司)；甲酰胺、無水碳酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；膠原蛋白酶(Sigma-Vetec)；新西蘭兔(2~3個月)；DMEM/F12培養基、胎牛血清(Gibco)；膠原貼敷料(創爾生物)；透析袋：截留分子量8 kD。
1.2 絲素溶液的制備
取家蠶生絲于微沸的碳酸鈉溶液中重復處理3次，每次處理時間為0.5 h,去離子水中洗凈絲膠，60 ℃烘至恒重，即得純絲素纖維。將烘干的絲素纖維在60 ℃下溶解于9.3 mol/L的溴化鋰溶液中，溶解時間約1 h，溶解后裝入透析袋去離子水透析3～4 d，過濾獲得潔凈的絲素溶液，放4 ℃冰箱儲存備用。
1.3 甲酰胺/絲素復合膜的制備
將甲酰胺加入水中，配成濃度為10%的溶液。按甲酰胺/絲素(質量比)分別為0/10、1/10、2/10、3/10、4/10、5/10和6/10的比例混合，用玻璃棒攪拌均勻倒入直徑10 cm的塑料模具，在恒溫恒濕室(25 ℃，RH=65%)風干后平衡24 h，備用。
1.4 復合膜的結構分析
選取干態的純絲素膜以及各比例的甲酰胺/絲素復合膜適量，剪刀剪碎，使用80目篩子篩取收集用于測試的粉末樣品，使用全自動X'PERT PRO MPD射線衍射儀(荷蘭帕納科公司)，衍射角選取5°～45°，管電壓40 kV，管電流35 mA，掃描速度10°/min，記錄復合膜的衍射強度曲線，比較分析甲酰胺的添加量對絲素蛋白結構的影響。
1.5 復合膜的溶脹度與溶失率
在105 ℃烘箱中干燥絲素膜6 h左右，測定各比例絲素膜的含水率。然后取甲酰胺/絲素=0/10、1/10、2/10、3/10、4/10、5/10和6/10的絲素膜各0.1 g左右(設為W1)分別置于10 mL離心管中，各離心管加入10 mL去離子水，每個比例重復3次，將離心管置于37 ℃水浴恒溫震蕩器中震蕩24 h后取出，離心取上清液，用紫外分光光度計(Smartspec)測出上清液在278 nm下的吸光度值A[9]，根據式(1)計算蛋白溶失率
| $D\left( \% \right) = {\rm{K}}AV/{W_1}\left( {1 - 含水率} \right) \times 100\% $ |
K為絲素溶液的紫外吸光常數，K=1.10，V=10 mL。
然后將離心管中的復合膜取出并用去離子水沖洗3次后放入105 ℃烘箱干燥至恒重，稱得復合膜質量為W2。絲素膜的質量損失率
| $M = \left[ {{W_1}\left( {1 - 含水率} \right) - {W_2}} \right]/{W_1} \times \left( {1 - 含水率} \right) \times 100\% $ |
同樣，取甲酰胺/絲素=0/10、1/10、2/10、3/10、4/10、5/10和6/10的絲素膜各0.1 g左右(設為W3)在37 ℃去離子水中浸泡24 h取出吸水紙擦干復合膜表面水分，稱量復合膜質量為W4，根據式(3)計算溶脹度
| $Z = \left( {{W_4} - {W_3}} \right)/{W_3} \times 100\% $ |
1.6 復合膜的力學性能
利用Instron3365型萬能材料試驗機測試各比例的甲酰胺/絲素膜的力學性能，依據GB/T1040-2006標準，按標準工字3型刀具模型形狀壓出樣條。復合膜的干態強力測試是把樣品條放在恒溫恒濕室平衡24 h后測定；復合膜的濕態強力測試則是將樣品條放置于生理鹽水中浸泡24 h后，取出用吸水紙擦干后立即測定。
1.7 復合膜的透光性測定
干態復合膜透光率測定：取甲酰胺/絲素(質量比)=0/10、1/10、2/10、3/10、4/10、5/10和6/10的復合膜，按照24孔板每個孔的大小剪成圓片狀平鋪于24孔板板底，用酶標儀分別測定492、550、700 nm處的吸光度值A，并計算透光率。濕態透光率檢測：取上述鋪有復合膜的培養板，每孔加入1 mL生理鹽水，定期更換生理鹽水，首先測定24 h的透光率，然后每星期測其透光率，最長期限為兩個月，觀察復合膜的透光情況。由于甲酰胺/絲素(0/10)的復合膜溶于水，所以不能測出濕態透光率。
1.8 復合膜的降解性能
選取前述實驗結果中具備了優異力學、光學、水不溶性等性能的甲酰胺/絲素復合膜，同時兼顧低比例甲酰胺更節約的原則，進行體外降解性能的測定，以下長時間的透光率測定以及細胞相容性的實驗均是選取同比例的甲酰胺/絲素復合膜進行。
膠原蛋白酶是人體內部本身所具有的酶，組織中含有的這種酶可能催化絲素蛋白復合膜的水解[11] 。選擇Ⅰ型膠原酶溶解在0.5 mol/L(pH=7.4)的磷酸鹽緩沖溶液中，膠原酶終濃度為2 U/mL,加入CaCl2，Ca2+ 終濃度為0.36 mmol/L，將甲酰胺/絲素膜稱取0.1 g按照浴比為1∶100加入到裝有降解液的離心管中,以不添加膠原酶的磷酸鹽緩沖液作為對照組，對比膠原酶的添加對甲酰胺/絲素膜降解的影響。同時將膠原敷料以同等條件添加到裝有降解液的另外一支離心管中，對比分析膠原蛋白酶對膠原與甲酰胺/絲素膜降解速率的差異。每天更換新的降解液，測定甲酰胺/絲素復合膜第1、3、8、13、18和23天時的質量變化，計算降解百分率。
