探討堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)對全腦缺血再灌注大鼠腦皮質內源性神經干細胞增殖、遷移和分化的影響。本研究以"四血管法"制作全腦缺血再灌注模型,采用免疫組化方法檢測BrdU和Nestin在不同組別各時間點的表達,用RT-PCR技術半定量檢測大鼠腦皮質NSE mRNA的表達。結果顯示假手術組大鼠腦皮質基本未見到BrdU和Nestin陽性細胞表達,NSE mRNA表達沒有變化;模型組大鼠腦皮質的BrdU和Nestin陽性細胞在全腦缺血再灌注3 d 后開始增加,7 d達到高峰,NSE mRNA表達無明顯增加;bFGF治療組BrdU、Nestin陽性細胞較模型組在缺血各時間點均明顯增加(P＜0.05),11 d達到高峰,NSE mRNA表達與假手術組和模型組相比第15 d表達有明顯增加(P＜0.05)。結果表明全腦缺血再灌注能夠引起內源性神經干細胞的原位增殖,bFGF可促進全腦缺血再灌注大鼠內源性神經干細胞原位增殖,并延長增殖期,而且有明顯促進內源性神經干細胞向神經元分化的作用。
引用本文： 任銘新, 鄧曉慧, 郭義威, 鄭風勁, 馮志博. 堿性成纖維細胞生長因子對全腦缺血再灌注大鼠腦皮質內源性神經干細胞的影響. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(4): 846-849. doi: 10.7507/1001-5515.20140159 復制
引言
激活內源性神經干細胞(neural stem cells,NSCs)的原位增殖，增加其目標性分化，誘導其向目標位置遷移和生長，對于神經系統疾病的治療是至關重要的。神經營養因子通過特殊的細胞表面受體介導發揮作用，并且在中樞神經系統(central nervous system,CNS)細胞中誘發許多效應，包括促使基因表達，促進軸突生長、樹突分叉，減少損傷后神經元的丟失等[1-2]。本實驗建立四血管全腦缺血再灌注模型，采用堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)大鼠側腦室給藥途徑，用分子標記技術，免疫組化方法檢測5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)和巢蛋白(Nestin)，用RT-PCR半定量分析檢測神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)，其中BrdU陽性細胞可被看做具有增殖活性的細胞，Nestin陽性的細胞可被看作是NSCs，NSE則是神經元所特有的一種酸性蛋白酶，以觀察bFGF對內源性NSCs的影響，為臨床探索一種有效治療腦損傷的方法奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 主要藥品、試劑及儀器
TRIzol、cDNA合成試劑盒、PCR試劑盒購自江蘇碧云天生物技術有限公司；bFGF、BrdU Labeling Reagent、Zymed BrdU Staining Kit購自Invitrogen公司；NSE引物購自上海生工生物工程公司；梯度PCR儀(美國Biorad公司)；凝膠成像系統(西盟國際公司)；68000型大鼠頭顱定位儀、HDL-2100型程控高精度微量注射泵(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；熒光顯微鏡(Nikon)。
1.2 動物分組及處理
選健康成年雄性SD大鼠84只，體重250～300 g，分為三組：假手術組(12只)、模型組(36只)和治療組(36只)。各組按時間又分為3、7、11、15 d四組，每組動物平均分配。側腦室插管，按Bures圖譜定坐標：P 1.5 mm，R 1.5 mm，H 3.5 mm；大鼠顱骨鉆孔，垂直插入導管，用牙科水泥固定導管，建立給藥途徑。適應一周后，治療組手術前20 min側腦室注射bFGF，容積為5 μL(0.1 μg/μL)，每次5 min注畢,留針5 min。假手術組和模型組注射同等劑量生理鹽水。然后，模型組和治療組制作全腦缺血模型，假手術組只進行手術操作，不凝閉結扎血管。各時間點到期動物一半進行灌注取腦用于免疫組化，一半取新鮮腦組織液氮凍存用于RT-PCR。
1.3 實驗方法
1.3.1 免疫組化檢測BrdU、Nestin的表達
通過腦組織的BrdU免疫組織化學染色，觀察大鼠腦皮質全腦缺血再灌注后內源性神經細胞的增殖情況。通過Nestin的免疫組織化學染色，了解大鼠全腦缺血再灌注后內源性NSCs的變化。
