早期生物起搏的研究大都圍繞HCN通道展開,通過增強If 電流來構建生物起搏器,近年來人們發現Tbx3基因在心臟傳導系統尤其是竇房結的分化成熟及功能維持中發揮著重要作用,能夠進一步優化生物起搏器,有可能成為生物起搏及心臟傳導系統疾病新的治療靶點。本文總結近年來Tbx3在生物起搏中的一些最新研究進展,希望為今后Tbx3的臨床應用提供理論依據。
引用本文： 李勇, 李賓公. Tbx3在生物起搏中的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(4): 923-926. doi: 10.7507/1001-5515.20140173 復制
引言
目前對于病竇綜合征等心動過緩疾病，主要采用植入電子起搏器來治療，雖然電子起搏器在技術上已相當成熟，但仍存在電池壽命有限、電極脫位、缺乏對神經激素自動反應性，不能達到真正意義上的生理起搏等固有缺陷。因此人們把目光放在更接近心臟生理功能的生物起搏器研究上。心臟生物起搏是指利用分子生物學及組織工程學相關技術對心臟受損的自律性節律點或特殊傳導系統的細胞進行修復或替代，使心臟的起搏或傳導功能得以恢復，目前主要采用基因治療和細胞治療來構建生物起搏器。早期的研究大都通過HCN通道增強If 電流來構建生物起搏器，近年來越來越多的證據發現，在竇房結細胞的分化成熟中Tbx3發揮著重要作用[1]，而且這一功能還可用于生物起搏的治療，能夠進一步優化生物起搏器，而這已成為目前生物起搏的研究熱點之一。現就Tbx3在目前生物起搏中的研究進展做一綜述。
1 Tbx3基因及其生物學特性
Tbx基因家族[T-box]是近幾年研究較多的一類在脊椎動物胚胎發育中起著重要調節作用的轉錄因子，其家族成員包括Tbx1、Tbx2、Tbx3、Tbx5、Tbx18、Tbx20等，其中多個基因廣泛參與心臟的生長發育過程，在脊椎動物早期心臟發育中發揮著非常重要的時間、空間調節作用。Tbx3基因位于染色體12q24.1上，同源基因位于5號染色體，全長為9.0 kb,至少包括6個外顯子，在進化上具有高度保守性，在胚胎形成時期多個組織及器官均有表達。目前的研究發現，剔去Tbx3基因的小鼠在胚胎發育的11～14 d均因心臟發育障礙而流產死亡，而Tbx3基因突變的小鼠則出現了尺骨乳腺綜合癥并伴有先天性心臟發育異常[2]。這說明Tbx3基因在脊椎動物心血管系統、四肢、乳腺等器官的發育中均發揮著重要作用。
1.1 Tbx3基因在心臟傳導系統發育中的作用
哺乳動物心臟傳導系統是由竇房結、房室結、希氏束、左右心室束、浦肯野纖維細胞等組成。目前對心臟傳導系統的發育，尤其是竇房結的發育不是完全清楚。有研究表明心臟傳導系統的細胞可能直接來自于中胚層的前體細胞，遷移到心臟形成心臟的傳導系統[3]。其中轉錄因子Tbx3與心臟其它早期轉錄因子如Nkx2.5、GATA4、Shox2等相互作用形成心臟發育特殊的核心轉錄調控網絡(cardiac-specific gene regulatory network)[4]，作用于早期心臟發育的各個階段，調控心臟細胞，保證了正常竇房結組織的分化、成熟。
Hoogaars等[5]發現在雞與鼠的胚胎發育的第9.5～10 d，在竇房結形成前，Tbx3在原始心管和房室通道中表達，同時伴有起搏基因HCN4的明顯升高，推測Tbx3可能與心臟傳導系統發育密切相關。Sizarov等[6]發現在人早期心臟的發育過程中，在靜脈竇、房室管、流出道的部分區域，Tbx3可抑制心臟前體細胞向房室工作肌分化，增強起搏相關基因的表達,并且通過分析心臟在發育中的分子組成，進一步證實了Tbx3在人心臟發育中能夠促進竇房結細胞的分化成熟[7]。
