本研究探討人臍血間充質干細胞(HUCBMSCs)移植對大鼠創傷性腦損傷(TBI)模型的神經特異性蛋白分泌的調節和腦保護作用機制, 旨在為腦損傷的干細胞治療提供理論依據。研究中將用Brdu標記的HUCBMSCs經鼠尾靜脈植入大鼠TBI模型。檢測和比較假傷組、損傷組和移植組大鼠血漿生化指標(NSE、S100β蛋白、LDH、CK)的改變。采用HE染色觀察損傷組、假傷組及移植組大鼠腦損傷周邊區組織光鏡下形態學變化。在整個實驗過程中4組大鼠均未使用免疫抑制劑。實驗結果表明移植組大鼠均未發生移植相關的死亡。損傷組大鼠在損傷后早期即可見NSE、S100β蛋白、LDH、CK指標有所升高, 各時間點與假傷組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。HUCBMSCs移植組大鼠在損傷后上述生化指標在早期有所增高, 但隨著時間進展, 移植組血清NSE、S100β蛋白、LDH、CK濃度下降, 與損傷組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。組織學檢測可見移植組腦組織病理改變較損傷組輕微。通過研究我們認為未應用免疫抑制劑的情況下, 經尾靜脈注射HUCBMSCs能減少血清NSE、S100β蛋白、LDH和CK的分泌, 有效促進組織損傷的修復, 有助于神經功能的恢復。
引用本文： 趙俊暕, 石峻, 邵坤, 王沂, 孟愛國, 曾小芳, 陳乃耀. 間充質干細胞移植對腦損傷大鼠神經生化標志物分泌的調節. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(1): 152-156. doi: 10.7507/1001-5515.20150028 復制
引言
創傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)是威脅公眾健康的普遍問題。近年來，腦損傷標志物如神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)、S100β蛋白、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、肌酸肌酶(creatine kinase, CK)等逐漸成為研究熱點。腦損傷后血清生化標志物的改變可及早對病情做出判斷，對減少腦損傷后遺癥、改善預后有著重要的臨床意義。
近年來人臍血間充質干細胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells, HUCBMSCs)的深入研究，為腦損傷的治療及修復提供了嶄新的思路[1]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一群中胚層來源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞。MSCs免疫原性低[2]，其免疫調節效應是沒有抗原特異性和選擇性的，在臨床應用方面具有更加廣闊的前景。
本次實驗擬利用大鼠創傷性腦損傷模型，觀察HUCBMSCs移植后大鼠腦組織學變化及評價腦外傷大鼠神經功能恢復，研究損傷后大鼠血清NSE、S100β蛋白、LDH、CK的改變以及觀察移植間充質干細胞對這種創傷的調節作用，旨在進一步探討HUCBMSCs移植的腦保護作用機制，為腦損傷的干細胞治療提供相關理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和儀器
Elecsys2010電化學發光免疫分析儀(瑞士ROCHE公司)；全自動生化分析儀日立7180；檢測所用分析儀均經過校準，并且質控結果合格。S100β、NSE、LDH、CK試劑盒(瑞士ROCHE公司)；Image-Pro Plus 6.0數碼醫學圖像分析系統(麥克奧迪儀器儀表有限公司)；自由落體儀(河北聯合大學解剖教研室)。
1.2 MSCs標記
將HUCBMSCs(由中國醫學科學院血液學研究所饋贈)接種于含完全DMEM/F-12培養液的T-25塑料培養瓶中，常規細胞培養，每3 d換液一次至第4代。移植前72 h，于培養基中加入200μmol/L的Brdu進行細胞標記。Brdu摻入后72 h，免疫組化染色顯示80％~90％細胞Brdu表達陽性，表明MSCs的標記率達到80％~90％。用胰蛋白酶消化，吹打重懸成單細胞懸液，制成終濃度為4×106個/mL，移植備用。
1.3 實驗動物分組和TBI模型制作
