微型和集成化的生物傳感器為細胞電生理研究提供了強有力的手段。在電極陣列制作工藝上對傳感器芯片電極表面進行電鍍鉑黑處理,可以降低噪聲,提高靈敏度。為了量化分析電極表面納米鉑黑粒子的處理效果,本文提出了一種基于Monte-Carlo方法的網格搜索算法,給出了運算優化策略,實現了理想貼附條件下快速模擬一個數量級內粒徑分散度在20~200 nm范圍內均勻分布的納米粒子貼附于電極上的過程。在電極半徑為100 μm的尺度下,試驗次數n=10時的仿真處理時間從原方法的平均20 h優化為0.5 h,大大縮短了整個建模過程。應用本文方法進一步研究了在單/多層納米粒子表面處理時,不同電極尺寸、形狀對粒子貼附率和處理均一性的影響。仿真結果表明,理想實驗條件下在電極半徑小于100 μm時,隨著電極尺寸的增大,納米粒子有效貼附率增大,均勻化程度升高,有利于電極陣列重復性的定量評估。在相同電極面積條件下,圓形電極的表面貼附率效果優于方形等形狀的電極。
引用本文： 胡正添, 徐瑩, 郭淼, 孫智同, 李燕. 基于Monte-Carlo模型的電極表面處理快速仿真. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(6): 1361-1367. doi: 10.7507/1001-5515.20140258 復制
引言
細胞阻抗測量傳感器(electric cell-substrate impedance sensing,ECIS)是一種應用較為廣泛的生物傳感器[1]。ECIS平臺技術可以測量由于細胞形態變化、細胞移動或者細胞間相互接觸而引起的細胞層電阻變化。相關微陣列電極電鍍的交流電阻抗實驗說明，電鍍納米顆粒的有效沉積可以降低電極體阻抗、增大表面活化性[2]，從而提高傳感器的靈敏度。然而，目前對于電極表面處理的效果還沒有較直觀的理論仿真測試，只能采用電化學方法、光譜法、波譜法、石英微天平分析法和顯微學等實驗進行間接測試和直接觀察[3]。因此，本文使用計算機模擬來仿真細胞芯片的納米顆粒表面處理。考慮到納米粒子貼附過程是一個均勻分布的隨機過程,故采用Monte-Carlo方法進行建模研究[4]。Monte-Carlo方法不涉及復雜的數值計算,模擬的粒子數目和時間尺度接近真實的物理過程。但Monte-Carlo方法也存在計算量大、運算時間長的缺點。對此，本文提出了一種網格搜索算法，對時間冗長的Monte-Carlo測試程序做了優化與改進，在不影響分布結果的基礎上，將二維網格技術應用于程序中，大大縮短了一次模擬運算的時間。
1 ECIS電極及其表面處理
ECIS系統用于檢測細胞行為的平面電極可分為兩大類：單極電極和叉指電極(interdigitated electrodes,IDEs)[5]。IDEs系統相比于單極電極系統，有培養腔覆蓋面積大、電極尺寸微型、電極形狀多樣等優點，可根據不同的測試條件制作不同的電極形狀，靈活性較大，但在靈敏度和細胞分辨率上不及單極電極結構，后者可檢測到單細胞水平，而IDEs做不到。本文綜合考慮了靈敏度和檢測的有效性，選擇了幾種具代表性的商品化電極系統作為功能模塊電極來評估其表面處理效果及貼附細胞群體的阻抗信息變化。不同形狀的電極如圖 1所示[6]。
圖1
單極電極和叉指電極
Figure1.
Monopolar electrode and interdigitated electrodes
實際檢測時，由于細胞生長的隨機性和電極形狀的多樣性，必須使細胞耦合并定位在電極的有效區域才能檢測到細胞的動作電位，所以對電極的表面處理是銜接細胞一級傳感和芯片二級傳感的關鍵。Neher[7]指出，生物組織在自然情況下，細胞相互之間的間距是10~20 nm。經驗證，將細胞培養在人工材料制作的基底上，一般情況下細胞與基底的距離不小于40 nm。細胞與基底之間黏附的情況會直接影響微電極陣列對細胞電信號的捕捉能力，尤其是對那些不易貼壁生長的神經細胞來說，有時噪聲甚至會把生物信號淹沒掉。相關理論研究表明，雖然阻抗測試結果可說明細胞的生長及增殖情況，但電極的微型化使得表面體阻抗對測試結果的靈敏度影響較大，尤其是圓形ECIS單元部分。這主要是由于工作電極表面積較小，本體阻抗較大，造成靈敏度較低。可行辦法是在電極表面電鍍鉑黑顆粒后再進行相關的細胞組裝實驗，如圖 2所示。本課題組以往的電鍍實驗結果表明，電鍍后電極體阻抗在測試工作頻段內可減小一個數量級左右，大大提高了測試靈敏度[8]，所以表面處理的重要性不可忽視，尤其是不同形狀的電極表面處理更具研究意義。
圖2
二維芯片中叉指電極及圓形電極單元電鍍鉑顆粒圖
Figure2.