Singh等[8]通過基因芯片技術分析敲除或上調Tbx3基因的大鼠胚胎模型發現，在早期心臟發育中，Tbx3是一種較強的轉錄抑制劑，在局部可以直接抑制心房心室相關標記基因的表達，并通過激活起搏相關基因，與Tbx2協同調節細胞向起搏類細胞分化，在起搏類細胞的發育成熟中發揮重要作用。Wiese等[9]通過觀察Tbx3或Tbx18基因突變的小鼠心臟傳導系統的發育發現，Tbx18基因突變形成的竇房結在形態學上明顯發育不良，而在功能上基本正常；而Tbx3基因突變形成的竇房結在形態學上基本正常、但無正常竇房結功能。據此推測Tbx3和Tbx18基因在竇房結的發育中相繼發揮作用，Tbx18動員心臟前體細胞在形態學上分化為竇房結，隨后Tbx3在啟動起搏細胞的分化程序中發揮著關鍵作用，調控著起搏細胞的最終分化成熟[10]。
1.2 Tbx3在成熟心臟竇房結中的表達
哺乳動物成熟竇房結是一種被稱為逗點樣的細長結構，頭部較大，位于右上腔靜脈與右心房的連接處，尾部較小，終止于右心耳與右心房側壁交界處。目前的研究表明，成熟竇房結不同部位的組織結構及功能各不相同。Wiese等通過重建小鼠竇房結三維形態模型發現，竇房結頭部主要表達Tbx18、Tbx3、HCN4基因,不表達Nkx2.5基因，尾部則表達較高的Tbx3和HCN4，Nkx2.5低表達，不表達Tbx18，同時尾部含有大量起搏細胞。Greener等[11]通過實時定量PCR(quantitative real-time PCR,QRT-PCR)、免疫組化分析人心臟傳導系統的分子組成發現，Tbx3在竇房結等心臟傳導系統中有較高表達，而在心房、心室等工作肌中表達較低。目前大量研究表明Tbx3基因在竇房結內特異性地持續穩定表達,并對竇房結細胞的功能維持發揮著關鍵作用，常和HCN4作為起搏組織的標志基因[12]。此外還有研究提示，Tbx3的表達異常與某些心臟傳導系統疾病的產生密切相關[13]，今后可能作為某些心臟傳導系統疾病的遺傳標記[14]，為未來這些疾病的診斷及治療提供了新的方向。
2 Tbx3在生物起搏中的應用
Hoogaars等將Tbx3基因注射入大鼠右心房發現異位表達的Tbx3能抑制心房相關基因如Cx40、Nppa等表達，明顯提高起搏基因HCN4的表達，并且足夠形成心臟異位起搏點，導致出現心律失常。此外通過Tbx3突變的大鼠胚胎模型發現，Tbx3的正常表達也是維持竇房結功能穩定所必須的。
Bakker等[15]在體內及體外構建超表達Tbx3的心室肌細胞模型，通過基因芯片技術、QRT-PCR、膜片鉗檢查等發現，Tbx3不但在心臟起搏組織的發育中發揮重要作用，而且還能夠重新設定成熟心肌細胞的基因程序，使其分化為起搏樣細胞，今后可用于修復或新建心臟起搏點。Zhu等[16]發現在胚胎干細胞體外心肌樣分化過程干預NRG-1/ErbB通路可以提高Tbx3的表達,而Tbx3通過提高竇房結相關基因表達促進干細胞向竇房結樣細胞分化,并能檢測到竇房結樣動作電位，可用于今后生物起搏的研究。
3 Tbx3優化生物起搏器
縫隙連接蛋白(connexin,Cx)組成的縫隙連接通道，是心肌細胞間信號傳導的主要渠道，心肌組織中由于各自Cx的不同，決定了各自不同的傳導速度。竇房結的中心部分主要表達傳導性低的Cx45，保證了竇房結中心部分的起搏細胞由于低傳導性而不被鄰近心房肌超極化所抑制，向外則傳導性逐漸增強，與之相鄰的心房肌則以Cx43及Cx40為主，而Cx43及Cx40也大量存在于心室及心房肌間，縫隙連接蛋白在心臟中的分布特征，對竇房結的正常起搏及電信號的正常傳導具有重要的保護作用。如果在今后的生物起搏器周圍能夠模擬竇房結周圍的縫隙連接蛋白分布特征，則有望進一步提高生物起搏器的起搏效率。細胞學研究表明，Cx通道是動態的、可被精細調節的[17]，而Tbx3也參與了這一調節并發揮著重要作用。Boogerd等[18]通過對斑馬魚心臟轉染Tbx3基因發現，它能夠抑制在移植部位傳導性較強的Cx43、Cx40等縫隙連接蛋白的表達。Bakker等發現Tbx3可通過改變心肌細胞間Cx的表達,上調低傳導性的Cx45在移植部位的表達，使Cx45更加符合竇房結內的生理分布，有望改善移植細胞起搏心室的效果，進一步優化生物起搏器。
4 Tbx3的上下游信號通路