健康成年SD大鼠95只(清潔級)，均為雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體重250~350 g，自然光照，自由進食喂養。將大鼠編號后隨機抽樣分為對照組(不做任何處理，5只)、假傷組(只開骨窗，不撞擊硬腦膜，30只)、損傷組(損傷后注射等量PBS，30只)和移植組(損傷后移植HUCBMSCs，30只)。針對實驗大鼠大體情況，以對照組為參照進行觀察。
在麻醉后剪去大鼠頭部及左側股內側毛發，于矢狀正中線切開頭皮約2.0 cm，分離皮下組織及骨膜。暴露前囟、冠狀縫、矢狀縫和雙側頂骨，于右側中線旁2 mm、冠狀縫后4 mm處，用牙科鉆鉆一直徑約5 mm的骨窗，保持硬腦膜的完整，骨蠟止血。損傷組和移植組大鼠采用自由落體腦損傷模型制作方法(改進的Feeney自由落體方法)[3]，以20 g擊錘(底面直徑約4 mm)從自由落體儀30 cm高處自由墜落，撞擊大鼠硬腦膜，撞擊致傷力為0.048 N·s，致傷部位右額頂部，造成中度腦挫裂傷，縫合頭皮。致傷后大鼠分籠喂養，出現四肢抽搐，呼吸暫停數秒，術后昏迷2~3 h，說明造模成功。
1.4 MSCs移植
在造模成功后5小時，移植組大鼠均經尾靜脈緩慢注入4×106個/mL HUCBMSCs(以1 mL PBS液溶解)，留針5 min后緩慢拔針；損傷組大鼠經尾靜脈注入等體積的PBS液；假手術組不作任何處理。注射后分籠喂養。剩余的細胞行臺盼藍染色檢測細胞活性，結果顯示90％以上細胞存活。4組大鼠實驗過程中均未用免疫抑制劑。
1.5 神經生化標志物的檢測
假傷組、損傷組和移植組在造模后第1、2、3、5、7天，各取6只大鼠腹腔內注射0.35 mL/100 mg 10%水合氯醛，經腹主動脈取血，用促凝管收集血液，待血液凝固后經3 000 r/min離心15 min，提取血清，采用全自動生化檢測儀檢測血清LDH、CK，采用電化學分析儀檢測血清NSE、S100β蛋白。
1.6 腦組織學評價
造模后1天，假傷組、損傷組和移植組各取6只大鼠采血后處死，給予10%水合氯醛腹腔內注射麻醉，內固定，完整取出腦組織，切下損傷灶及周邊3 mm區域的腦組織，于4%多聚甲醛中固定24 h，常規石蠟包埋切片和HE染色，光鏡下觀察腦組織改變情況。
1.7 統計學處理
實驗數據以均數±標準差(
2 結果
2.1 HUCBMSCs移植后腦組織形態學改變
本實驗是異種異體移植，在整個實驗過程中4組大鼠均未使用免疫抑制劑，移植組大鼠均未發現免疫排斥反應。光鏡下假傷組大鼠腦組織結構基本正常，未見明顯病理改變，細胞質淡紅色，胞核呈藍色，部分細胞可見核仁[圖 1(a)]。損傷組大鼠受損皮層組織破壞，損傷中心區可見大量的壞死細胞，胞核皺縮，細胞結構消失[見圖 1(b)]。移植組組織壞死范圍縮小，細胞結構較損傷組完整，核固縮較損傷組明顯減輕[見圖 1(c)]。
圖1
造模后1 d假傷組、損傷組、移植組大鼠腦組織形態學改變(HE染色，100×)
(a)假傷組；(b)損傷組；(c)移植組
Figure1. Morphological changes of brain tissues in shamed group, harm group and transplantation group one day after injection(stained with hematoxylin eosin, magnified 100 times)(a) shamed group; (b) injury group; (c) transplantation group
2.2 腦組織損傷后血清特異蛋白的檢測
本實驗檢測了血清NSE、S100β蛋白、LDH、CK，結果如表 1~4所示。對照組上述指標表達量極少，未進行統計學檢驗。假傷組各個時間點上述生化指標沒有明顯改變。損傷組大鼠在損傷后早期即可見NSE、S100β蛋白、LDH、CK指標有所升高，各時間點與假傷組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。移植組這些生化指標在早期有所增高，但隨著時間進展濃度值逐漸減低；移植組在傷后第2 d起血清S100β蛋白濃度較損傷組降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；移植組在傷后第1~7 d血清NSE、LDH、CK濃度均較損傷組降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。
表1
不同時間點各組大鼠血清S100β蛋白含量(μg/L, n=6)
Table1.