Photos of platinum black deposition on IDEs and circular monopolar electrode
通常微陣列電極表面處理為以下幾個步驟：首先是對微陣列電極進行鉑黑納米粒子電鍍，為了防止鉑黑顆粒貼附性的退化，在電生理測試前需進行電化學測試；然后是進行生物素的涂布，主要有旋涂、醺涂和滴涂法，涂布生物素是通過特殊的官能團來提高細胞的黏附性[9-10]；最后再經過無菌的PBS溶液多次清洗、生物素再沉積過程，當各電極達到均勻穩定的貼附程度后接種靶向細胞。但目前對于表面處理的效果還沒有較直觀的理論仿真測試，無法判斷電極上電鍍鉑黑納米顆粒并涂布生物素后電極表面均勻有機膜的上膜顆粒孔徑與有效程度，也無法分析不同尺度、不同形狀的電極貼附率之間的差異性，這些量化數據的缺失導致電生理實驗缺乏可重復性，成為快速分析的瓶頸。所以對電極-細胞耦合程度的量化分析是十分重要的，有助于后期實驗重現性、細胞與電極耦合有效性及細胞電生理信號特異識別性的提升。本文采用了Monte-Carlo統計模型，量化分析了不同條件下電極貼附率的差異性及納米粒子表面處理的有效性。
2 納米粒子貼附的Monte-Carlo模型
Monte-Carlo法在數學上稱為隨機模擬法、隨機抽樣技術或統計試驗法，基本思想是：為求解數學、物理及化學等問題，建立一個概率模型或隨機過程，使其參數等于問題的解；當所解的問題本身屬隨機性時，則可以采用直接模擬法，即根據實際物理情況的概率法則，來構造Monte-Carlo模型，然后通過對模型或過程的觀察或抽樣實驗來計算所求參數的統計特征，最后確定求解的近似值。生物科學中的Monte-Carlo模擬主要采用直接模擬法[11]。國內外已有許多相關的研究報道。沈良[12]對高分子納米材料凹凸棒逾滲的飽和閥值進行Monte-Carlo模擬，研究該復合體系在三維立方體結構上的分布關系。Benilova等[13]采用Monte-Carlo模擬，研究納米粒子尺寸對電極表面貼附率的影響。
根據相關研究者的納米顆粒理化現象建模思想，本文采用Monte-Carlo模型將單層電極表面處理過程等效為將鉑黑納米顆粒吸附到電極表面這一過程。納米顆粒在電極表面的物理貼附是考慮納米粒子在鍍液中易團聚的特征，仿真時采用單個粒子隨機貼附于電極的方式，使其分布方式基本等效于實驗中納米粒子的分散方式，從而使納米粒子分布更均勻[14]。建模時，令電極的半徑為R，根據實驗中納米顆粒與電極的相對尺度，設納米顆粒半徑為r，R＞100·r，定義一個有效面積貼附率θ來判斷納米粒子的貼附程度。在粒子貼附到電極的過程中，考慮到顆粒之間的互斥性，若連續N次與電極上已貼附顆粒相交疊，則表示電極已經過飽和貼附，該次實驗結束，記錄此時的貼附率為θ。連續n次實驗后，將貼附率θ1~θn進行統計分析得到分布曲線，判斷電極上納米顆粒的有效貼附程度。根據模型簡化程度可分別假設：① 電極的均勻性：表面光滑，沒有雜質和缺陷，無表面臺階等[15]；② 粒子形狀的統一性：粒子在二維空間設定為半徑隨機的圓形，符合均勻分布；③ 粒子的脫附性：本文認為粒子一旦貼附在電極表面后不存在脫附問題；④ 粒子的互斥性：考慮表面處理中同種顆粒的相互排斥性，認為粒子與粒子之間不交疊。
對于多層的表面處理過程，本文將其定義為在鉑黑納米顆粒A沉積在電極表面形成鉑黑層后，再在鉑黑層上沉積生物素顆粒B形成生物素層，達到一種“層層貼附”的處理方式。為簡化計算，仍采用二維模型分析，鉑黑層的處理方式與單層結構相同，鉑黑層沉積結束后得到貼附率θ。在鉑黑層上沉積生物素時，由于鉑黑顆粒球形表面增大了生物素顆粒B的貼附面積，所以鉑黑層的實際面積S將會按貼附率比例擴大。其中定義S為圓盤電極面積；Sa為圓盤電極中A顆粒上半球部分的等效面積總和；Sb表示圓盤電極被A鋪滿后，鉑黑層內B顆粒的面積和。通過比較A、B面積貼附率的概率分布關系，研究生物膜貼附的有效性與均一性。
2.1 常規化粒子貼附于電極的Monte-Carlo算法
