為探討奇異變形桿菌(PM)螺紋遷徙生長現象產生的原因。通過對細菌波動培養的接種時間、濕度、接種手法、培養時平板放置、外加磁場和酸堿度等因素的改變, 觀察PM螺紋遷徙生長現象。結果顯示在密封罐里進行波動培養的平板中出現螺紋遷徙生長現象的頻率較高, 不論什么時候接種、接種手法如何、磁場的有無、培養時平板放置的方式如何, 細菌在遷徙生長過程都能表現出螺旋遷徙生長現象, 而且細菌的螺旋環旋轉的方向都是逆時針。實驗結果證明, PM螺紋遷徙生長需要特定的酸堿度環境, 它的螺紋遷徙生長現象產生可能與其遺傳特性和地球的自轉有關。
引用本文： 何先元, 廖巳祥, 劉俊康, 李坤, 劉艷霞, 喻錄容. 奇異變形桿菌螺紋遷徙生長現象研究. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(1): 131-136. doi: 10.7507/1001-5515.20150024 復制
引言
奇異變形桿菌(Proteus mirabilis， PM)，在濕潤的固體瓊脂平板上常呈擴散生長，如接種于平板中心部位，培養24 h后形成以接種部位為中心的厚薄交替的波紋狀菌苔，稱為遷徙生長現象。第三軍醫大學生物波研究中心研究變形桿菌形態變化和遷徙狀生長的聯系，最早提出了生物波理論，提出并證實生物波的本質是群體細胞節律性自組織生命活動的過程[1-12]。在研究群體細胞波狀生長過程中，觀察到群體細菌細胞以子組織方式進行節律性同步生長，形成宏觀有序的細胞群體結構。在將PM菌種接種到LB平板中心，PM便會向四周生長擴散開來，起初先長出中心菌落斑，隨后便會產生紅環和黃環相間的細菌波動環，將這種生命活動的有序形式稱為生物波。偶然一次將PM菌種點種到LB平板上，放入電熱恒溫箱中培養，結果發現有些平板中的第一紅環變粗而且產生紅黃相間的螺旋狀環紋，從整體上來看像是湍流中的漩渦，類似一幅星云圖，將這種區別于以前的遷徙生長現象的現象稱之為螺紋遷徙生長現象。將螺紋遷徙生長平板與波紋遷徙生長平板進行比較(見圖 1)，可發現螺紋遷徙生長平板中有螺旋生長現象，中心菌落斑相對較大，紅環數在三左右且較粗，而其中的第一紅環因有螺旋生長的影響，所以比其它環都要粗。而波動環紋沒有螺旋生長這一現象，中心菌落斑相對較小，紅環數在五左右且較細，粗細均勻。本研究主要針對最新發現的奇異變形桿菌螺紋遷徙生長現象進行探討。
圖1
PM不同波紋遷徙生長現象
Figure1.
Different wave swarming growth phenomenon of PM
1 材料與方法
1.1 菌種
PM菌株為第三軍醫大學生物波研究室分離保存。
1.2 儀器及試劑
手提式不銹鋼蒸汽消毒器(上海三申醫療器械有限公司)，HH.Bll.500-BS電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療機械廠)，LH實驗室專用超純水機(重慶浪華實驗儀器設備有限公司)，KH-100 TDB型高頻數控超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)，密封罐(第三軍醫大學生物波研究室專利產品)。2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑(TTC)(國藥集團化學試劑有限公司)；丁二酸鈉(琥珀酸鈉)(中國醫藥(集團)上海化學試劑公司)。
1.3 試驗方法
1.3.1 指示反應
利用PM新陳代謝過程中產生的琥珀酸脫氫酶使無色的TTC還原為紅色的1，3，5-三苯甲臜(TPF)作為指示劑，使細菌菌落顯紅色，從而便于觀察和計數。
1.3.2 LB培養基
每100 mL中含：酵母提取物0.5 g、胰蛋白胨1.0 g、氯化鈉1.0 g、葡萄糖0.1 g；TTC 0.05 g，瓊脂1.5 g，pH值7.2~7.4，隨后制成LB平板。
1.3.3 PM波動遷徙培養方法
LB平板中心點種PM，置于密封罐中培養。培養條件：相對濕度40%，溫度變化范圍31~39℃，持續時間1 h，通氣量5 L/min。
2 結果與分析
2.1 濕度對螺紋遷徙生長影響
取6塊LB平板，在干燥恒溫培養箱38℃下分別烘烤0、10、20、30、40、50 min，然后用相同的方法以同一菌株同時接種后放入密封罐培養。結果如圖 2所示，LB平板烘烤0~20 min時，基本不能出現波動生長現象，30~40 min能夠形成穩定的環紋波動生長現象，烘烤50 min以上，細菌波動生長現象又不明顯了。所以LB平板需要在38℃下烘烤40 min左右，才容易看到細菌波動生長。但是基本沒有形成螺紋遷徙生長現象。
圖2
濕度對奇異變形桿菌螺紋遷徙生長現象的影響
Figure2.