Serum S100βprotein in every groups at different time points (μg/L, n=6)
表2
不同時間點各組大鼠血清NSE含量(μg/L, n=6)
Table2.
Serum NSE in every groups at different time points (μg/L, n=6)
表3
不同時間點各組大鼠血清LDH含量(U/L, n=6)
Table3.
Serum LDH in every groups at different time points (U/L, n=6)
表4
不同時間點各組大鼠血清CK含量(U/L, n=6)
Table4.
Serum CK in every groups at different time points (U/L, n=6)
3 討論
臍血源MSCs來源廣泛，取材方便，無倫理學爭議，且干細胞量大、易于分離純化；受病毒、細菌污染的機率低[4-5]，MSCs的免疫原性低，很難被HLA不相容受體所識別，使MSCs細胞可應用于異源性或異種的移植治療中，是一種可靠的細胞來源。
NSE主要存在于中樞神經系統的神經元和神經內分泌細胞內，作為神經細胞分化成熟及神經細胞損傷的重要標志，其含量可敏感而特異性地反映神經元損傷的程度[6]。S100β是神經系統的特異性蛋白，被稱為中樞系統的C反應蛋白[7]。神經系統疾病如急性腦梗死[8]、體外循環腦損傷[9]等，細胞因子IL-1、IL-6、5-HT等能刺激星型膠質細胞的增殖與活化，導致S100β蛋白過度表達[10]。Scotto等[11]研究表明血清高濃度S100β蛋白參與了創傷后的神經變性過程，S100β蛋白可以刺激膠質細胞活化，誘導炎性分子如IL-l、一氧化氮合酶(NOS)和TNF-ɑ等的合成，導致細胞凋亡，并能通過一氧化氮依賴途徑誘導神經元細胞死亡[12-13]。同時S100β蛋白與IL-1β、TNF-ɑ可上調COX-2在小膠質細胞中的表達[14]，且COX-2和TNF-ɑ在炎性過程中起關鍵作用，共同參與腦損傷的多種病理反應。血清S100β蛋白水平的持續升高，提示了腦損傷后持續的繼發性損傷，繼發性腦損害又使血腦屏障受到進一步破壞，使NSE和S100β蛋白濃度進一步增高。可見血清中NSE和S100β蛋白濃度的高低反映了神經細胞和膠質細胞的損害程度，其含量與神經功能缺損程度呈正相關[15]。血清酶學指標廣泛應用于臨床檢測中，有研究表明LDH和CK的變化是判定組織器官傷情的有效指標[16]，雖然血清酶指標的升高缺乏一定特異性，但仍是反映傷情嚴重程度和評價治療效果的重要依據[17-18]。
連續監測血清NSE、S100β蛋白、LDH等為早期診斷腦損傷、進行病情評估提供了可靠依據，Hermarm等[15]對腦外傷患者的研究發現，其血清的NSE和S100β蛋白濃度均有升高，并與腦挫傷的體積相關。我們的實驗也發現創傷性腦損傷后損傷組大鼠各個時間點的血清的NSE、S100β蛋白、LDH和CK含量均較假傷組明顯增高。
在前期實驗中我們應用NSS系統對各組不同時間點大鼠進行評分，發現移植組大鼠神經功能得分較損傷組得分降低，MSCs移植能有效促進腦損傷大鼠神經功能的恢復[19]。本實驗中我們同時觀察到移植組大鼠各個時間點的血清的NSE和S100β蛋白、LDH和CK含量均較損傷組減低，表明神經功能的恢復可能與血清中神經生化特異蛋白的分泌減低有關。可能的機制是TBI早期MSCs的移植使神經特異蛋白分泌減低，S100β蛋白、NSE等可抑制炎性細胞因子的釋放，減輕過度炎癥反應導致的毒性作用，組織學損傷也有所減輕，并有可能減少繼發性腦損傷的發生發展。創傷大鼠移植MSCs能有效保護重要器官，無疑加速了神經功能恢復的速度，提示HUCBMSCs移植將為創傷性腦損傷提供一種可能的治療新方法。