常規模擬納米粒子沉積貼附的Monte-Carlo方法有兩種：連續空間Monte-Carlo法和離散空間Monte-Carlo法[16]，后者的計算效率較前者高。對需較長時間或加大規模的粒子貼附實驗一般使用離散空間Monte-Carlo法，其主要難點為擴散過程中大量位置的查詢和粒子間落點位置的比較，這導致計算量大、模擬步數多、收斂速度慢，難以達到實際應用要求。為克服這個不足，本文提出了區域分解的概念，利用事先劃分好的網格，對隨機投放的粒子進行分塊搜索，從而獲得較強的局部判斷能力。依據Monte-Carlo法，采用隨機投放初始位置的方法從概率意義上保證整個電極上納米粒子分布的收斂性。該方法的結構具有通用性和較強的參數魯棒性，用于模擬納米粒子在電極上的貼附情況，能夠大量縮短納米粒子貼附實驗的模擬時間，為運用計算機方法模擬粒子貼附提供了有效手段。
2.2 優化后的Monte-Carlo算法實現步驟
(1)參數設計：依據應用問題的先驗知識和運行要求設計算法的參數。以圓形電極為例，該算法的參數有：初始電極半徑R，投放粒子半徑r，飽和投放次數n，最大迭代次數N。
R：電極的半徑，粒子投放的范圍只能在電極區域內。
r：表示粒子的半徑分散度為[a,b]，每個粒子的半徑在[a,b]之間隨機產生，使結果更加逼近于真實的情況。
n：做n次實驗，每次試驗的成功條件是達到最大迭代次數，即電極上納米粒子已飽和。n越大，則模擬過程越接近于實際反應體系。
N：主要用于實驗終止條件的判斷。由于納米粒子的互斥性要求每次投放的粒子不能與已經存在的粒子相交疊，所以判斷粒子是否交疊的計算量會隨著粒子數量的增多而加大，導致一次判斷需耗費較長的時間。為了保證算法運算的速度，可根據實際情況設置來終止判斷的進程，使運算跳轉到下一次投放實驗。
(2)初始化程序：根據所模擬的電極大小設定方形網格大小，將網格信息存放在數組M中，再創建一個元胞數組C來存放投放納米粒子的信息(xi，yi，ri)。
(3)粒子的投放：根據電極尺寸的不同限定粒子投放的邊界條件，接著產生一個滿足邊界條件且半徑在[a,b]間均勻分布的隨機粒子。
(4)互斥性判斷：采用網格搜索法進行互斥性判斷，利用粒子與網格單元之間映射關系，可以由粒子的落點來計算出粒子所在的網格，設定搜索半徑Rs=ri+b，在鄰域中搜索可疑區域，如圖 3所示。使用網格搜索法在判斷投放粒子的互斥性時會對粒子落點網格的鄰域8個網格內的粒子產生影響。為了減少需要提取的數據量，需從這8個區域內篩選出可疑區域，定義可疑區域中的粒子有可能與新投放的粒子相交疊。當所有可疑區域判定完畢后，再將可疑區域內的粒子信息提取出來，與新投放的粒子坐標進行互斥性判定，只要有一個區域內的粒子與其相交疊，則立刻退出判定，重新投放粒子。
圖3
網格法篩選可疑區域
Figure3.
Screening the suspicious area by grid method
(5)終止條件：粒子投放的終止條件是迭代次數達到N。N值可以根據電極半徑大小進行設置，由于隨著N的增大，計算量也會顯著增大，因此實際問題中應該根據時間與精度要求選擇不同的N作為終止條件。
(6)貼附率θ：貼附率θ指已被粒子貼附的電極表面積與總電極表面積之比，即θk=ΣSr/SR (k=1,2,…,n)，θk為第k次飽和實驗所得的貼附率，SR為電極的面積，ΣSr為貼附在電極表面的粒子等效面積和，即ΣSr =S(1)+S(2)+…+S(i)。把n次試驗的貼附率θ進行數據擬合后，得到一條類似正態分布的貼附率曲線，從中可以清楚地看出細胞在理想情況下電極上的最大貼附率，同時該結果也可用于分析不同的電極形狀對細胞貼附率的影響。
(7)單層算法流程圖：如圖 4所示。
圖4
單層算法流程圖
Figure4.
Flow chart of monolayer algorithm
3 模擬結果與討論
3.1 時間性能測試
實際實驗中，本文以圓形電極為例，在相同參數下對比了非網格Monte-Carlo算法與網格算法的用時情況，如圖 5所示，橫軸為電極半徑，縱軸為運行時間，可直觀看出隨粒徑增大，兩種算法的耗時對比。參數設置：電極半徑R=[5,10,15,…,100] μm，以5 μm為一個計算分析尺度；貼附的粒子為半徑在20~200 nm范圍內均勻分布的納米粒子；最大迭代次數為N=1 000；實驗次數為n=1。
圖5
網格法與非網格法的時間測試比較
Figure5.