Effect of humidity on whorl swarming growth phenomenon of PM
2.2 酸堿度對螺紋遷徙生長的影響
取pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的LB平板，以相同的手法接種同一PM菌種，置于同一密封罐中，放入電熱恒溫培養箱里培養，18 h后觀察結果，如圖 3所示。pH7.0~8.0的LB平板出現了螺紋遷徙生長現象，pH6.0以下生長較差，pH6.0出現寬環的波動生長，pH8.5螺紋遷徙生長現象減弱，pH9.0僅出現寬環的波動生長現象。
圖3
酸堿度對PM螺紋遷徙生長現象的影響
Figure3.
Effect of pH for whorl swarming growth phenomenon of PM
2.3 氣體環境對螺紋遷徙生長的影響
取12塊LB平板，隨機分成4組，每組3個，用相同的方法接種同一株PM菌，分別放入4個密封罐中。第1組不做任何處理；第2組全部充入氮氣；第3組全部充入二氧化碳；第4組充入20％二氧化碳、60%氮氣、20%氫氣并放入活化后的鈀粒(可催化氫氣與氧氣生成水)。將密封罐放進電熱恒溫箱中培養，18 h后觀察結果。如圖 4所示，第1組出現了螺紋遷徙生長現象，第2組出現顯色比較淺的波動生長現象，第3組和第4組生長不明顯。
圖4
氣體環境對螺紋遷徙生長的影響
Figure4.
Effect of gas atmospheres for whorl swarming growth phenomenon of PM
2.4 接種時間對螺紋遷徙生長的影響
取9塊LB平板，隨機分成3組，每組3個，用相同的方法以同一菌株分別在9 :30、13 :30和18 :30接種培養，結果如圖 5所示，均有螺紋遷徙生長現象的出現。說明接種時間與波動螺紋的出現無關。
圖5
接種時間對螺紋遷徙生長的影響
Figure5.
Effect of inoculation time on whorl swarming growth phenomenon of PM
2.5 接種手法對螺紋遷徙生長的影響
選取6塊LB平板，隨機分成2組，每組3個。一組順時針接種，另一組逆時針接種，所用菌種都來自于同一菌株，在密封罐中培養，結果如圖 6所示，LB平板中都出現了螺紋遷徙生長現象，且方向一致。說明螺紋狀生長現象與接種手法無關。
圖6
接種手法對螺紋遷徙生長的影響
Figure6.
Effect of inoculation technique for whorl swarming growth phenomenon of PM
2.6 磁場對螺紋遷徙生長的影響
選取6塊LB平板，隨機分成2組，每組3個，以相同的方法接種同一株菌。一組同磁鐵一起放入密封罐中培養，另一組直接放入密封罐中培養。檢驗磁場對奇異變形桿菌螺紋遷徙生長的影響，結果如圖 7所示都出現了螺紋，且螺旋方向一致。說明磁場對螺紋遷徙生長的沒有影響。
圖7
磁場對螺紋遷徙生長的影響
Figure7.