石蠟切片60 ℃烤箱烤片2 h；將石蠟切片常規脫蠟至水，蒸餾水洗滌5 min×3次；0.3% H2O2∶甲醇液封閉30 min，PBS洗滌5 min×3次；滴加正常羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗；滴加適當稀釋的一抗(兔IgG)4 ℃過夜孵育；次日37 ℃溫箱復溫20 min，PBS洗5 min×3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃ 30 min，PBS洗5 min×3次；滴加試劑SABC，37 ℃ 30 min，PBS洗5 min×3次；DAB室溫顯色5~10 min，蒸餾水終止反應，脫水、封片；在光學顯微鏡下觀察并記錄實驗結果。
陽性細胞計數方法：每只動物隨機選取相鄰部位腦片三張，每張腦片在相同腦區隨機選取10個非重疊視野(400×)計數，分別計算海馬和皮質BrdU、Nestin陽性細胞和總細胞數，求其平均數為該樣本代表值。
1.3.2 RT-PCR檢測NSE mRNA的表達
應用半定量RT-PCR檢測NSE mRNA轉錄的變化，以了解大鼠全腦缺血再灌注后是否有NSE相應的基因轉錄的上調，從而探討NSCs是否向神經元方向分化。
用TRIzol一步法提取總RNA，經電泳顯示28 S、18 S和5 S清晰3條帶，測定A260/A280比值，取1 μg RNA，以Oligo(dT)18為引物進行逆轉錄反應，反應體系20 μL，引物如表 1所示。PCR擴增反應條件為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，共30循環；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，以Image J圖像處理軟件進行吸光度分析，以Nestin和β-actin吸光度之比進行半定量分析。
表1
目的基因及內參照基因PCR引物序列表
Table1.
PCR primers and sequence of target genes and internal control genes
1.4 統計分析
所有計數資料和計量資料用均數±標準差表示，采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計學分析，兩樣本之間均數比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 全腦缺血再灌注后大鼠腦皮質BrdU陽性細胞的變化(見圖 1 、表 2 )
假手術組大鼠的腦皮質偶爾可以見到BrdU陽性細胞，這些結果提示在正常大鼠腦中存在少量處于持續增殖狀態的細胞。模型組全腦缺血再灌注后3 d，大鼠的腦皮質可以見到BrdU陽性的細胞顯著增加，陽性細胞胞核著色呈棕黃色，細胞核呈圓形、卵圓形、梭形或三角形等，大小不一，排列不規則，在全腦缺血后7 d BrdU陽性細胞數達到峰值。bFGF治療組大鼠的腦皮質BrdU陽性細胞數明顯高于模型組(P＜0.05)，并且在全腦缺血再灌注后11 d BrdU陽性細胞數達到峰值。
圖1
各組大鼠腦皮質不同時間點BrdU、Nestin陽性細胞(SABC-DAB染色，400×)
Figure1.
BrdU- or Nestin-positive cells of rats cerebral cortex at various time points in different groups (SABC-DAB stain,400×)
表2
各組全腦缺血再灌注大鼠腦皮質BrdU、Nestin陽性細胞結果(
2.2 全腦缺血再灌注后大鼠腦皮質Nestin陽性細胞的變化(見圖 1 、表 2 )
結果發現，在假手術組大鼠的腦皮質未見到Nestin陽性的細胞。模型組全腦缺血再灌注后3 d大鼠的腦皮質可以見到Nestin陽性的細胞顯著增加，并且隨著時間的增加Nestin陽性細胞數的增加也更為明顯，在全腦缺血再灌注后7 d Nestin陽性細胞數達到峰值，以后Nestin陽性細胞數有所減少。bFGF治療組各時間點大鼠的腦皮質Nestin陽性細胞數明顯高于模型組(P＜0.05)，在全腦缺血再灌注后11 d Nestin陽性細胞數達到峰值，以后Nestin陽性細胞數有所減少。皮質Nestin陽性細胞中有較長的突起，胞體較大，突起有分叉，排列分散。
2.3 全腦缺血再灌注后大鼠腦皮質NSE mRNA表達變化(見圖 2 )
假手術組各時間點NSE mRNA表達水平沒有變化；模型組和治療組全腦缺血再灌注后11 d以內NSE mRNA表達水平很低，15 d后NSE mRNA水平有所增加，與其它組相比，bFGF治療組NSE mRNA水平明顯增高(P＜0.05)。但由于觀察時間段所限，沒有觀察到NSE mRNA表達高峰。