心臟的發育受一個核心轉錄網絡的調控，該調控網絡將上游誘導信號與下游調控基因聯系起來，控制心臟前體細胞的定向分化,而Tbx3雖然不是傳導系統唯一的調節因子，但是其中一個與竇房結起搏功能密切相關的關鍵調節點。Nkx2.5是脊椎動物心臟發育的早期標志物之一,其作用貫穿于心臟發育的各個階段,是包括傳導系統在內的心肌細胞定向分化的重要前提。Espinoza等[19]通過觀察超表達Shox2的非洲蟾蜍心臟發育，發現當Shox2基因增強時可激活Tbx3基因、抑制Nkx2.5的表達,并伴有起搏基因HCN4表達明顯增強，心房標記基因Nppa、Cx40的表達明顯下降，反之Shox2基因突變的小鼠胚胎則出現竇房結發育障礙，在胚胎發育的第11.5～13.5 d流產死亡。此外，還有研究發現當小鼠胚胎Nkx2.5持續高表達時，則可抑制心臟前體細胞向竇房結細胞分化,而心房心室工作肌相關基因表達明顯增強[20]。有趣的是Puskaric等[21]還發現當Nkx2.5高表達時還可以激活Shox2的表達。此外還有研究發現內皮素-1(Endothelin-1)也能上調Tbx3基因的表達，促進由胚胎干細胞分化而來的心臟前體細胞向竇房結細胞分化[22]。
5 存在的問題
目前Tbx3在脊椎動物早期竇房結發育中的作用已被越來越多的研究者所認可，并將其用于生物起搏及心臟傳導系統疾病的研究。但也有研究發現適當強度的Tbx3能夠抑制抑癌基因p14ARF等細胞周期調節因子的表達[23]，促進細胞的自我更新[24]，可能與腫瘤的發生密切相關[25]。此外，Tbx3通過調節心臟的起搏及傳導，相關基因還可導致新的心臟傳導系統疾病及心律失常[26]，因此Tbx3的生物安全性還有待進一步研究。
6 展望
目前隨著生物起搏研究的不斷深入，生物起搏器在治療緩慢性心律失常上的可行性越來越大，但諸多研究尚處于動物實驗的初級階段,在持久性、穩定性方面與正常竇房結仍有明顯差距，在起搏功能上還達不到高效、穩定。而Tbx3能夠促進干細胞及心臟前體細胞向竇房結樣細胞分化，增強并維持起搏相關基因的表達，優化起搏組織周圍縫隙連接蛋白的表達，對起搏功能的穩定與維持發揮著重要作用，有利于今后性能持久穩定的新型生物起搏器的獲得,也可能為今后某些心臟傳導系統疾病的治療提供新的靶點，是未來生物起搏研究另一重要調節點。
引言
目前對于病竇綜合征等心動過緩疾病，主要采用植入電子起搏器來治療，雖然電子起搏器在技術上已相當成熟，但仍存在電池壽命有限、電極脫位、缺乏對神經激素自動反應性，不能達到真正意義上的生理起搏等固有缺陷。因此人們把目光放在更接近心臟生理功能的生物起搏器研究上。心臟生物起搏是指利用分子生物學及組織工程學相關技術對心臟受損的自律性節律點或特殊傳導系統的細胞進行修復或替代，使心臟的起搏或傳導功能得以恢復，目前主要采用基因治療和細胞治療來構建生物起搏器。早期的研究大都通過HCN通道增強If 電流來構建生物起搏器，近年來越來越多的證據發現，在竇房結細胞的分化成熟中Tbx3發揮著重要作用[1]，而且這一功能還可用于生物起搏的治療，能夠進一步優化生物起搏器，而這已成為目前生物起搏的研究熱點之一。現就Tbx3在目前生物起搏中的研究進展做一綜述。
1 Tbx3基因及其生物學特性
Tbx基因家族[T-box]是近幾年研究較多的一類在脊椎動物胚胎發育中起著重要調節作用的轉錄因子，其家族成員包括Tbx1、Tbx2、Tbx3、Tbx5、Tbx18、Tbx20等，其中多個基因廣泛參與心臟的生長發育過程，在脊椎動物早期心臟發育中發揮著非常重要的時間、空間調節作用。Tbx3基因位于染色體12q24.1上，同源基因位于5號染色體，全長為9.0 kb,至少包括6個外顯子，在進化上具有高度保守性，在胚胎形成時期多個組織及器官均有表達。目前的研究發現，剔去Tbx3基因的小鼠在胚胎發育的11～14 d均因心臟發育障礙而流產死亡，而Tbx3基因突變的小鼠則出現了尺骨乳腺綜合癥并伴有先天性心臟發育異常[2]。這說明Tbx3基因在脊椎動物心血管系統、四肢、乳腺等器官的發育中均發揮著重要作用。