Effect of magnetic field on whorl swarming growth phenomenon of PM
2.7 位置對螺紋遷徙生長的影響
選取9塊LB平板，隨機分成3組，每組3個，以相同的方法接種同一株PM菌。第1組培養皿底部向下，第2組培養皿底部向上，第3組培養皿豎直放入同一密封罐中培養。檢驗培養皿放置方式不同對奇異變形桿菌螺紋遷徙生長的影響，結果如圖 8所示，平板中都出現了波動螺紋，且方向一致。說明培養皿放置方式不影響螺紋遷徙生長現象的出現。
圖8
培養皿放置方式對螺紋遷徙生長的影響
Figure8.
Effect of dish position on whorl swarming growth phenomenon of PM
3 結論與討論
通過一系列的研究，最新發現的螺紋遷徙生長現象，酸堿度是其產生的關鍵因素，其他適應PM生長的因素如濕度、接種手法、接種時間、氣體環境、磁場、培養皿放置方式等對螺紋遷徙生長現象基本沒有影響。濕度只是影響波動生長的重要因素，如果濕度過大，整個培養基表面都會長滿菌落；如果濕度過小，波動就無法形成，而且波動環也會變得越來越細，甚至連細菌都難以生長；同時也發現在純二氧化碳條件下PM無法生長；在純氮氣條件下PM雖能生長，但生長情況遠不及在適度有氧條件下的好，也僅只能形成波動環紋，所以波動環紋生長是螺紋遷徙生長的基礎；螺紋的旋轉方向與外加磁場和接種的手法無關；在培養過程中，將LB平板正放和倒置培養，其波動螺紋的旋轉方向都一致，這一現象與自然界中的某些滕蔓植物的生長特性類似，牽牛花藤在旋轉時，一律按逆時針方向盤旋而上，如果人為地將其纏成右旋，后生出來的新藤仍就恢復其左旋特性。一般認為，植物的莖蔓的左右旋轉生長的現象是由于南北半球的地球引力和磁力線的共同作用，同時也是植物的遺傳特性。
PM與臨床關系較密切，在腸道中與其他菌組成了繼發性感染的條件致病菌，同時也可以作為感染的檢測指標。PM螺旋遷徙生長現象的發現，對于探索其在腸道微生態環境中的生長規律具有重要的意義，螺紋遷徙生長是其固有的遺傳特征，還是一個新變種，對于檢測和治療細菌感染都具有積極作用，同時對從微觀世界探討生物螺旋生長的機理提供了新的科學依據和研究思路。
引言
奇異變形桿菌(Proteus mirabilis， PM)，在濕潤的固體瓊脂平板上常呈擴散生長，如接種于平板中心部位，培養24 h后形成以接種部位為中心的厚薄交替的波紋狀菌苔，稱為遷徙生長現象。第三軍醫大學生物波研究中心研究變形桿菌形態變化和遷徙狀生長的聯系，最早提出了生物波理論，提出并證實生物波的本質是群體細胞節律性自組織生命活動的過程[1-12]。在研究群體細胞波狀生長過程中，觀察到群體細菌細胞以子組織方式進行節律性同步生長，形成宏觀有序的細胞群體結構。在將PM菌種接種到LB平板中心，PM便會向四周生長擴散開來，起初先長出中心菌落斑，隨后便會產生紅環和黃環相間的細菌波動環，將這種生命活動的有序形式稱為生物波。偶然一次將PM菌種點種到LB平板上，放入電熱恒溫箱中培養，結果發現有些平板中的第一紅環變粗而且產生紅黃相間的螺旋狀環紋，從整體上來看像是湍流中的漩渦，類似一幅星云圖，將這種區別于以前的遷徙生長現象的現象稱之為螺紋遷徙生長現象。將螺紋遷徙生長平板與波紋遷徙生長平板進行比較(見圖 1)，可發現螺紋遷徙生長平板中有螺旋生長現象，中心菌落斑相對較大，紅環數在三左右且較粗，而其中的第一紅環因有螺旋生長的影響，所以比其它環都要粗。而波動環紋沒有螺旋生長這一現象，中心菌落斑相對較小，紅環數在五左右且較細，粗細均勻。本研究主要針對最新發現的奇異變形桿菌螺紋遷徙生長現象進行探討。
圖1
PM不同波紋遷徙生長現象
Figure1.