Comparison of time test results between grid method and non-grid method
由圖 5可以看出，使用網格Monte-Carlo算法的優勢隨著電極半徑的增大更加凸顯。在電極半徑為100 μm的情況下，采用網格Monte-Carlo算法得到1次實驗貼附率的Monte-Carlo時間為170 s，采用非網格法的時間為7 500 s，而要得到一條完整的貼附率曲線需經過n次實驗。當n=10時，采用非網格法得到貼附率曲線需用時20 h，而網格法只需0.5 h即可得出結果。若實驗次數n再增加或電極的分析尺度再增大(如用于阻抗測試的直徑為數百微米的電極)，那所消耗的時間將會更長。同時，采用常規Monte-Carlo算法與網格Monte-Carlo算法除了運算時間上的差異外，兩種算法的粒子統計結果依然是保持一致的。本研究在相同參數條件下對比了兩種算法的粒子統計計算結果，分析得出在電極半徑比較小時，由于貼附于電極上不同尺度的納米粒子數量較少，導致沉積納米粒子的隨機性增大；兩種算法得到的貼附率曲線基本一致，但最大貼附率存在細微差異；隨著電極半徑的增大，兩種算法得到的最大貼附率的差異越來越小，貼附率結果漸趨一致。
3.2 不同形狀的電極表面處理
在形狀尺度的比較上，采用了單層/雙層的納米粒子貼附的結果分析。圖 6為單層納米粒子貼附在不同形狀、相同面積的電極上的直觀分布圖(電極面積等同于半徑為6 μm的圓電極)。
圖6
單層納米粒子貼附在不同形狀電極上的分布結果
Figure6.
Distribution results of monolayer nanoparticles attached on electrodes with different shapes
對于雙層分散度在20~200 nm范圍內的粒子，定義實驗次數n=100，最大迭代次數N=1 000，得到不同電極尺度下的雙層納米粒子的貼附率曲線如圖 7所示。
圖7
不同電極大小、形狀的雙層貼附率曲線
Figure7.
Bilayer coverage rate curves of electrodes with different sizes and shapes
該結果可分為電極形狀的縱向比較及電極尺度的橫向比較。從橫向來分析，對于相同面積、不同形狀的電極，各形狀的電極貼附A粒子的差異性不大，而在A粒子上貼附B粒子時，各組內貼附率有不同程度的升高，說明電鍍鉑黑粒子會增大電極表面積，有利于后期生物素處理。考慮到這是理論模型，在實際操作中，由于環境、人員操作隨機等因素及電鍍操作的誤差性，該結果差異性將更為明顯。從縱向來分析，選取相同形狀的電極，當面積增大時，有效貼附率也明顯增大，且峰值明顯提高，說明貼附均勻化程度提高。
綜上所述，在電極上進行多層A/B納米粒子貼附時，隨著面積增大，B粒子有效貼附率明顯增大，且峰值提高、方差減小，說明貼附均勻化程度和重復率提高，且形狀結果接近，說明與電極形狀基本無關；在小面積(半徑為10 μm圓形等同面積)下各形狀電極貼附A粒子時，雖然峰值差異性(對應為最大貼附率)不明顯，但矩形電極的貼附率曲線分布范圍要大于圓形和方形，且B粒子貼附時出現雙峰現象，說明其分布結果有一定隨機性；在圓形、方形電極的A粒子上貼附B粒子致飽和條件時，其貼附率和分布范圍基本一致。
此外，實驗還研究了在納米粒子的粒徑分布區間為更大的范圍如50~500 nm 時不同形狀電極的貼附率變化，結果圓形電極貼附率的峰值高于方形，說明圓形電極在粒徑區間及貼附層表面處理復雜度更高的情況下，重復性會好于其它形狀的電極(圖略)。而對于相同面積不同形狀的微小電極(半徑10 μm以下)，其電鍍的仿真結果已經具有一定隨機性，會導致相關實驗的表面處理重復性較差，電極陣列的阻抗差異性較大。
4 結論