圖2
全腦缺血再灌注后第15 d各組大鼠腦NSE mRNA表達水平
*
*
3 討論
NSCs是指具有自我復制、自我更新、自我擴展能力的一類細胞。目前研究確證成年哺乳類動物(包括人)腦區存在神經再生現象，主要部位在海馬齒狀回門區(subgranular zone,SGZ)和室管膜下區(subventricular zone,SVZ)，在成年CNS中，這些NSCs常處于G0期[3]。大量實驗研究表明，當中樞神經受到損傷時，由于細胞微環境的改變，NSCs可被激活[4]。腦缺血可激活NSCs，再灌注后5、10 d在齒狀回中用5-BrdU標記的NSCs增加，第10 d標記細胞增加1倍[5-6]。Takagi等[7]在鼠短暫性腦缺血模型中用BrdU進行細胞標記，觀察到NSCs增殖，于再灌注3、7、10、17 d損傷的齒狀回和室旁區發現標記細胞，但只有齒狀回標記細胞顯著增加。本實驗模型組全腦缺血再灌注后3 d大鼠的海馬CA1區可以見到BrdU陽性細胞顯著增加，并且隨著時間的增加，BrdU陽性細胞數增加也更為明顯，在全腦缺血后7 d BrdU陽性細胞數達到峰值，與上述結果基本一致。這說明全腦缺血再灌注后內源性NSCs存在原位增殖。
bFGF有廣泛的生物學效應并且支持腦內不同區域各種神經細胞的存活。它是促進細胞生長作用很強的多肽因子,又是重要的有絲分裂原,參與細胞的生長發育和組織損傷的修復,對神經元具有明顯的營養作用[8-9]。以往有資料顯示，外源性bFGF不易透過血腦屏障。但近期也有資料證實，腦創傷后缺血、缺氧狀況可導致血腦屏障的完整性遭到破壞，從而使bFGF可以透過血腦屏障發揮其腦保護作用[10]。實驗中bFGF治療組BrdU、Nestin陽性細胞明顯多于模型組(P＜0.05)，且增殖高峰在第11 d，NSE mRNA水平在15 d也有明顯的升高(P＜0.05)，說明bFGF不僅可以促進NSCs增殖，還可以促進NSCs的分化。
全腦缺血再灌注后11 d內NSE mRNA水平呈現低表達，提示在此階段由于腦缺血以及再灌注導致腦神經元受到損傷，有部分神經元受損死亡，而新生的NSCs要分化為神經元需要一定的時間，故而呈現較低水平的表達。全腦缺血再灌注后15 d NSE mRNA水平有所增加說明有神經元生成，與模型組相比bFGF治療組NSE mRNA水平明顯增加(P＜0.05)，說明bFGF對細胞分化作用較強，而且向神經元方向分化的趨勢較強。
Qian等[11]報道胚胎大腦皮質NSCs的增殖或分化呈bFGF濃度依賴性，體外培養還發現，bFGF不僅可起到有絲分裂原的作用，也能促進細胞分化并決定分化的方向。例如在大鼠的胚胎干細胞中加入低濃度的bFGF(0.1 ng/mL)，細胞分化為神經元；加入高濃度的bFGF(10 ng/mL)時，則分化為神經元和星形膠質細胞，bFGF起到促分裂劑的作用。本實驗所用濃度(0.1 μg/μL)與文獻報道的低濃度一致，從而有使干細胞分化為神經元的趨勢。但是由于觀察時間較短，NSCs分化還較少，神經生成也較少，因此需要進一步的實驗觀察。
引言
激活內源性神經干細胞(neural stem cells,NSCs)的原位增殖，增加其目標性分化，誘導其向目標位置遷移和生長，對于神經系統疾病的治療是至關重要的。神經營養因子通過特殊的細胞表面受體介導發揮作用，并且在中樞神經系統(central nervous system,CNS)細胞中誘發許多效應，包括促使基因表達，促進軸突生長、樹突分叉，減少損傷后神經元的丟失等[1-2]。本實驗建立四血管全腦缺血再灌注模型，采用堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)大鼠側腦室給藥途徑，用分子標記技術，免疫組化方法檢測5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)和巢蛋白(Nestin)，用RT-PCR半定量分析檢測神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)，其中BrdU陽性細胞可被看做具有增殖活性的細胞，Nestin陽性的細胞可被看作是NSCs，NSE則是神經元所特有的一種酸性蛋白酶，以觀察bFGF對內源性NSCs的影響，為臨床探索一種有效治療腦損傷的方法奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 主要藥品、試劑及儀器