引言
創傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)是威脅公眾健康的普遍問題。近年來，腦損傷標志物如神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)、S100β蛋白、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、肌酸肌酶(creatine kinase, CK)等逐漸成為研究熱點。腦損傷后血清生化標志物的改變可及早對病情做出判斷，對減少腦損傷后遺癥、改善預后有著重要的臨床意義。
近年來人臍血間充質干細胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells, HUCBMSCs)的深入研究，為腦損傷的治療及修復提供了嶄新的思路[1]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一群中胚層來源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞。MSCs免疫原性低[2]，其免疫調節效應是沒有抗原特異性和選擇性的，在臨床應用方面具有更加廣闊的前景。
本次實驗擬利用大鼠創傷性腦損傷模型，觀察HUCBMSCs移植后大鼠腦組織學變化及評價腦外傷大鼠神經功能恢復，研究損傷后大鼠血清NSE、S100β蛋白、LDH、CK的改變以及觀察移植間充質干細胞對這種創傷的調節作用，旨在進一步探討HUCBMSCs移植的腦保護作用機制，為腦損傷的干細胞治療提供相關理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和儀器
Elecsys2010電化學發光免疫分析儀(瑞士ROCHE公司)；全自動生化分析儀日立7180；檢測所用分析儀均經過校準，并且質控結果合格。S100β、NSE、LDH、CK試劑盒(瑞士ROCHE公司)；Image-Pro Plus 6.0數碼醫學圖像分析系統(麥克奧迪儀器儀表有限公司)；自由落體儀(河北聯合大學解剖教研室)。
1.2 MSCs標記
將HUCBMSCs(由中國醫學科學院血液學研究所饋贈)接種于含完全DMEM/F-12培養液的T-25塑料培養瓶中，常規細胞培養，每3 d換液一次至第4代。移植前72 h，于培養基中加入200μmol/L的Brdu進行細胞標記。Brdu摻入后72 h，免疫組化染色顯示80％~90％細胞Brdu表達陽性，表明MSCs的標記率達到80％~90％。用胰蛋白酶消化，吹打重懸成單細胞懸液，制成終濃度為4×106個/mL，移植備用。
1.3 實驗動物分組和TBI模型制作
健康成年SD大鼠95只(清潔級)，均為雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體重250~350 g，自然光照，自由進食喂養。將大鼠編號后隨機抽樣分為對照組(不做任何處理，5只)、假傷組(只開骨窗，不撞擊硬腦膜，30只)、損傷組(損傷后注射等量PBS，30只)和移植組(損傷后移植HUCBMSCs，30只)。針對實驗大鼠大體情況，以對照組為參照進行觀察。
在麻醉后剪去大鼠頭部及左側股內側毛發，于矢狀正中線切開頭皮約2.0 cm，分離皮下組織及骨膜。暴露前囟、冠狀縫、矢狀縫和雙側頂骨，于右側中線旁2 mm、冠狀縫后4 mm處，用牙科鉆鉆一直徑約5 mm的骨窗，保持硬腦膜的完整，骨蠟止血。損傷組和移植組大鼠采用自由落體腦損傷模型制作方法(改進的Feeney自由落體方法)[3]，以20 g擊錘(底面直徑約4 mm)從自由落體儀30 cm高處自由墜落，撞擊大鼠硬腦膜，撞擊致傷力為0.048 N·s，致傷部位右額頂部，造成中度腦挫裂傷，縫合頭皮。致傷后大鼠分籠喂養，出現四肢抽搐，呼吸暫停數秒，術后昏迷2~3 h，說明造模成功。