1.9 復合膜的細胞相容性
1.9.1 角膜基質細胞分離與原代培養
選取生長兩到三個月的新西蘭兔，耳緣靜脈注射空氣致死，在無菌條件下摘除兔眼球，參考文獻[12]所述方法，在解剖顯微鏡下用無菌刀片刮除角膜上皮層，用顯微鑷將角膜后彈力層及內皮層撕除，放入PBS中漂洗，清洗2～3次，剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，最后將組織塊加入6孔板，并且每孔加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基培養，待細胞密集并且形態規整時傳代培養。
1.9.2 黏附率測定
取純絲素溶液、甲酰胺/絲素混合溶液各200 μL置于24孔板風干成膜，每組重復4個復孔，其中純絲素膜用75%乙醇處理2 h，然后所有的復合膜于去離子水中浸泡3 d，Co60滅菌后備用。選取生長良好的第四代角膜基質細胞用胰酶消化后制成細胞懸液，調整細胞濃度為1×105個/mL,在鋪有純絲素膜、甲酰胺/絲素膜和空板的24孔板內每孔加入細胞懸液1 mL,計數1 h、3 h、5 h時培養液中細胞懸浮數量，計算細胞在不同時間對材料的黏附率。
| $黏附率\left( \% \right) = \left[ {\left( {{C_0} - C} \right)/{C_0}} \right] \times 100\% $ |
式中C0為種植細胞數(1×105個/mL)，C為未附著細胞數。
1.9.3 細胞增殖活力測定
取絲素溶液、甲酰胺/絲素混合的溶液各80 μL置于96孔板，6個復孔，風干成膜，純絲素膜同樣經過75%乙醇處理2 h，去離子水浸泡3 d，Co60滅菌后備用。當兔角膜基質細胞生長至對數期，胰酶消化配置成細胞濃度為2×104個/mL的細胞懸液，并將細胞懸液依次加入鋪有純絲素膜、甲酰胺/絲素膜和空板的96孔板，每孔加入150 μL。在細胞生長到第1、3、5、7天時加入阿爾瑪藍測定熒光值，如文獻[13-14]所述。并且在倒置顯微鏡下觀察細胞在第1、3、5、7天的生長形態。
2 結果
2.1 不同含量甲酰胺對絲素蛋白膜結構的影響
家蠶絲素纖維包含結晶區與非晶區，結晶區已被多次證實，主要分為兩類結構：Silk Ⅰ和Silk Ⅱ[15]。復合膜的結晶結構反映了材料的穩定性，除此之外，材料的降解速率也與結晶結構有關。Silk Ⅰ晶體結構模型是一種亞穩定結構[16-17]。Silk Ⅱ結晶結構呈反平行的β-折疊結構，分子鏈間組裝使能量處于最低，是最穩定的結構[18]，并且β-折疊結構含量與絲素的降解速率有關，其含量越多，絲素越不容易被降解[19]。根據X-衍射曲線可對絲素膜的結構進行分析：Silk Ⅰ衍射峰對應的衍射角位置在12.2°、19.7°、24.7°、28.2°、32.3°、36.8°、40.1°處；Silk Ⅱ的衍射峰主要出現在9.1°、18.9°、20.7°和24.3°處[20]。如圖 1所示，可以看出純絲素膜為無定形結構。當加入的甲酰胺/絲素為1/10時，11.9°出現尖銳的結晶峰，并在19.6°、24.7°處也出現了結晶峰，絲素復合膜為Silk Ⅰ結晶結構。隨著甲酰胺添加比例的增加，當甲酰胺/絲素為2/10時，20.7°處的結晶峰開始出現；當甲酰胺/絲素比例為3/10、4/10、5/10時，9.1°處的結晶峰逐漸增強，19.6°處結晶峰消失，20.7°、24.7°處出現明顯的結晶峰，復合膜為Silk Ⅰ、Silk Ⅱ共存態；當甲酰胺/絲素比例為6/10時，結晶峰出現位置為20.7°、24.7°處，復合膜仍為Silk Ⅰ、Silk Ⅱ共存態，只是Silk Ⅱ含量有所減少。所以，甲酰胺的添加對復合膜結構的影響是：絲素由無規卷曲結構向Silk Ⅰ結構轉換，然后形成Silk Ⅰ和Silk Ⅱ共存的結構，所以可以通過控制甲酰胺的添加量調整絲素蛋白的結晶結構，進而可以獲得具有不同降解速率的復合膜。總體來說，甲酰胺/絲素膜結晶峰較少且峰型整體平緩，說明甲酰胺小分子的加入抑制了絲素形成大的結晶顆粒，沒有雜亂峰型出現，所以甲酰胺與絲素兩者相容性較好。
圖1
絲素蛋白膜的X-衍射曲線
A~G:甲酰胺/絲素=0/10~6/10
Figure1. X-ray diffractometer of silk membranesA~G: formamide/SF=0/10~6/10
2.2 熱水溶失率和溶脹度的測定
復合膜的熱水溶失是絲素蛋白在熱水中減少所致，質量損失率則是指材料的整體質量減少量，二者可以客觀反映材料的應用可行性。純的絲素膜由于易溶于水而限制了其應用。從圖 2(a)可以看出，當加入的甲酰胺為絲素的1/10時，復合膜的蛋白溶失率降低顯著，復合膜的質量總損失率為10%左右。從X-射線衍射曲線可知，當加入的甲酰胺/絲素超過1/10時，復合膜的結晶結構就會從無規卷曲轉變為Silk Ⅰ的穩定結構，從而使復合膜不溶于水。甲酰胺的添加使得復合膜的蛋白溶失問題得到改善，同時，復合膜的質量損失率變化幅度較小，這可能是隨著甲酰胺比例的增加，甲酰胺與絲素大分子的交聯更加充分。甲酰胺的混入能解決絲素蛋白膜的水溶性問題，應該是由于甲酰胺與絲素蛋白發生交聯促使復合膜的結晶結構發生了轉變。