為了量化分析電鍍鉑黑顆粒的粒徑對生物電阻抗測試的電極表面積、電極體阻抗及靈敏度的影響，本文介紹了快速的Monte-Carlo仿真模型，并描述了具體實現算法。利用該模型研究了不同形狀、尺度的電極表面納米粒子的貼附結果。結果表明，采用區域網格Monte-Carlo算法具有較高的計算效率，能縮短單次實驗的運行時間，并且在結果對比中可以得出當電極半徑小于100 μm時，隨著電極面積增大，有效貼附率增幅較大，峰值明顯提高，說明貼附均勻化程度提高，表面處理的差異性也大大減小，電極處理更易均一化。結合實驗中納米顆粒粒徑與貼附率、表達次數的關系，本研究還對電鍍前后的圓盤電極進行了相關交流阻抗的預實驗，發現電極半徑為20 μm的圓盤陣列電鍍納米顆粒后，交流阻抗值的一致性及測試重復性均高于半徑為10 μm的圓盤電極陣列，符合仿真結果，為后期基于Monte-Carlo模型的電極表面多層納米顆粒表面處理的電學表征模型和基于有限元的電極電荷分布模型提供了實驗基礎，提高了電極多層納米粒子表面處理的有效性和針對性。
引言
細胞阻抗測量傳感器(electric cell-substrate impedance sensing,ECIS)是一種應用較為廣泛的生物傳感器[1]。ECIS平臺技術可以測量由于細胞形態變化、細胞移動或者細胞間相互接觸而引起的細胞層電阻變化。相關微陣列電極電鍍的交流電阻抗實驗說明，電鍍納米顆粒的有效沉積可以降低電極體阻抗、增大表面活化性[2]，從而提高傳感器的靈敏度。然而，目前對于電極表面處理的效果還沒有較直觀的理論仿真測試，只能采用電化學方法、光譜法、波譜法、石英微天平分析法和顯微學等實驗進行間接測試和直接觀察[3]。因此，本文使用計算機模擬來仿真細胞芯片的納米顆粒表面處理。考慮到納米粒子貼附過程是一個均勻分布的隨機過程,故采用Monte-Carlo方法進行建模研究[4]。Monte-Carlo方法不涉及復雜的數值計算,模擬的粒子數目和時間尺度接近真實的物理過程。但Monte-Carlo方法也存在計算量大、運算時間長的缺點。對此，本文提出了一種網格搜索算法，對時間冗長的Monte-Carlo測試程序做了優化與改進，在不影響分布結果的基礎上，將二維網格技術應用于程序中，大大縮短了一次模擬運算的時間。
1 ECIS電極及其表面處理
ECIS系統用于檢測細胞行為的平面電極可分為兩大類：單極電極和叉指電極(interdigitated electrodes,IDEs)[5]。IDEs系統相比于單極電極系統，有培養腔覆蓋面積大、電極尺寸微型、電極形狀多樣等優點，可根據不同的測試條件制作不同的電極形狀，靈活性較大，但在靈敏度和細胞分辨率上不及單極電極結構，后者可檢測到單細胞水平，而IDEs做不到。本文綜合考慮了靈敏度和檢測的有效性，選擇了幾種具代表性的商品化電極系統作為功能模塊電極來評估其表面處理效果及貼附細胞群體的阻抗信息變化。不同形狀的電極如圖 1所示[6]。
圖1
單極電極和叉指電極
Figure1.
Monopolar electrode and interdigitated electrodes
實際檢測時，由于細胞生長的隨機性和電極形狀的多樣性，必須使細胞耦合并定位在電極的有效區域才能檢測到細胞的動作電位，所以對電極的表面處理是銜接細胞一級傳感和芯片二級傳感的關鍵。Neher[7]指出，生物組織在自然情況下，細胞相互之間的間距是10~20 nm。經驗證，將細胞培養在人工材料制作的基底上，一般情況下細胞與基底的距離不小于40 nm。細胞與基底之間黏附的情況會直接影響微電極陣列對細胞電信號的捕捉能力，尤其是對那些不易貼壁生長的神經細胞來說，有時噪聲甚至會把生物信號淹沒掉。相關理論研究表明，雖然阻抗測試結果可說明細胞的生長及增殖情況，但電極的微型化使得表面體阻抗對測試結果的靈敏度影響較大，尤其是圓形ECIS單元部分。這主要是由于工作電極表面積較小，本體阻抗較大，造成靈敏度較低。可行辦法是在電極表面電鍍鉑黑顆粒后再進行相關的細胞組裝實驗，如圖 2所示。本課題組以往的電鍍實驗結果表明，電鍍后電極體阻抗在測試工作頻段內可減小一個數量級左右，大大提高了測試靈敏度[8]，所以表面處理的重要性不可忽視，尤其是不同形狀的電極表面處理更具研究意義。
圖2
二維芯片中叉指電極及圓形電極單元電鍍鉑顆粒圖
Figure2.