TRIzol、cDNA合成試劑盒、PCR試劑盒購自江蘇碧云天生物技術有限公司；bFGF、BrdU Labeling Reagent、Zymed BrdU Staining Kit購自Invitrogen公司；NSE引物購自上海生工生物工程公司；梯度PCR儀(美國Biorad公司)；凝膠成像系統(西盟國際公司)；68000型大鼠頭顱定位儀、HDL-2100型程控高精度微量注射泵(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；熒光顯微鏡(Nikon)。
1.2 動物分組及處理
選健康成年雄性SD大鼠84只，體重250～300 g，分為三組：假手術組(12只)、模型組(36只)和治療組(36只)。各組按時間又分為3、7、11、15 d四組，每組動物平均分配。側腦室插管，按Bures圖譜定坐標：P 1.5 mm，R 1.5 mm，H 3.5 mm；大鼠顱骨鉆孔，垂直插入導管，用牙科水泥固定導管，建立給藥途徑。適應一周后，治療組手術前20 min側腦室注射bFGF，容積為5 μL(0.1 μg/μL)，每次5 min注畢,留針5 min。假手術組和模型組注射同等劑量生理鹽水。然后，模型組和治療組制作全腦缺血模型，假手術組只進行手術操作，不凝閉結扎血管。各時間點到期動物一半進行灌注取腦用于免疫組化，一半取新鮮腦組織液氮凍存用于RT-PCR。
1.3 實驗方法
1.3.1 免疫組化檢測BrdU、Nestin的表達
通過腦組織的BrdU免疫組織化學染色，觀察大鼠腦皮質全腦缺血再灌注后內源性神經細胞的增殖情況。通過Nestin的免疫組織化學染色，了解大鼠全腦缺血再灌注后內源性NSCs的變化。
石蠟切片60 ℃烤箱烤片2 h；將石蠟切片常規脫蠟至水，蒸餾水洗滌5 min×3次；0.3% H2O2∶甲醇液封閉30 min，PBS洗滌5 min×3次；滴加正常羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗；滴加適當稀釋的一抗(兔IgG)4 ℃過夜孵育；次日37 ℃溫箱復溫20 min，PBS洗5 min×3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃ 30 min，PBS洗5 min×3次；滴加試劑SABC，37 ℃ 30 min，PBS洗5 min×3次；DAB室溫顯色5~10 min，蒸餾水終止反應，脫水、封片；在光學顯微鏡下觀察并記錄實驗結果。
陽性細胞計數方法：每只動物隨機選取相鄰部位腦片三張，每張腦片在相同腦區隨機選取10個非重疊視野(400×)計數，分別計算海馬和皮質BrdU、Nestin陽性細胞和總細胞數，求其平均數為該樣本代表值。
1.3.2 RT-PCR檢測NSE mRNA的表達
應用半定量RT-PCR檢測NSE mRNA轉錄的變化，以了解大鼠全腦缺血再灌注后是否有NSE相應的基因轉錄的上調，從而探討NSCs是否向神經元方向分化。
用TRIzol一步法提取總RNA，經電泳顯示28 S、18 S和5 S清晰3條帶，測定A260/A280比值，取1 μg RNA，以Oligo(dT)18為引物進行逆轉錄反應，反應體系20 μL，引物如表 1所示。PCR擴增反應條件為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，共30循環；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，以Image J圖像處理軟件進行吸光度分析，以Nestin和β-actin吸光度之比進行半定量分析。
表1
目的基因及內參照基因PCR引物序列表
Table1.
PCR primers and sequence of target genes and internal control genes
1.4 統計分析
所有計數資料和計量資料用均數±標準差表示，采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計學分析，兩樣本之間均數比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 全腦缺血再灌注后大鼠腦皮質BrdU陽性細胞的變化(見圖 1 、表 2 )
假手術組大鼠的腦皮質偶爾可以見到BrdU陽性細胞，這些結果提示在正常大鼠腦中存在少量處于持續增殖狀態的細胞。模型組全腦缺血再灌注后3 d，大鼠的腦皮質可以見到BrdU陽性的細胞顯著增加，陽性細胞胞核著色呈棕黃色，細胞核呈圓形、卵圓形、梭形或三角形等，大小不一，排列不規則，在全腦缺血后7 d BrdU陽性細胞數達到峰值。bFGF治療組大鼠的腦皮質BrdU陽性細胞數明顯高于模型組(P＜0.05)，并且在全腦缺血再灌注后11 d BrdU陽性細胞數達到峰值。
圖1
各組大鼠腦皮質不同時間點BrdU、Nestin陽性細胞(SABC-DAB染色，400×)
Figure1.