圖2
復合膜的質量變化率
(a)損失率;(b)溶脹度
Figure2. Weight change rate of membrane(a) loss rate; (b) swelling ratio
由于甲酰胺是親水性分子，材料的溶脹主要是因為材料吸水所致[21]，了解材料的溶脹對于臨床應用至關重要。從圖 2(b)可以看出，隨著甲酰胺比例的增加，復合膜的溶脹度出現先降低后增加的趨勢,在甲酰胺/絲素比例為2/10時，溶脹度降低至30%左右。這可能與復合膜結晶結構12.2°處的結晶峰強度減弱即Silk Ⅰ結構減少有關[22]。當甲酰胺的添加比例繼續增加時，復合膜的溶脹度出現明顯的增加，但總體不超過50%。純絲素膜溶于水其溶脹度難以測出。所以，甲酰胺的添加不僅解決了純絲素易溶于水的問題，又使得復合膜具有一定的溶脹度，有利于細胞在復合膜載體上生長[23] ，為復合膜的臨床應用提供了條件。
2.3 復合膜的力學性能
從圖 3可以看出，純絲素膜的干態斷裂強度為58 MPa左右，當甲酰胺/絲素比例為4/10時，復合膜斷裂強度為62 MPa,其他比例的復合膜的斷裂強力與純絲素膜相比有所降低，復合膜的斷裂伸長率隨甲酰胺的添加量不同沒有明顯變化。這可能是甲酰胺部分取代原來絲素大分子所處位置處的作用力，降低了絲素大分子相互之間的作用。當甲酰胺/絲素比例為40%，斷裂強度最大，根據結晶結構可知，此時甲酰胺絲素膜峰型變得平緩，并且絲素與甲酰胺交聯作用強，二者相容性好，所以此時的復合膜強度最好。濕態時，甲酰胺/絲素膜的斷裂伸長有明顯改善，純絲素膜溶于水數據難以測出。當甲酰胺與絲素比例為1/10時，甲酰胺/絲素膜的斷裂強度達到15 MPa以上，斷裂伸長率達到23.5%，濕態時復合膜中的甲酰胺會部分溶出，這可能對復合膜的強度有一定影響，但是由于水分子的介入，增強了絲素蛋白分子的運動，使得復合膜的斷裂伸長率較同比例的干態復合膜明顯提高。因此可以通過調控甲酰胺的添加比例改善共混膜的柔韌性。
圖3
復合膜的力學性能
Figure3.
Mechanical properties of membrane
2.4 復合膜的持續透光性
根據前述實驗結果可知，甲酰胺/絲素(1/10)的復合膜具備了較好的力學、光學及水不溶性等性能，同時兼顧低比例甲酰胺更節約的原則，所以只選取1/10的復合膜進行10周浸泡的透光率及后讀其他實驗。由圖 4(a)可以看出，干態下，復合膜有著很好的透光性，其透光率幾乎均在90%以上，隨著甲酰胺比例的增加透光率有下降趨勢，這可能是隨著甲酰胺的增加，結晶結構開始增加，絲素大分子與甲酰胺出現分相，相容性降低，從而透光率下降。除此之外，也存在一些絲素蛋白膜干態時透明、浸入水后會發白的現象。濕態時，甲酰胺/絲素膜隨著甲酰胺的比例增加濕態透光沒有變化，與干態同比例的復合膜相比，由于水分子的介入，水分子促進了甲酰胺與絲素的相互作用，從而使得復合膜的透光率仍在90%以上。此時觀察復合膜仍呈透明狀，沒有發白跡象。
圖4
復合膜的透光率
(a)浸泡24 h；(b)甲酰胺/絲素膜(1/10)浸泡10周
Figure4. Transmittance of silk film(a) incubated for 24 hours; (b) formamide/SF (0/10)incubated for 10 weeks
根據前述實驗結果可知，甲酰胺/絲素(1/10)的復合膜具備了較好的力學、光學及水不溶性等性能，同時兼顧低比例甲酰胺更節約的原則，所以只選取1/10的復合膜進行10周浸泡的透光率實驗及后續其他實驗。由圖 4(b)可知，質量比1/10的甲酰胺/絲素膜浸泡10周后，絲素膜的透光率仍保持90%以上，經觀察沒有發白現象，說明甲酰胺/絲素蛋白膜的透明性是可以穩定的。現在很多材料只測試24 h的透光率，并沒有對長時間材料的透光性做追蹤研究，這就不能保證材料在應用過程中持續透明。如果材料只有24 h或者短時間的透明性數據就限制了材料的應用范圍，比如作為角膜材料的應用，就不僅僅需要材料強度高、降解性、生物相容性好，還對于長時間的透明性也有一定要求。
甲酰胺/絲素膜在490 nm處透光率在90%以上，而且能長時間保持透光率較高，材料無發白現象，角膜基質層透光率為87.1%±2.0%[24]，所以甲酰胺/絲素膜可滿足角膜組織修復材料對透明性的要求。
2.5 復合膜的體外降解
從圖 5可以看出，在磷酸鹽緩沖液中甲酰胺/絲素膜(質量比1/10)質量開始幾乎沒有變化，23 d之后有92%左右的質量剩余率。膠原敷料在膠原酶作用第8天時全部被降解為碎屑，然而此時甲酰胺/絲素膜只有少量被降解并保持完整形狀，說明相對于太易降解的膠原來說，復合膜在酶作用下則可保持較長時間,甲酰胺/絲素膜比膠原更有應用優勢。第23天時，絲素復合膜質量剩余百分率為70%左右，此時復合膜仍保持完整，未被降解為碎片。角膜基質細胞8 d后形成細胞單層，此時的復合膜能為細胞提供載體依附并且可以繼續支持細胞生長，所以甲酰胺絲素復合膜可以作為載體維持細胞生長。
圖5
復合膜的降解
Figure5.