1.4 MSCs移植
在造模成功后5小時，移植組大鼠均經尾靜脈緩慢注入4×106個/mL HUCBMSCs(以1 mL PBS液溶解)，留針5 min后緩慢拔針；損傷組大鼠經尾靜脈注入等體積的PBS液；假手術組不作任何處理。注射后分籠喂養。剩余的細胞行臺盼藍染色檢測細胞活性，結果顯示90％以上細胞存活。4組大鼠實驗過程中均未用免疫抑制劑。
1.5 神經生化標志物的檢測
假傷組、損傷組和移植組在造模后第1、2、3、5、7天，各取6只大鼠腹腔內注射0.35 mL/100 mg 10%水合氯醛，經腹主動脈取血，用促凝管收集血液，待血液凝固后經3 000 r/min離心15 min，提取血清，采用全自動生化檢測儀檢測血清LDH、CK，采用電化學分析儀檢測血清NSE、S100β蛋白。
1.6 腦組織學評價
造模后1天，假傷組、損傷組和移植組各取6只大鼠采血后處死，給予10%水合氯醛腹腔內注射麻醉，內固定，完整取出腦組織，切下損傷灶及周邊3 mm區域的腦組織，于4%多聚甲醛中固定24 h，常規石蠟包埋切片和HE染色，光鏡下觀察腦組織改變情況。
1.7 統計學處理
實驗數據以均數±標準差(
2 結果
2.1 HUCBMSCs移植后腦組織形態學改變
本實驗是異種異體移植，在整個實驗過程中4組大鼠均未使用免疫抑制劑，移植組大鼠均未發現免疫排斥反應。光鏡下假傷組大鼠腦組織結構基本正常，未見明顯病理改變，細胞質淡紅色，胞核呈藍色，部分細胞可見核仁[圖 1(a)]。損傷組大鼠受損皮層組織破壞，損傷中心區可見大量的壞死細胞，胞核皺縮，細胞結構消失[見圖 1(b)]。移植組組織壞死范圍縮小，細胞結構較損傷組完整，核固縮較損傷組明顯減輕[見圖 1(c)]。
圖1
造模后1 d假傷組、損傷組、移植組大鼠腦組織形態學改變(HE染色，100×)
(a)假傷組；(b)損傷組；(c)移植組
Figure1. Morphological changes of brain tissues in shamed group, harm group and transplantation group one day after injection(stained with hematoxylin eosin, magnified 100 times)(a) shamed group; (b) injury group; (c) transplantation group
2.2 腦組織損傷后血清特異蛋白的檢測
本實驗檢測了血清NSE、S100β蛋白、LDH、CK，結果如表 1~4所示。對照組上述指標表達量極少，未進行統計學檢驗。假傷組各個時間點上述生化指標沒有明顯改變。損傷組大鼠在損傷后早期即可見NSE、S100β蛋白、LDH、CK指標有所升高，各時間點與假傷組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。移植組這些生化指標在早期有所增高，但隨著時間進展濃度值逐漸減低；移植組在傷后第2 d起血清S100β蛋白濃度較損傷組降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；移植組在傷后第1~7 d血清NSE、LDH、CK濃度均較損傷組降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。
表1
不同時間點各組大鼠血清S100β蛋白含量(μg/L, n=6)
Table1.
Serum S100βprotein in every groups at different time points (μg/L, n=6)
表2
不同時間點各組大鼠血清NSE含量(μg/L, n=6)
Table2.