Different wave swarming growth phenomenon of PM
1 材料與方法
1.1 菌種
PM菌株為第三軍醫大學生物波研究室分離保存。
1.2 儀器及試劑
手提式不銹鋼蒸汽消毒器(上海三申醫療器械有限公司)，HH.Bll.500-BS電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療機械廠)，LH實驗室專用超純水機(重慶浪華實驗儀器設備有限公司)，KH-100 TDB型高頻數控超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)，密封罐(第三軍醫大學生物波研究室專利產品)。2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑(TTC)(國藥集團化學試劑有限公司)；丁二酸鈉(琥珀酸鈉)(中國醫藥(集團)上海化學試劑公司)。
1.3 試驗方法
1.3.1 指示反應
利用PM新陳代謝過程中產生的琥珀酸脫氫酶使無色的TTC還原為紅色的1，3，5-三苯甲臜(TPF)作為指示劑，使細菌菌落顯紅色，從而便于觀察和計數。
1.3.2 LB培養基
每100 mL中含：酵母提取物0.5 g、胰蛋白胨1.0 g、氯化鈉1.0 g、葡萄糖0.1 g；TTC 0.05 g，瓊脂1.5 g，pH值7.2~7.4，隨后制成LB平板。
1.3.3 PM波動遷徙培養方法
LB平板中心點種PM，置于密封罐中培養。培養條件：相對濕度40%，溫度變化范圍31~39℃，持續時間1 h，通氣量5 L/min。
2 結果與分析
2.1 濕度對螺紋遷徙生長影響
取6塊LB平板，在干燥恒溫培養箱38℃下分別烘烤0、10、20、30、40、50 min，然后用相同的方法以同一菌株同時接種后放入密封罐培養。結果如圖 2所示，LB平板烘烤0~20 min時，基本不能出現波動生長現象，30~40 min能夠形成穩定的環紋波動生長現象，烘烤50 min以上，細菌波動生長現象又不明顯了。所以LB平板需要在38℃下烘烤40 min左右，才容易看到細菌波動生長。但是基本沒有形成螺紋遷徙生長現象。
圖2
濕度對奇異變形桿菌螺紋遷徙生長現象的影響
Figure2.
Effect of humidity on whorl swarming growth phenomenon of PM
2.2 酸堿度對螺紋遷徙生長的影響
取pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的LB平板，以相同的手法接種同一PM菌種，置于同一密封罐中，放入電熱恒溫培養箱里培養，18 h后觀察結果，如圖 3所示。pH7.0~8.0的LB平板出現了螺紋遷徙生長現象，pH6.0以下生長較差，pH6.0出現寬環的波動生長，pH8.5螺紋遷徙生長現象減弱，pH9.0僅出現寬環的波動生長現象。
圖3
酸堿度對PM螺紋遷徙生長現象的影響
Figure3.
Effect of pH for whorl swarming growth phenomenon of PM
2.3 氣體環境對螺紋遷徙生長的影響
取12塊LB平板，隨機分成4組，每組3個，用相同的方法接種同一株PM菌，分別放入4個密封罐中。第1組不做任何處理；第2組全部充入氮氣；第3組全部充入二氧化碳；第4組充入20％二氧化碳、60%氮氣、20%氫氣并放入活化后的鈀粒(可催化氫氣與氧氣生成水)。將密封罐放進電熱恒溫箱中培養，18 h后觀察結果。如圖 4所示，第1組出現了螺紋遷徙生長現象，第2組出現顯色比較淺的波動生長現象，第3組和第4組生長不明顯。
圖4
氣體環境對螺紋遷徙生長的影響
Figure4.