Degradation of silk films
2.6 復合膜的細胞相容性
細胞在材料上的黏附是細胞增殖的基礎。由表 1可知，兔角膜基質細胞能在甲酰胺/絲素膜上黏附，1 h后復合膜表面細胞的黏附率均能達到80%，5 h后黏附率均在90%以上。
表1
兔角膜基質細胞在不同材料上的黏附率(%)
Table1.
Adhesion rate of rabbit corneal stromal cells on different materials (%)
由圖 6可知，兔角膜基質細胞在復合膜材料上生長第1天時，細胞形態沒有伸展且數目較少；隨著培養時間增加，第3天時，細胞在材料上逐漸增多；在第5天時細胞在材料表面生長規整，形態為長梭形。由于第5天時細胞已鋪滿材料表面，第7天時的細胞圖片與第5天生長狀態基本相似，所以沒有給出第7天的細胞圖片。復合膜上的細胞熒光值與96孔板對照組無顯著差異，明顯優于純絲素膜，說明復合膜能夠很好地支持細胞增殖，細胞相容性良好。
圖6
不同天數細胞生長形態與增殖率
Figure6.
Cellular morphology and fluorescence value in different days
3 討論
文獻證實角膜細胞能夠在絲素蛋白材料上黏附并且正常增殖生長[25] 。絲素作為角膜細胞載體或角膜替代材料具有一定可行性。絲素蛋白是一種聚酰胺，與小分子酰胺之間具有相似的分子結構，甲酰胺作為小分子溶劑，可以實現與絲素較好的相容。
甲酰胺/絲素復合膜減小了原來絲素大分子之間的作用，斷裂強度較純絲素的有所降低，人眼角膜的濕態拉伸強度為(3.81±0.41) MPa[26]，所以該復合膜仍能滿足角膜替代材料對機械強度的要求。甲酰胺與絲素結合形成少量的結晶結構同時抑制復合膜的水溶性，改善純絲素膜易溶于水的缺點，獲得水不溶性絲素膜。甲酰胺/絲素復合膜可形成Silk Ⅰ結晶結構以及Silk Ⅰ、Silk Ⅱ共存的結構。當復合膜為Silk Ⅰ結晶結構時，降解達到最快，Silk Ⅱ結晶結構降解速率稍慢。甲酰胺/絲素膜能夠被膠原酶降解，23 d后質量剩余70%左右，為替代材料體內的逐步降解吸收提供了可能。根據甲酰胺/絲素膜細胞培養情況可推斷甲酰胺比例為絲素的10%時，并未對細胞造成不良影響，這或許是甲酰胺浸泡后被溶出，只有對細胞生長并無影響的微量殘留，所以甲酰胺/絲素膜能支持兔角膜基質細胞的正常生長增殖。因此該復合膜有望成為良好的角膜基質修復材料。
4 結論
絲素蛋白與甲酰胺混合所制備的復合膜，當甲酰胺/絲素比例為1/10時，復合膜具有較好的力學性能，透明性較好，可降解并且降解時間適當，可以支持角膜基質細胞正常生長，該復合膜可能成為角膜基質修復的理想材料。
引言
角膜主要由內皮層、基質細胞層和上皮細胞層組成。在角膜移植中，角膜上皮細胞完全被受體角膜緣干細胞替代，供體角膜內皮細胞則被解體吸收，而可長期存活的角膜基質細胞就在角膜移植修復中起到重大作用。在正常生理環境下，角膜基質細胞能分泌多種蛋白質及多糖來維持角膜組織的透明性。當角膜受到損傷時，角膜基質細胞可以通過向成纖維細胞轉化實現角膜損傷的修復[1-2]。絲素蛋白細膩滑爽，透氣性好，與人體皮膚有良好的親和力。絲素纖維在形成過程中可以實現由水溶性變成水不溶性的多尺度結構[3]，因此家蠶絲素蛋白纖維用作角膜修復生物材料具有可行性[4]。人角膜成纖維細胞可以在絲素膜及多孔絲素材料上增殖生長，這為絲素蛋白材料用于修復受損角膜提供了基礎[5]。純絲素溶液成膜后，得到的絲素膜不僅脆性大，而且在去離子水中浸泡后會發生溶解崩裂[6]。因此，如何改善絲素蛋白膜的水溶性及長時間穩定性，使其滿足受損角膜對移植材料各項性能的要求，是目前角膜研究的一個難點。目前已經有一些關于絲素材料構建組織工程角膜的研究[7]。有報道采用乙醇處理所得絲素膜用做角膜替代材料，此方法獲得的絲素膜與細胞相容性好，但是乙醇處理絲素不易降解，植入體內限制了其生物應用性能[8]。絲素蛋白與山梨醇共混所得共混膜只能在干態下保持較好的透光率，濕態時透光率降低，不是理想的角膜移植材料[9]。以殼聚糖、硫酸軟骨素共混膜作為載體進行角膜內皮細胞移植的實驗研究表明，這種共混膜可以暫時改善動物角膜的透明性，但是透明穩定性不明[10] 。國內外對絲素共混膜的制備、結構和性能已進行過大量的研究，但往往膜的各項性能不能同時符合角膜材料所要求的條件。