Photos of platinum black deposition on IDEs and circular monopolar electrode
通常微陣列電極表面處理為以下幾個步驟：首先是對微陣列電極進行鉑黑納米粒子電鍍，為了防止鉑黑顆粒貼附性的退化，在電生理測試前需進行電化學測試；然后是進行生物素的涂布，主要有旋涂、醺涂和滴涂法，涂布生物素是通過特殊的官能團來提高細胞的黏附性[9-10]；最后再經過無菌的PBS溶液多次清洗、生物素再沉積過程，當各電極達到均勻穩定的貼附程度后接種靶向細胞。但目前對于表面處理的效果還沒有較直觀的理論仿真測試，無法判斷電極上電鍍鉑黑納米顆粒并涂布生物素后電極表面均勻有機膜的上膜顆粒孔徑與有效程度，也無法分析不同尺度、不同形狀的電極貼附率之間的差異性，這些量化數據的缺失導致電生理實驗缺乏可重復性，成為快速分析的瓶頸。所以對電極-細胞耦合程度的量化分析是十分重要的，有助于后期實驗重現性、細胞與電極耦合有效性及細胞電生理信號特異識別性的提升。本文采用了Monte-Carlo統計模型，量化分析了不同條件下電極貼附率的差異性及納米粒子表面處理的有效性。
2 納米粒子貼附的Monte-Carlo模型
Monte-Carlo法在數學上稱為隨機模擬法、隨機抽樣技術或統計試驗法，基本思想是：為求解數學、物理及化學等問題，建立一個概率模型或隨機過程，使其參數等于問題的解；當所解的問題本身屬隨機性時，則可以采用直接模擬法，即根據實際物理情況的概率法則，來構造Monte-Carlo模型，然后通過對模型或過程的觀察或抽樣實驗來計算所求參數的統計特征，最后確定求解的近似值。生物科學中的Monte-Carlo模擬主要采用直接模擬法[11]。國內外已有許多相關的研究報道。沈良[12]對高分子納米材料凹凸棒逾滲的飽和閥值進行Monte-Carlo模擬，研究該復合體系在三維立方體結構上的分布關系。Benilova等[13]采用Monte-Carlo模擬，研究納米粒子尺寸對電極表面貼附率的影響。
根據相關研究者的納米顆粒理化現象建模思想，本文采用Monte-Carlo模型將單層電極表面處理過程等效為將鉑黑納米顆粒吸附到電極表面這一過程。納米顆粒在電極表面的物理貼附是考慮納米粒子在鍍液中易團聚的特征，仿真時采用單個粒子隨機貼附于電極的方式，使其分布方式基本等效于實驗中納米粒子的分散方式，從而使納米粒子分布更均勻[14]。建模時，令電極的半徑為R，根據實驗中納米顆粒與電極的相對尺度，設納米顆粒半徑為r，R＞100·r，定義一個有效面積貼附率θ來判斷納米粒子的貼附程度。在粒子貼附到電極的過程中，考慮到顆粒之間的互斥性，若連續N次與電極上已貼附顆粒相交疊，則表示電極已經過飽和貼附，該次實驗結束，記錄此時的貼附率為θ。連續n次實驗后，將貼附率θ1~θn進行統計分析得到分布曲線，判斷電極上納米顆粒的有效貼附程度。根據模型簡化程度可分別假設：① 電極的均勻性：表面光滑，沒有雜質和缺陷，無表面臺階等[15]；② 粒子形狀的統一性：粒子在二維空間設定為半徑隨機的圓形，符合均勻分布；③ 粒子的脫附性：本文認為粒子一旦貼附在電極表面后不存在脫附問題；④ 粒子的互斥性：考慮表面處理中同種顆粒的相互排斥性，認為粒子與粒子之間不交疊。
對于多層的表面處理過程，本文將其定義為在鉑黑納米顆粒A沉積在電極表面形成鉑黑層后，再在鉑黑層上沉積生物素顆粒B形成生物素層，達到一種“層層貼附”的處理方式。為簡化計算，仍采用二維模型分析，鉑黑層的處理方式與單層結構相同，鉑黑層沉積結束后得到貼附率θ。在鉑黑層上沉積生物素時，由于鉑黑顆粒球形表面增大了生物素顆粒B的貼附面積，所以鉑黑層的實際面積S將會按貼附率比例擴大。其中定義S為圓盤電極面積；Sa為圓盤電極中A顆粒上半球部分的等效面積總和；Sb表示圓盤電極被A鋪滿后，鉑黑層內B顆粒的面積和。通過比較A、B面積貼附率的概率分布關系，研究生物膜貼附的有效性與均一性。
2.1 常規化粒子貼附于電極的Monte-Carlo算法