1.1 Tbx3基因在心臟傳導系統發育中的作用
哺乳動物心臟傳導系統是由竇房結、房室結、希氏束、左右心室束、浦肯野纖維細胞等組成。目前對心臟傳導系統的發育，尤其是竇房結的發育不是完全清楚。有研究表明心臟傳導系統的細胞可能直接來自于中胚層的前體細胞，遷移到心臟形成心臟的傳導系統[3]。其中轉錄因子Tbx3與心臟其它早期轉錄因子如Nkx2.5、GATA4、Shox2等相互作用形成心臟發育特殊的核心轉錄調控網絡(cardiac-specific gene regulatory network)[4]，作用于早期心臟發育的各個階段，調控心臟細胞，保證了正常竇房結組織的分化、成熟。
Hoogaars等[5]發現在雞與鼠的胚胎發育的第9.5～10 d，在竇房結形成前，Tbx3在原始心管和房室通道中表達，同時伴有起搏基因HCN4的明顯升高，推測Tbx3可能與心臟傳導系統發育密切相關。Sizarov等[6]發現在人早期心臟的發育過程中，在靜脈竇、房室管、流出道的部分區域，Tbx3可抑制心臟前體細胞向房室工作肌分化，增強起搏相關基因的表達,并且通過分析心臟在發育中的分子組成，進一步證實了Tbx3在人心臟發育中能夠促進竇房結細胞的分化成熟[7]。
Singh等[8]通過基因芯片技術分析敲除或上調Tbx3基因的大鼠胚胎模型發現，在早期心臟發育中，Tbx3是一種較強的轉錄抑制劑，在局部可以直接抑制心房心室相關標記基因的表達，并通過激活起搏相關基因，與Tbx2協同調節細胞向起搏類細胞分化，在起搏類細胞的發育成熟中發揮重要作用。Wiese等[9]通過觀察Tbx3或Tbx18基因突變的小鼠心臟傳導系統的發育發現，Tbx18基因突變形成的竇房結在形態學上明顯發育不良，而在功能上基本正常；而Tbx3基因突變形成的竇房結在形態學上基本正常、但無正常竇房結功能。據此推測Tbx3和Tbx18基因在竇房結的發育中相繼發揮作用，Tbx18動員心臟前體細胞在形態學上分化為竇房結，隨后Tbx3在啟動起搏細胞的分化程序中發揮著關鍵作用，調控著起搏細胞的最終分化成熟[10]。
1.2 Tbx3在成熟心臟竇房結中的表達
哺乳動物成熟竇房結是一種被稱為逗點樣的細長結構，頭部較大，位于右上腔靜脈與右心房的連接處，尾部較小，終止于右心耳與右心房側壁交界處。目前的研究表明，成熟竇房結不同部位的組織結構及功能各不相同。Wiese等通過重建小鼠竇房結三維形態模型發現，竇房結頭部主要表達Tbx18、Tbx3、HCN4基因,不表達Nkx2.5基因，尾部則表達較高的Tbx3和HCN4，Nkx2.5低表達，不表達Tbx18，同時尾部含有大量起搏細胞。Greener等[11]通過實時定量PCR(quantitative real-time PCR,QRT-PCR)、免疫組化分析人心臟傳導系統的分子組成發現，Tbx3在竇房結等心臟傳導系統中有較高表達，而在心房、心室等工作肌中表達較低。目前大量研究表明Tbx3基因在竇房結內特異性地持續穩定表達,并對竇房結細胞的功能維持發揮著關鍵作用，常和HCN4作為起搏組織的標志基因[12]。此外還有研究提示，Tbx3的表達異常與某些心臟傳導系統疾病的產生密切相關[13]，今后可能作為某些心臟傳導系統疾病的遺傳標記[14]，為未來這些疾病的診斷及治療提供了新的方向。
2 Tbx3在生物起搏中的應用
Hoogaars等將Tbx3基因注射入大鼠右心房發現異位表達的Tbx3能抑制心房相關基因如Cx40、Nppa等表達，明顯提高起搏基因HCN4的表達，并且足夠形成心臟異位起搏點，導致出現心律失常。此外通過Tbx3突變的大鼠胚胎模型發現，Tbx3的正常表達也是維持竇房結功能穩定所必須的。