Effect of gas atmospheres for whorl swarming growth phenomenon of PM
2.4 接種時間對螺紋遷徙生長的影響
取9塊LB平板，隨機分成3組，每組3個，用相同的方法以同一菌株分別在9 :30、13 :30和18 :30接種培養，結果如圖 5所示，均有螺紋遷徙生長現象的出現。說明接種時間與波動螺紋的出現無關。
圖5
接種時間對螺紋遷徙生長的影響
Figure5.
Effect of inoculation time on whorl swarming growth phenomenon of PM
2.5 接種手法對螺紋遷徙生長的影響
選取6塊LB平板，隨機分成2組，每組3個。一組順時針接種，另一組逆時針接種，所用菌種都來自于同一菌株，在密封罐中培養，結果如圖 6所示，LB平板中都出現了螺紋遷徙生長現象，且方向一致。說明螺紋狀生長現象與接種手法無關。
圖6
接種手法對螺紋遷徙生長的影響
Figure6.
Effect of inoculation technique for whorl swarming growth phenomenon of PM
2.6 磁場對螺紋遷徙生長的影響
選取6塊LB平板，隨機分成2組，每組3個，以相同的方法接種同一株菌。一組同磁鐵一起放入密封罐中培養，另一組直接放入密封罐中培養。檢驗磁場對奇異變形桿菌螺紋遷徙生長的影響，結果如圖 7所示都出現了螺紋，且螺旋方向一致。說明磁場對螺紋遷徙生長的沒有影響。
圖7
磁場對螺紋遷徙生長的影響
Figure7.
Effect of magnetic field on whorl swarming growth phenomenon of PM
2.7 位置對螺紋遷徙生長的影響
選取9塊LB平板，隨機分成3組，每組3個，以相同的方法接種同一株PM菌。第1組培養皿底部向下，第2組培養皿底部向上，第3組培養皿豎直放入同一密封罐中培養。檢驗培養皿放置方式不同對奇異變形桿菌螺紋遷徙生長的影響，結果如圖 8所示，平板中都出現了波動螺紋，且方向一致。說明培養皿放置方式不影響螺紋遷徙生長現象的出現。
圖8
培養皿放置方式對螺紋遷徙生長的影響
Figure8.
Effect of dish position on whorl swarming growth phenomenon of PM
3 結論與討論
通過一系列的研究，最新發現的螺紋遷徙生長現象，酸堿度是其產生的關鍵因素，其他適應PM生長的因素如濕度、接種手法、接種時間、氣體環境、磁場、培養皿放置方式等對螺紋遷徙生長現象基本沒有影響。濕度只是影響波動生長的重要因素，如果濕度過大，整個培養基表面都會長滿菌落；如果濕度過小，波動就無法形成，而且波動環也會變得越來越細，甚至連細菌都難以生長；同時也發現在純二氧化碳條件下PM無法生長；在純氮氣條件下PM雖能生長，但生長情況遠不及在適度有氧條件下的好，也僅只能形成波動環紋，所以波動環紋生長是螺紋遷徙生長的基礎；螺紋的旋轉方向與外加磁場和接種的手法無關；在培養過程中，將LB平板正放和倒置培養，其波動螺紋的旋轉方向都一致，這一現象與自然界中的某些滕蔓植物的生長特性類似，牽牛花藤在旋轉時，一律按逆時針方向盤旋而上，如果人為地將其纏成右旋，后生出來的新藤仍就恢復其左旋特性。一般認為，植物的莖蔓的左右旋轉生長的現象是由于南北半球的地球引力和磁力線的共同作用，同時也是植物的遺傳特性。
PM與臨床關系較密切，在腸道中與其他菌組成了繼發性感染的條件致病菌，同時也可以作為感染的檢測指標。PM螺旋遷徙生長現象的發現，對于探索其在腸道微生態環境中的生長規律具有重要的意義，螺紋遷徙生長是其固有的遺傳特征，還是一個新變種，對于檢測和治療細菌感染都具有積極作用，同時對從微觀世界探討生物螺旋生長的機理提供了新的科學依據和研究思路。