常規模擬納米粒子沉積貼附的Monte-Carlo方法有兩種：連續空間Monte-Carlo法和離散空間Monte-Carlo法[16]，后者的計算效率較前者高。對需較長時間或加大規模的粒子貼附實驗一般使用離散空間Monte-Carlo法，其主要難點為擴散過程中大量位置的查詢和粒子間落點位置的比較，這導致計算量大、模擬步數多、收斂速度慢，難以達到實際應用要求。為克服這個不足，本文提出了區域分解的概念，利用事先劃分好的網格，對隨機投放的粒子進行分塊搜索，從而獲得較強的局部判斷能力。依據Monte-Carlo法，采用隨機投放初始位置的方法從概率意義上保證整個電極上納米粒子分布的收斂性。該方法的結構具有通用性和較強的參數魯棒性，用于模擬納米粒子在電極上的貼附情況，能夠大量縮短納米粒子貼附實驗的模擬時間，為運用計算機方法模擬粒子貼附提供了有效手段。
2.2 優化后的Monte-Carlo算法實現步驟
(1)參數設計：依據應用問題的先驗知識和運行要求設計算法的參數。以圓形電極為例，該算法的參數有：初始電極半徑R，投放粒子半徑r，飽和投放次數n，最大迭代次數N。
R：電極的半徑，粒子投放的范圍只能在電極區域內。
r：表示粒子的半徑分散度為[a,b]，每個粒子的半徑在[a,b]之間隨機產生，使結果更加逼近于真實的情況。
n：做n次實驗，每次試驗的成功條件是達到最大迭代次數，即電極上納米粒子已飽和。n越大，則模擬過程越接近于實際反應體系。
N：主要用于實驗終止條件的判斷。由于納米粒子的互斥性要求每次投放的粒子不能與已經存在的粒子相交疊，所以判斷粒子是否交疊的計算量會隨著粒子數量的增多而加大，導致一次判斷需耗費較長的時間。為了保證算法運算的速度，可根據實際情況設置來終止判斷的進程，使運算跳轉到下一次投放實驗。
(2)初始化程序：根據所模擬的電極大小設定方形網格大小，將網格信息存放在數組M中，再創建一個元胞數組C來存放投放納米粒子的信息(xi，yi，ri)。
(3)粒子的投放：根據電極尺寸的不同限定粒子投放的邊界條件，接著產生一個滿足邊界條件且半徑在[a,b]間均勻分布的隨機粒子。
(4)互斥性判斷：采用網格搜索法進行互斥性判斷，利用粒子與網格單元之間映射關系，可以由粒子的落點來計算出粒子所在的網格，設定搜索半徑Rs=ri+b，在鄰域中搜索可疑區域，如圖 3所示。使用網格搜索法在判斷投放粒子的互斥性時會對粒子落點網格的鄰域8個網格內的粒子產生影響。為了減少需要提取的數據量，需從這8個區域內篩選出可疑區域，定義可疑區域中的粒子有可能與新投放的粒子相交疊。當所有可疑區域判定完畢后，再將可疑區域內的粒子信息提取出來，與新投放的粒子坐標進行互斥性判定，只要有一個區域內的粒子與其相交疊，則立刻退出判定，重新投放粒子。
圖3
網格法篩選可疑區域
Figure3.
Screening the suspicious area by grid method
(5)終止條件：粒子投放的終止條件是迭代次數達到N。N值可以根據電極半徑大小進行設置，由于隨著N的增大，計算量也會顯著增大，因此實際問題中應該根據時間與精度要求選擇不同的N作為終止條件。
(6)貼附率θ：貼附率θ指已被粒子貼附的電極表面積與總電極表面積之比，即θk=ΣSr/SR (k=1,2,…,n)，θk為第k次飽和實驗所得的貼附率，SR為電極的面積，ΣSr為貼附在電極表面的粒子等效面積和，即ΣSr =S(1)+S(2)+…+S(i)。把n次試驗的貼附率θ進行數據擬合后，得到一條類似正態分布的貼附率曲線，從中可以清楚地看出細胞在理想情況下電極上的最大貼附率，同時該結果也可用于分析不同的電極形狀對細胞貼附率的影響。
(7)單層算法流程圖：如圖 4所示。
圖4
單層算法流程圖
Figure4.
Flow chart of monolayer algorithm
3 模擬結果與討論
3.1 時間性能測試
實際實驗中，本文以圓形電極為例，在相同參數下對比了非網格Monte-Carlo算法與網格算法的用時情況，如圖 5所示，橫軸為電極半徑，縱軸為運行時間，可直觀看出隨粒徑增大，兩種算法的耗時對比。參數設置：電極半徑R=[5,10,15,…,100] μm，以5 μm為一個計算分析尺度；貼附的粒子為半徑在20~200 nm范圍內均勻分布的納米粒子；最大迭代次數為N=1 000；實驗次數為n=1。
圖5
網格法與非網格法的時間測試比較
Figure5.