BrdU- or Nestin-positive cells of rats cerebral cortex at various time points in different groups (SABC-DAB stain,400×)
表2
各組全腦缺血再灌注大鼠腦皮質BrdU、Nestin陽性細胞結果(
2.2 全腦缺血再灌注后大鼠腦皮質Nestin陽性細胞的變化(見圖 1 、表 2 )
結果發現，在假手術組大鼠的腦皮質未見到Nestin陽性的細胞。模型組全腦缺血再灌注后3 d大鼠的腦皮質可以見到Nestin陽性的細胞顯著增加，并且隨著時間的增加Nestin陽性細胞數的增加也更為明顯，在全腦缺血再灌注后7 d Nestin陽性細胞數達到峰值，以后Nestin陽性細胞數有所減少。bFGF治療組各時間點大鼠的腦皮質Nestin陽性細胞數明顯高于模型組(P＜0.05)，在全腦缺血再灌注后11 d Nestin陽性細胞數達到峰值，以后Nestin陽性細胞數有所減少。皮質Nestin陽性細胞中有較長的突起，胞體較大，突起有分叉，排列分散。
2.3 全腦缺血再灌注后大鼠腦皮質NSE mRNA表達變化(見圖 2 )
假手術組各時間點NSE mRNA表達水平沒有變化；模型組和治療組全腦缺血再灌注后11 d以內NSE mRNA表達水平很低，15 d后NSE mRNA水平有所增加，與其它組相比，bFGF治療組NSE mRNA水平明顯增高(P＜0.05)。但由于觀察時間段所限，沒有觀察到NSE mRNA表達高峰。
圖2
全腦缺血再灌注后第15 d各組大鼠腦NSE mRNA表達水平
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3 討論
NSCs是指具有自我復制、自我更新、自我擴展能力的一類細胞。目前研究確證成年哺乳類動物(包括人)腦區存在神經再生現象，主要部位在海馬齒狀回門區(subgranular zone,SGZ)和室管膜下區(subventricular zone,SVZ)，在成年CNS中，這些NSCs常處于G0期[3]。大量實驗研究表明，當中樞神經受到損傷時，由于細胞微環境的改變，NSCs可被激活[4]。腦缺血可激活NSCs，再灌注后5、10 d在齒狀回中用5-BrdU標記的NSCs增加，第10 d標記細胞增加1倍[5-6]。Takagi等[7]在鼠短暫性腦缺血模型中用BrdU進行細胞標記，觀察到NSCs增殖，于再灌注3、7、10、17 d損傷的齒狀回和室旁區發現標記細胞，但只有齒狀回標記細胞顯著增加。本實驗模型組全腦缺血再灌注后3 d大鼠的海馬CA1區可以見到BrdU陽性細胞顯著增加，并且隨著時間的增加，BrdU陽性細胞數增加也更為明顯，在全腦缺血后7 d BrdU陽性細胞數達到峰值，與上述結果基本一致。這說明全腦缺血再灌注后內源性NSCs存在原位增殖。
bFGF有廣泛的生物學效應并且支持腦內不同區域各種神經細胞的存活。它是促進細胞生長作用很強的多肽因子,又是重要的有絲分裂原,參與細胞的生長發育和組織損傷的修復,對神經元具有明顯的營養作用[8-9]。以往有資料顯示，外源性bFGF不易透過血腦屏障。但近期也有資料證實，腦創傷后缺血、缺氧狀況可導致血腦屏障的完整性遭到破壞，從而使bFGF可以透過血腦屏障發揮其腦保護作用[10]。實驗中bFGF治療組BrdU、Nestin陽性細胞明顯多于模型組(P＜0.05)，且增殖高峰在第11 d，NSE mRNA水平在15 d也有明顯的升高(P＜0.05)，說明bFGF不僅可以促進NSCs增殖，還可以促進NSCs的分化。
全腦缺血再灌注后11 d內NSE mRNA水平呈現低表達，提示在此階段由于腦缺血以及再灌注導致腦神經元受到損傷，有部分神經元受損死亡，而新生的NSCs要分化為神經元需要一定的時間，故而呈現較低水平的表達。全腦缺血再灌注后15 d NSE mRNA水平有所增加說明有神經元生成，與模型組相比bFGF治療組NSE mRNA水平明顯增加(P＜0.05)，說明bFGF對細胞分化作用較強，而且向神經元方向分化的趨勢較強。
Qian等[11]報道胚胎大腦皮質NSCs的增殖或分化呈bFGF濃度依賴性，體外培養還發現，bFGF不僅可起到有絲分裂原的作用，也能促進細胞分化并決定分化的方向。例如在大鼠的胚胎干細胞中加入低濃度的bFGF(0.1 ng/mL)，細胞分化為神經元；加入高濃度的bFGF(10 ng/mL)時，則分化為神經元和星形膠質細胞，bFGF起到促分裂劑的作用。本實驗所用濃度(0.1 μg/μL)與文獻報道的低濃度一致，從而有使干細胞分化為神經元的趨勢。但是由于觀察時間較短，NSCs分化還較少，神經生成也較少，因此需要進一步的實驗觀察。