本文以與絲素蛋白具有相似結構的甲酰胺與絲素蛋白按不同比例共混制備甲酰胺/絲素復合膜，分析探討該復合膜作為角膜基質修復材料的可行性。
1 材料與方法
1.1 主要材料與試劑
家蠶生絲(蘇州絲瑞寶生物技術有限公司)；溴化鋰(天成化工有限公司)；甲酰胺、無水碳酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；膠原蛋白酶(Sigma-Vetec)；新西蘭兔(2~3個月)；DMEM/F12培養基、胎牛血清(Gibco)；膠原貼敷料(創爾生物)；透析袋：截留分子量8 kD。
1.2 絲素溶液的制備
取家蠶生絲于微沸的碳酸鈉溶液中重復處理3次，每次處理時間為0.5 h,去離子水中洗凈絲膠，60 ℃烘至恒重，即得純絲素纖維。將烘干的絲素纖維在60 ℃下溶解于9.3 mol/L的溴化鋰溶液中，溶解時間約1 h，溶解后裝入透析袋去離子水透析3～4 d，過濾獲得潔凈的絲素溶液，放4 ℃冰箱儲存備用。
1.3 甲酰胺/絲素復合膜的制備
將甲酰胺加入水中，配成濃度為10%的溶液。按甲酰胺/絲素(質量比)分別為0/10、1/10、2/10、3/10、4/10、5/10和6/10的比例混合，用玻璃棒攪拌均勻倒入直徑10 cm的塑料模具，在恒溫恒濕室(25 ℃，RH=65%)風干后平衡24 h，備用。
1.4 復合膜的結構分析
選取干態的純絲素膜以及各比例的甲酰胺/絲素復合膜適量，剪刀剪碎，使用80目篩子篩取收集用于測試的粉末樣品，使用全自動X'PERT PRO MPD射線衍射儀(荷蘭帕納科公司)，衍射角選取5°～45°，管電壓40 kV，管電流35 mA，掃描速度10°/min，記錄復合膜的衍射強度曲線，比較分析甲酰胺的添加量對絲素蛋白結構的影響。
1.5 復合膜的溶脹度與溶失率
在105 ℃烘箱中干燥絲素膜6 h左右，測定各比例絲素膜的含水率。然后取甲酰胺/絲素=0/10、1/10、2/10、3/10、4/10、5/10和6/10的絲素膜各0.1 g左右(設為W1)分別置于10 mL離心管中，各離心管加入10 mL去離子水，每個比例重復3次，將離心管置于37 ℃水浴恒溫震蕩器中震蕩24 h后取出，離心取上清液，用紫外分光光度計(Smartspec)測出上清液在278 nm下的吸光度值A[9]，根據式(1)計算蛋白溶失率
| $D\left( \% \right) = {\rm{K}}AV/{W_1}\left( {1 - 含水率} \right) \times 100\% $ |
K為絲素溶液的紫外吸光常數，K=1.10，V=10 mL。
然后將離心管中的復合膜取出并用去離子水沖洗3次后放入105 ℃烘箱干燥至恒重，稱得復合膜質量為W2。絲素膜的質量損失率
| $M = \left[ {{W_1}\left( {1 - 含水率} \right) - {W_2}} \right]/{W_1} \times \left( {1 - 含水率} \right) \times 100\% $ |
同樣，取甲酰胺/絲素=0/10、1/10、2/10、3/10、4/10、5/10和6/10的絲素膜各0.1 g左右(設為W3)在37 ℃去離子水中浸泡24 h取出吸水紙擦干復合膜表面水分，稱量復合膜質量為W4，根據式(3)計算溶脹度
| $Z = \left( {{W_4} - {W_3}} \right)/{W_3} \times 100\% $ |
1.6 復合膜的力學性能
利用Instron3365型萬能材料試驗機測試各比例的甲酰胺/絲素膜的力學性能，依據GB/T1040-2006標準，按標準工字3型刀具模型形狀壓出樣條。復合膜的干態強力測試是把樣品條放在恒溫恒濕室平衡24 h后測定；復合膜的濕態強力測試則是將樣品條放置于生理鹽水中浸泡24 h后，取出用吸水紙擦干后立即測定。
1.7 復合膜的透光性測定
干態復合膜透光率測定：取甲酰胺/絲素(質量比)=0/10、1/10、2/10、3/10、4/10、5/10和6/10的復合膜，按照24孔板每個孔的大小剪成圓片狀平鋪于24孔板板底，用酶標儀分別測定492、550、700 nm處的吸光度值A，并計算透光率。濕態透光率檢測：取上述鋪有復合膜的培養板，每孔加入1 mL生理鹽水，定期更換生理鹽水，首先測定24 h的透光率，然后每星期測其透光率，最長期限為兩個月，觀察復合膜的透光情況。由于甲酰胺/絲素(0/10)的復合膜溶于水，所以不能測出濕態透光率。