Serum NSE in every groups at different time points (μg/L, n=6)
表3
不同時間點各組大鼠血清LDH含量(U/L, n=6)
Table3.
Serum LDH in every groups at different time points (U/L, n=6)
表4
不同時間點各組大鼠血清CK含量(U/L, n=6)
Table4.
Serum CK in every groups at different time points (U/L, n=6)
3 討論
臍血源MSCs來源廣泛，取材方便，無倫理學爭議，且干細胞量大、易于分離純化；受病毒、細菌污染的機率低[4-5]，MSCs的免疫原性低，很難被HLA不相容受體所識別，使MSCs細胞可應用于異源性或異種的移植治療中，是一種可靠的細胞來源。
NSE主要存在于中樞神經系統的神經元和神經內分泌細胞內，作為神經細胞分化成熟及神經細胞損傷的重要標志，其含量可敏感而特異性地反映神經元損傷的程度[6]。S100β是神經系統的特異性蛋白，被稱為中樞系統的C反應蛋白[7]。神經系統疾病如急性腦梗死[8]、體外循環腦損傷[9]等，細胞因子IL-1、IL-6、5-HT等能刺激星型膠質細胞的增殖與活化，導致S100β蛋白過度表達[10]。Scotto等[11]研究表明血清高濃度S100β蛋白參與了創傷后的神經變性過程，S100β蛋白可以刺激膠質細胞活化，誘導炎性分子如IL-l、一氧化氮合酶(NOS)和TNF-ɑ等的合成，導致細胞凋亡，并能通過一氧化氮依賴途徑誘導神經元細胞死亡[12-13]。同時S100β蛋白與IL-1β、TNF-ɑ可上調COX-2在小膠質細胞中的表達[14]，且COX-2和TNF-ɑ在炎性過程中起關鍵作用，共同參與腦損傷的多種病理反應。血清S100β蛋白水平的持續升高，提示了腦損傷后持續的繼發性損傷，繼發性腦損害又使血腦屏障受到進一步破壞，使NSE和S100β蛋白濃度進一步增高。可見血清中NSE和S100β蛋白濃度的高低反映了神經細胞和膠質細胞的損害程度，其含量與神經功能缺損程度呈正相關[15]。血清酶學指標廣泛應用于臨床檢測中，有研究表明LDH和CK的變化是判定組織器官傷情的有效指標[16]，雖然血清酶指標的升高缺乏一定特異性，但仍是反映傷情嚴重程度和評價治療效果的重要依據[17-18]。
連續監測血清NSE、S100β蛋白、LDH等為早期診斷腦損傷、進行病情評估提供了可靠依據，Hermarm等[15]對腦外傷患者的研究發現，其血清的NSE和S100β蛋白濃度均有升高，并與腦挫傷的體積相關。我們的實驗也發現創傷性腦損傷后損傷組大鼠各個時間點的血清的NSE、S100β蛋白、LDH和CK含量均較假傷組明顯增高。
在前期實驗中我們應用NSS系統對各組不同時間點大鼠進行評分，發現移植組大鼠神經功能得分較損傷組得分降低，MSCs移植能有效促進腦損傷大鼠神經功能的恢復[19]。本實驗中我們同時觀察到移植組大鼠各個時間點的血清的NSE和S100β蛋白、LDH和CK含量均較損傷組減低，表明神經功能的恢復可能與血清中神經生化特異蛋白的分泌減低有關。可能的機制是TBI早期MSCs的移植使神經特異蛋白分泌減低，S100β蛋白、NSE等可抑制炎性細胞因子的釋放，減輕過度炎癥反應導致的毒性作用，組織學損傷也有所減輕，并有可能減少繼發性腦損傷的發生發展。創傷大鼠移植MSCs能有效保護重要器官，無疑加速了神經功能恢復的速度，提示HUCBMSCs移植將為創傷性腦損傷提供一種可能的治療新方法。