Bakker等[15]在體內及體外構建超表達Tbx3的心室肌細胞模型，通過基因芯片技術、QRT-PCR、膜片鉗檢查等發現，Tbx3不但在心臟起搏組織的發育中發揮重要作用，而且還能夠重新設定成熟心肌細胞的基因程序，使其分化為起搏樣細胞，今后可用于修復或新建心臟起搏點。Zhu等[16]發現在胚胎干細胞體外心肌樣分化過程干預NRG-1/ErbB通路可以提高Tbx3的表達,而Tbx3通過提高竇房結相關基因表達促進干細胞向竇房結樣細胞分化,并能檢測到竇房結樣動作電位，可用于今后生物起搏的研究。
3 Tbx3優化生物起搏器
縫隙連接蛋白(connexin,Cx)組成的縫隙連接通道，是心肌細胞間信號傳導的主要渠道，心肌組織中由于各自Cx的不同，決定了各自不同的傳導速度。竇房結的中心部分主要表達傳導性低的Cx45，保證了竇房結中心部分的起搏細胞由于低傳導性而不被鄰近心房肌超極化所抑制，向外則傳導性逐漸增強，與之相鄰的心房肌則以Cx43及Cx40為主，而Cx43及Cx40也大量存在于心室及心房肌間，縫隙連接蛋白在心臟中的分布特征，對竇房結的正常起搏及電信號的正常傳導具有重要的保護作用。如果在今后的生物起搏器周圍能夠模擬竇房結周圍的縫隙連接蛋白分布特征，則有望進一步提高生物起搏器的起搏效率。細胞學研究表明，Cx通道是動態的、可被精細調節的[17]，而Tbx3也參與了這一調節并發揮著重要作用。Boogerd等[18]通過對斑馬魚心臟轉染Tbx3基因發現，它能夠抑制在移植部位傳導性較強的Cx43、Cx40等縫隙連接蛋白的表達。Bakker等發現Tbx3可通過改變心肌細胞間Cx的表達,上調低傳導性的Cx45在移植部位的表達，使Cx45更加符合竇房結內的生理分布，有望改善移植細胞起搏心室的效果，進一步優化生物起搏器。
4 Tbx3的上下游信號通路
心臟的發育受一個核心轉錄網絡的調控，該調控網絡將上游誘導信號與下游調控基因聯系起來，控制心臟前體細胞的定向分化,而Tbx3雖然不是傳導系統唯一的調節因子，但是其中一個與竇房結起搏功能密切相關的關鍵調節點。Nkx2.5是脊椎動物心臟發育的早期標志物之一,其作用貫穿于心臟發育的各個階段,是包括傳導系統在內的心肌細胞定向分化的重要前提。Espinoza等[19]通過觀察超表達Shox2的非洲蟾蜍心臟發育，發現當Shox2基因增強時可激活Tbx3基因、抑制Nkx2.5的表達,并伴有起搏基因HCN4表達明顯增強，心房標記基因Nppa、Cx40的表達明顯下降，反之Shox2基因突變的小鼠胚胎則出現竇房結發育障礙，在胚胎發育的第11.5～13.5 d流產死亡。此外，還有研究發現當小鼠胚胎Nkx2.5持續高表達時，則可抑制心臟前體細胞向竇房結細胞分化,而心房心室工作肌相關基因表達明顯增強[20]。有趣的是Puskaric等[21]還發現當Nkx2.5高表達時還可以激活Shox2的表達。此外還有研究發現內皮素-1(Endothelin-1)也能上調Tbx3基因的表達，促進由胚胎干細胞分化而來的心臟前體細胞向竇房結細胞分化[22]。
5 存在的問題
目前Tbx3在脊椎動物早期竇房結發育中的作用已被越來越多的研究者所認可，并將其用于生物起搏及心臟傳導系統疾病的研究。但也有研究發現適當強度的Tbx3能夠抑制抑癌基因p14ARF等細胞周期調節因子的表達[23]，促進細胞的自我更新[24]，可能與腫瘤的發生密切相關[25]。此外，Tbx3通過調節心臟的起搏及傳導，相關基因還可導致新的心臟傳導系統疾病及心律失常[26]，因此Tbx3的生物安全性還有待進一步研究。
6 展望
目前隨著生物起搏研究的不斷深入，生物起搏器在治療緩慢性心律失常上的可行性越來越大，但諸多研究尚處于動物實驗的初級階段,在持久性、穩定性方面與正常竇房結仍有明顯差距，在起搏功能上還達不到高效、穩定。而Tbx3能夠促進干細胞及心臟前體細胞向竇房結樣細胞分化，增強并維持起搏相關基因的表達，優化起搏組織周圍縫隙連接蛋白的表達，對起搏功能的穩定與維持發揮著重要作用，有利于今后性能持久穩定的新型生物起搏器的獲得,也可能為今后某些心臟傳導系統疾病的治療提供新的靶點，是未來生物起搏研究另一重要調節點。