1.8 復合膜的降解性能
選取前述實驗結果中具備了優異力學、光學、水不溶性等性能的甲酰胺/絲素復合膜，同時兼顧低比例甲酰胺更節約的原則，進行體外降解性能的測定，以下長時間的透光率測定以及細胞相容性的實驗均是選取同比例的甲酰胺/絲素復合膜進行。
膠原蛋白酶是人體內部本身所具有的酶，組織中含有的這種酶可能催化絲素蛋白復合膜的水解[11] 。選擇Ⅰ型膠原酶溶解在0.5 mol/L(pH=7.4)的磷酸鹽緩沖溶液中，膠原酶終濃度為2 U/mL,加入CaCl2，Ca2+ 終濃度為0.36 mmol/L，將甲酰胺/絲素膜稱取0.1 g按照浴比為1∶100加入到裝有降解液的離心管中,以不添加膠原酶的磷酸鹽緩沖液作為對照組，對比膠原酶的添加對甲酰胺/絲素膜降解的影響。同時將膠原敷料以同等條件添加到裝有降解液的另外一支離心管中，對比分析膠原蛋白酶對膠原與甲酰胺/絲素膜降解速率的差異。每天更換新的降解液，測定甲酰胺/絲素復合膜第1、3、8、13、18和23天時的質量變化，計算降解百分率。
1.9 復合膜的細胞相容性
1.9.1 角膜基質細胞分離與原代培養
選取生長兩到三個月的新西蘭兔，耳緣靜脈注射空氣致死，在無菌條件下摘除兔眼球，參考文獻[12]所述方法，在解剖顯微鏡下用無菌刀片刮除角膜上皮層，用顯微鑷將角膜后彈力層及內皮層撕除，放入PBS中漂洗，清洗2～3次，剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，最后將組織塊加入6孔板，并且每孔加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基培養，待細胞密集并且形態規整時傳代培養。
1.9.2 黏附率測定
取純絲素溶液、甲酰胺/絲素混合溶液各200 μL置于24孔板風干成膜，每組重復4個復孔，其中純絲素膜用75%乙醇處理2 h，然后所有的復合膜于去離子水中浸泡3 d，Co60滅菌后備用。選取生長良好的第四代角膜基質細胞用胰酶消化后制成細胞懸液，調整細胞濃度為1×105個/mL,在鋪有純絲素膜、甲酰胺/絲素膜和空板的24孔板內每孔加入細胞懸液1 mL,計數1 h、3 h、5 h時培養液中細胞懸浮數量，計算細胞在不同時間對材料的黏附率。
| $黏附率\left( \% \right) = \left[ {\left( {{C_0} - C} \right)/{C_0}} \right] \times 100\% $ |
式中C0為種植細胞數(1×105個/mL)，C為未附著細胞數。
1.9.3 細胞增殖活力測定
取絲素溶液、甲酰胺/絲素混合的溶液各80 μL置于96孔板，6個復孔，風干成膜，純絲素膜同樣經過75%乙醇處理2 h，去離子水浸泡3 d，Co60滅菌后備用。當兔角膜基質細胞生長至對數期，胰酶消化配置成細胞濃度為2×104個/mL的細胞懸液，并將細胞懸液依次加入鋪有純絲素膜、甲酰胺/絲素膜和空板的96孔板，每孔加入150 μL。在細胞生長到第1、3、5、7天時加入阿爾瑪藍測定熒光值，如文獻[13-14]所述。并且在倒置顯微鏡下觀察細胞在第1、3、5、7天的生長形態。
2 結果
2.1 不同含量甲酰胺對絲素蛋白膜結構的影響
家蠶絲素纖維包含結晶區與非晶區，結晶區已被多次證實，主要分為兩類結構：Silk Ⅰ和Silk Ⅱ[15]。復合膜的結晶結構反映了材料的穩定性，除此之外，材料的降解速率也與結晶結構有關。Silk Ⅰ晶體結構模型是一種亞穩定結構[16-17]。Silk Ⅱ結晶結構呈反平行的β-折疊結構，分子鏈間組裝使能量處于最低，是最穩定的結構[18]，并且β-折疊結構含量與絲素的降解速率有關，其含量越多，絲素越不容易被降解[19]。根據X-衍射曲線可對絲素膜的結構進行分析：Silk Ⅰ衍射峰對應的衍射角位置在12.2°、19.7°、24.7°、28.2°、32.3°、36.8°、40.1°處；Silk Ⅱ的衍射峰主要出現在9.1°、18.9°、20.7°和24.3°處[20]。