Comparison of time test results between grid method and non-grid method
由圖 5可以看出，使用網格Monte-Carlo算法的優勢隨著電極半徑的增大更加凸顯。在電極半徑為100 μm的情況下，采用網格Monte-Carlo算法得到1次實驗貼附率的Monte-Carlo時間為170 s，采用非網格法的時間為7 500 s，而要得到一條完整的貼附率曲線需經過n次實驗。當n=10時，采用非網格法得到貼附率曲線需用時20 h，而網格法只需0.5 h即可得出結果。若實驗次數n再增加或電極的分析尺度再增大(如用于阻抗測試的直徑為數百微米的電極)，那所消耗的時間將會更長。同時，采用常規Monte-Carlo算法與網格Monte-Carlo算法除了運算時間上的差異外，兩種算法的粒子統計結果依然是保持一致的。本研究在相同參數條件下對比了兩種算法的粒子統計計算結果，分析得出在電極半徑比較小時，由于貼附于電極上不同尺度的納米粒子數量較少，導致沉積納米粒子的隨機性增大；兩種算法得到的貼附率曲線基本一致，但最大貼附率存在細微差異；隨著電極半徑的增大，兩種算法得到的最大貼附率的差異越來越小，貼附率結果漸趨一致。
3.2 不同形狀的電極表面處理
在形狀尺度的比較上，采用了單層/雙層的納米粒子貼附的結果分析。圖 6為單層納米粒子貼附在不同形狀、相同面積的電極上的直觀分布圖(電極面積等同于半徑為6 μm的圓電極)。
圖6
單層納米粒子貼附在不同形狀電極上的分布結果
Figure6.
Distribution results of monolayer nanoparticles attached on electrodes with different shapes
對于雙層分散度在20~200 nm范圍內的粒子，定義實驗次數n=100，最大迭代次數N=1 000，得到不同電極尺度下的雙層納米粒子的貼附率曲線如圖 7所示。
圖7
不同電極大小、形狀的雙層貼附率曲線
Figure7.
Bilayer coverage rate curves of electrodes with different sizes and shapes
該結果可分為電極形狀的縱向比較及電極尺度的橫向比較。從橫向來分析，對于相同面積、不同形狀的電極，各形狀的電極貼附A粒子的差異性不大，而在A粒子上貼附B粒子時，各組內貼附率有不同程度的升高，說明電鍍鉑黑粒子會增大電極表面積，有利于后期生物素處理。考慮到這是理論模型，在實際操作中，由于環境、人員操作隨機等因素及電鍍操作的誤差性，該結果差異性將更為明顯。從縱向來分析，選取相同形狀的電極，當面積增大時，有效貼附率也明顯增大，且峰值明顯提高，說明貼附均勻化程度提高。
綜上所述，在電極上進行多層A/B納米粒子貼附時，隨著面積增大，B粒子有效貼附率明顯增大，且峰值提高、方差減小，說明貼附均勻化程度和重復率提高，且形狀結果接近，說明與電極形狀基本無關；在小面積(半徑為10 μm圓形等同面積)下各形狀電極貼附A粒子時，雖然峰值差異性(對應為最大貼附率)不明顯，但矩形電極的貼附率曲線分布范圍要大于圓形和方形，且B粒子貼附時出現雙峰現象，說明其分布結果有一定隨機性；在圓形、方形電極的A粒子上貼附B粒子致飽和條件時，其貼附率和分布范圍基本一致。
此外，實驗還研究了在納米粒子的粒徑分布區間為更大的范圍如50~500 nm 時不同形狀電極的貼附率變化，結果圓形電極貼附率的峰值高于方形，說明圓形電極在粒徑區間及貼附層表面處理復雜度更高的情況下，重復性會好于其它形狀的電極(圖略)。而對于相同面積不同形狀的微小電極(半徑10 μm以下)，其電鍍的仿真結果已經具有一定隨機性，會導致相關實驗的表面處理重復性較差，電極陣列的阻抗差異性較大。
4 結論
為了量化分析電鍍鉑黑顆粒的粒徑對生物電阻抗測試的電極表面積、電極體阻抗及靈敏度的影響，本文介紹了快速的Monte-Carlo仿真模型，并描述了具體實現算法。利用該模型研究了不同形狀、尺度的電極表面納米粒子的貼附結果。結果表明，采用區域網格Monte-Carlo算法具有較高的計算效率，能縮短單次實驗的運行時間，并且在結果對比中可以得出當電極半徑小于100 μm時，隨著電極面積增大，有效貼附率增幅較大，峰值明顯提高，說明貼附均勻化程度提高，表面處理的差異性也大大減小，電極處理更易均一化。結合實驗中納米顆粒粒徑與貼附率、表達次數的關系，本研究還對電鍍前后的圓盤電極進行了相關交流阻抗的預實驗，發現電極半徑為20 μm的圓盤陣列電鍍納米顆粒后，交流阻抗值的一致性及測試重復性均高于半徑為10 μm的圓盤電極陣列，符合仿真結果，為后期基于Monte-Carlo模型的電極表面多層納米顆粒表面處理的電學表征模型和基于有限元的電極電荷分布模型提供了實驗基礎，提高了電極多層納米粒子表面處理的有效性和針對性。