如圖 1所示，可以看出純絲素膜為無定形結構。當加入的甲酰胺/絲素為1/10時，11.9°出現尖銳的結晶峰，并在19.6°、24.7°處也出現了結晶峰，絲素復合膜為Silk Ⅰ結晶結構。隨著甲酰胺添加比例的增加，當甲酰胺/絲素為2/10時，20.7°處的結晶峰開始出現；當甲酰胺/絲素比例為3/10、4/10、5/10時，9.1°處的結晶峰逐漸增強，19.6°處結晶峰消失，20.7°、24.7°處出現明顯的結晶峰，復合膜為Silk Ⅰ、Silk Ⅱ共存態；當甲酰胺/絲素比例為6/10時，結晶峰出現位置為20.7°、24.7°處，復合膜仍為Silk Ⅰ、Silk Ⅱ共存態，只是Silk Ⅱ含量有所減少。所以，甲酰胺的添加對復合膜結構的影響是：絲素由無規卷曲結構向Silk Ⅰ結構轉換，然后形成Silk Ⅰ和Silk Ⅱ共存的結構，所以可以通過控制甲酰胺的添加量調整絲素蛋白的結晶結構，進而可以獲得具有不同降解速率的復合膜。總體來說，甲酰胺/絲素膜結晶峰較少且峰型整體平緩，說明甲酰胺小分子的加入抑制了絲素形成大的結晶顆粒，沒有雜亂峰型出現，所以甲酰胺與絲素兩者相容性較好。
圖1
絲素蛋白膜的X-衍射曲線
A~G:甲酰胺/絲素=0/10~6/10
Figure1. X-ray diffractometer of silk membranesA~G: formamide/SF=0/10~6/10
2.2 熱水溶失率和溶脹度的測定
復合膜的熱水溶失是絲素蛋白在熱水中減少所致，質量損失率則是指材料的整體質量減少量，二者可以客觀反映材料的應用可行性。純的絲素膜由于易溶于水而限制了其應用。從圖 2(a)可以看出，當加入的甲酰胺為絲素的1/10時，復合膜的蛋白溶失率降低顯著，復合膜的質量總損失率為10%左右。從X-射線衍射曲線可知，當加入的甲酰胺/絲素超過1/10時，復合膜的結晶結構就會從無規卷曲轉變為Silk Ⅰ的穩定結構，從而使復合膜不溶于水。甲酰胺的添加使得復合膜的蛋白溶失問題得到改善，同時，復合膜的質量損失率變化幅度較小，這可能是隨著甲酰胺比例的增加，甲酰胺與絲素大分子的交聯更加充分。甲酰胺的混入能解決絲素蛋白膜的水溶性問題，應該是由于甲酰胺與絲素蛋白發生交聯促使復合膜的結晶結構發生了轉變。
圖2
復合膜的質量變化率
(a)損失率;(b)溶脹度
Figure2. Weight change rate of membrane(a) loss rate; (b) swelling ratio
由于甲酰胺是親水性分子，材料的溶脹主要是因為材料吸水所致[21]，了解材料的溶脹對于臨床應用至關重要。從圖 2(b)可以看出，隨著甲酰胺比例的增加，復合膜的溶脹度出現先降低后增加的趨勢,在甲酰胺/絲素比例為2/10時，溶脹度降低至30%左右。這可能與復合膜結晶結構12.2°處的結晶峰強度減弱即Silk Ⅰ結構減少有關[22]。當甲酰胺的添加比例繼續增加時，復合膜的溶脹度出現明顯的增加，但總體不超過50%。純絲素膜溶于水其溶脹度難以測出。所以，甲酰胺的添加不僅解決了純絲素易溶于水的問題，又使得復合膜具有一定的溶脹度，有利于細胞在復合膜載體上生長[23] ，為復合膜的臨床應用提供了條件。
2.3 復合膜的力學性能
從圖 3可以看出，純絲素膜的干態斷裂強度為58 MPa左右，當甲酰胺/絲素比例為4/10時，復合膜斷裂強度為62 MPa,其他比例的復合膜的斷裂強力與純絲素膜相比有所降低，復合膜的斷裂伸長率隨甲酰胺的添加量不同沒有明顯變化。這可能是甲酰胺部分取代原來絲素大分子所處位置處的作用力，降低了絲素大分子相互之間的作用。當甲酰胺/絲素比例為40%，斷裂強度最大，根據結晶結構可知，此時甲酰胺絲素膜峰型變得平緩，并且絲素與甲酰胺交聯作用強，二者相容性好，所以此時的復合膜強度最好。濕態時，甲酰胺/絲素膜的斷裂伸長有明顯改善，純絲素膜溶于水數據難以測出。當甲酰胺與絲素比例為1/10時，甲酰胺/絲素膜的斷裂強度達到15 MPa以上，斷裂伸長率達到23.5%，濕態時復合膜中的甲酰胺會部分溶出，這可能對復合膜的強度有一定影響，但是由于水分子的介入，增強了絲素蛋白分子的運動，使得復合膜的斷裂伸長率較同比例的干態復合膜明顯提高。因此可以通過調控甲酰胺的添加比例改善共混膜的柔韌性。
圖3
復合膜的力學性能
Figure3.
Mechanical properties of membrane
2.4 復合膜的持續透光性
根據前述實驗結果可知，甲酰胺/絲素(1/10)的復合膜具備了較好的力學、光學及水不溶性等性能，同時兼顧低比例甲酰胺更節約的原則，所以只選取1/10的復合膜進行10周浸泡的透光率及后讀其他實驗。由圖 4(a)可以看出，干態下，復合膜有著很好的透光性，其透光率幾乎均在90%以上，隨著甲酰胺比例的增加透光率有下降趨勢，這可能是隨著甲酰胺的增加，結晶結構開始增加，絲素大分子與甲酰胺出現分相，相容性降低，從而透光率下降。除此之外，也存在一些絲素蛋白膜干態時透明、浸入水后會發白的現象。濕態時，甲酰胺/絲素膜隨著甲酰胺的比例增加濕態透光沒有變化，與干態同比例的復合膜相比，由于水分子的介入，水分子促進了甲酰胺與絲素的相互作用，從而使得復合膜的透光率仍在90%以上。此時觀察復合膜仍呈透明狀，沒有發白跡象。
圖4
復合膜的透光率
(a)浸泡24 h；(b)甲酰胺/絲素膜(1/10)浸泡10周
Figure4. Transmittance of silk film(a) incubated for 24 hours; (b) formamide/SF (0/10)incubated for 10 weeks
根據前述實驗結果可知，甲酰胺/絲素(1/10)的復合膜具備了較好的力學、光學及水不溶性等性能，同時兼顧低比例甲酰胺更節約的原則，所以只選取1/10的復合膜進行10周浸泡的透光率實驗及后續其他實驗。由圖 4(b)可知，質量比1/10的甲酰胺/絲素膜浸泡10周后，絲素膜的透光率仍保持90%以上，經觀察沒有發白現象，說明甲酰胺/絲素蛋白膜的透明性是可以穩定的。現在很多材料只測試24 h的透光率，并沒有對長時間材料的透光性做追蹤研究，這就不能保證材料在應用過程中持續透明。如果材料只有24 h或者短時間的透明性數據就限制了材料的應用范圍，比如作為角膜材料的應用，就不僅僅需要材料強度高、降解性、生物相容性好，還對于長時間的透明性也有一定要求。
甲酰胺/絲素膜在490 nm處透光率在90%以上，而且能長時間保持透光率較高，材料無發白現象，角膜基質層透光率為87.1%±2.0%[24]，所以甲酰胺/絲素膜可滿足角膜組織修復材料對透明性的要求。
2.5 復合膜的體外降解
從圖 5可以看出，在磷酸鹽緩沖液中甲酰胺/絲素膜(質量比1/10)質量開始幾乎沒有變化，23 d之后有92%左右的質量剩余率。膠原敷料在膠原酶作用第8天時全部被降解為碎屑，然而此時甲酰胺/絲素膜只有少量被降解并保持完整形狀，說明相對于太易降解的膠原來說，復合膜在酶作用下則可保持較長時間,甲酰胺/絲素膜比膠原更有應用優勢。第23天時，絲素復合膜質量剩余百分率為70%左右，此時復合膜仍保持完整，未被降解為碎片。角膜基質細胞8 d后形成細胞單層，此時的復合膜能為細胞提供載體依附并且可以繼續支持細胞生長，所以甲酰胺絲素復合膜可以作為載體維持細胞生長。
圖5
復合膜的降解
Figure5.
Degradation of silk films
2.6 復合膜的細胞相容性
細胞在材料上的黏附是細胞增殖的基礎。由表 1可知，兔角膜基質細胞能在甲酰胺/絲素膜上黏附，1 h后復合膜表面細胞的黏附率均能達到80%，5 h后黏附率均在90%以上。
表1
兔角膜基質細胞在不同材料上的黏附率(%)
Table1.
Adhesion rate of rabbit corneal stromal cells on different materials (%)
由圖 6可知，兔角膜基質細胞在復合膜材料上生長第1天時，細胞形態沒有伸展且數目較少；隨著培養時間增加，第3天時，細胞在材料上逐漸增多；在第5天時細胞在材料表面生長規整，形態為長梭形。由于第5天時細胞已鋪滿材料表面，第7天時的細胞圖片與第5天生長狀態基本相似，所以沒有給出第7天的細胞圖片。復合膜上的細胞熒光值與96孔板對照組無顯著差異，明顯優于純絲素膜，說明復合膜能夠很好地支持細胞增殖，細胞相容性良好。
圖6
不同天數細胞生長形態與增殖率
Figure6.
Cellular morphology and fluorescence value in different days
3 討論
文獻證實角膜細胞能夠在絲素蛋白材料上黏附并且正常增殖生長[25] 。絲素作為角膜細胞載體或角膜替代材料具有一定可行性。絲素蛋白是一種聚酰胺，與小分子酰胺之間具有相似的分子結構，甲酰胺作為小分子溶劑，可以實現與絲素較好的相容。
甲酰胺/絲素復合膜減小了原來絲素大分子之間的作用，斷裂強度較純絲素的有所降低，人眼角膜的濕態拉伸強度為(3.81±0.41) MPa[26]，所以該復合膜仍能滿足角膜替代材料對機械強度的要求。甲酰胺與絲素結合形成少量的結晶結構同時抑制復合膜的水溶性，改善純絲素膜易溶于水的缺點，獲得水不溶性絲素膜。甲酰胺/絲素復合膜可形成Silk Ⅰ結晶結構以及Silk Ⅰ、Silk Ⅱ共存的結構。當復合膜為Silk Ⅰ結晶結構時，降解達到最快，Silk Ⅱ結晶結構降解速率稍慢。甲酰胺/絲素膜能夠被膠原酶降解，23 d后質量剩余70%左右，為替代材料體內的逐步降解吸收提供了可能。根據甲酰胺/絲素膜細胞培養情況可推斷甲酰胺比例為絲素的10%時，并未對細胞造成不良影響，這或許是甲酰胺浸泡后被溶出，只有對細胞生長并無影響的微量殘留，所以甲酰胺/絲素膜能支持兔角膜基質細胞的正常生長增殖。因此該復合膜有望成為良好的角膜基質修復材料。
4 結論
絲素蛋白與甲酰胺混合所制備的復合膜，當甲酰胺/絲素比例為1/10時，復合膜具有較好的力學性能，透明性較好，可降解并且降解時間適當，可以支持角膜基質細胞正常生長，該復合膜可能成為角膜基質修復的理想材料。
