本研究目的在于構建特異性下調人Runx1基因的shRNA表達質粒。設計并合成人Runx1基因的siRNA,通過DNA重組技術將目的序列插入到pSuper質粒,采用菌落PCR、限制性內切酶酶切技術及測序方法對其進行篩選與鑒定。轉染該質粒于人肺腺癌細胞A549,通過實時熒光定量PCR技術和Western blot方法分別從基因及蛋白水平對其進行功能鑒定。實驗結果表明我們所構建的pSuper-Runx1-shRNA質粒能夠有效抑制A549細胞Runx1 mRNA和蛋白的表達,抑制率分別為33%和50%。
引用本文： 陳一帆, 湯小菊, 羅鳳鳴. Runx1-shRNA重組質粒的構建與表達. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(4): 837-841. doi: 10.7507/1001-5515.20140157 復制
引言
Runx家族是具有高度保守的DNA結合結構域的異源二聚體轉錄因子家族，在生物的生長、發育中起著重要作用[1]。在哺乳動物體內，Runx家族已發現三個成員:Runx1、Runx2、Runx3，其中Runx1最早發現于急性骨髓白血病[2]。
Runx1又稱作急性髓性白血病1蛋白(acute myeloid leukemia-1 protein，AML-1)，是調節造血干細胞向成熟血細胞分化的重要轉錄因子，在定向造血過程中必不可少，同時也是人類白血病發生染色體易位的常見靶位點，有研究表明，人類白血病中約30%與Runx1的變異及其功能喪失或異常有關[3-7]。除此之外，Runx1在其它多種腫瘤中也發揮了重要作用。Fijneman等[8]發現在Runx1基因敲除小鼠中，胃腸道腫瘤的發生率明顯增加，這提示Runx1可能發揮了抑癌基因的作用。類似作用也出現在乳腺癌中[7]。這提示我們Runx1可能在多種腫瘤中發揮著抑癌作用。近年來，學者們越來越重視對Runx1與除白血病以外的其他疾病相互作用的研究，但目前關于其與肺部疾病的研究仍不夠深入，Runx1在肺部疾病中的作用機制尚不明確。
本實驗擬采用基因重組技術，構建特異性沉默人Runx1的表達質粒，將其轉染人肺腺癌細胞A549，觀察抑制效率，為研究Runx1基因在肺癌等肺部疾病中的影響及作用機制提供實驗室依據。
1 材料與方法
1.1 主要材料
表達載體pSuper由本實驗室提供。限制性內切酶BglⅡ、HindⅢ、T4 DNA連接酶購自Thermo Fisher公司；質粒提取試劑盒、DH5α感受態細胞購自天根生化科技有限公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；所有的DNA序列由Invitrogen公司合成，A549細胞保存于本實驗室。
1.2 實驗方法
1.2.1 Runx1 shRNA設計
根據Runx1的全長mRNA序列,遵循設計原則，尋找特異性結合位點，NCBI BLAST分析其特異性，綜合分析、設計的可作用于Runx1三種轉錄本(AML1a、AML1b、AML1c)的Runx1 shRNA序列為：5′-CTGTGAATGCTTCTGATTT-3′。根據目的序列及pSuper載體的結構特點，添加相應的酶切位點及莖環結構后shRNA序列如下：Sense oligo: 5′-GAT-CCCCCTGTGAATGCTTCTGATTTTTCAAGA-GAAAATCAGAAGCATTCACAGTTTTTGGA-AA-3′; Antisense oligo： 5′-AGCTTTTCCAAAA-ACTGTGAATGCTTCTGATTTTCTCTTGAAA-AATCAGAAGCATTCACAGGGG-3′。
1.2.2 shRNA表達載體構建及鑒定
(1)質粒重組：用無菌的ddH2O將shRNA完全溶解，使其終濃度為100 nmol/mL,退火形成雙鏈DNA。同時采用BglⅡ和HindⅢ限制性內切酶酶切pSuper載體，使其形成粘性末端缺口的線性雙鏈DNA，在T4連接酶的作用下，雙鏈shRNA與線性化的pSuper質粒DNA按照堿基互補形成重組環狀雙鏈質粒。
(2)重組質粒篩選和鑒定：將重組質粒轉化于DH5α感受態菌，通過菌落PCR擴增目的片段初篩陽性重組質粒。PCR引物序列為F: 5′-TGGCAGGAAGATGGCTGTG-3′； R: 5′-AGGGTGATGGTTCACGTAG-3′。PCR擴增條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，90 s；共30個循環；72 ℃，7 min延長；4 ℃，保存。隨后采用vector NTI軟件分析選取XbaⅠ和XhoⅠ為酶切位點進一步鑒定重組質粒是否為陽性。最后通過測序，分析目的序列是否發生基因突變。
1.2.3 重組質粒功能鑒定
轉染前一天將人肺腺癌細胞(A549細胞)接種到六孔板，待細胞密度達70%~80%，采用lipofectamine2000將每孔4 μg的重組質粒及陰性對照質粒(scramble plasmid)轉染于細胞中，轉染后6 h換成1640完全培養基，于37 ℃，5% CO2中孵育培養48 h。采用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達來計算轉染效率：轉染率(%)＝發熒光細胞數/同一視野下所有細胞個數×100%。
1.2.4 Runx1 mRNA表達水平檢測
采用Trizol充分裂解轉染重組質粒及陰性對照質粒48 h后的A549細胞，酚氯仿法提取細胞總RNA。采用Rever Tra Ace qPCR RT Kit (QPS-201，TOYOBO)將1.5 μg總RNA在37 ℃ 15 min、98 ℃ 5 min的條件下逆轉錄成cDNA，再以cDNA為模板采用實時熒光定量PCR技術檢測Runx1的mRNA表達水平(共進行三次生物學重復)。引物序列F： 5′-GTGGTCCTACGATCAGTCCT-3′； R: 5′-GTTCTGCAGAGAGGGTTGTC-3′。
1.2.5 Runx1蛋白表達水平檢測
用含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液充分裂解兩組轉染細胞，提取細胞總蛋白，采用Pierce蛋白定量試劑盒BCA法，測定每個蛋白樣本的總蛋白濃度，以每孔25 μg的蛋白上樣量進行SDS-PAGE分離目的蛋白，再將蛋白轉移至PVDF膜，用兔抗Runx1抗體(Abcam，1∶1 000)和山羊抗兔的二抗(1∶3 000)孵育，ECL顯色曝光，Bio-Rad凝膠成像系統采集圖片，Quantity one軟件分析其灰度值，統計分析Runx1蛋白表達水平(共進行三次生物學重復)。
1.3 統計學方法
實驗結果以均數±標準差(
2 結果
2.1 菌落PCR鑒定陽性重組質粒
通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離、鑒定。陽性重組子(C11-C7)的PCR產物片段大小為536 bp，空質粒擴增產物大小為472 bp(見圖 1)。
圖1
Runx1 shRNA重組質粒的菌落PCR鑒定結果
M：marker；N:空質粒；C11~C7:多個菌落
Figure1. PCR Identification result of bacterial colonies of Runx1 shRNA recombinant plasmidM: marker； N: pSuper plasmid； C11-C7: bacterial colonies
2.2 酶切鑒定陽性重組質粒
選取XbaⅠ和XhoⅠ為酶切位點對陽性重組質粒進行酶切分析，陽性重組質粒被切為兩段，大小分別為2 144 bp和3 472 bp，空載體則被切成一條大小為5.6 kb左右的線性DNA片段(見圖 2)。
圖2
重組質粒XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定結果
M：marker；12：空質粒；1~11,13,14：pSuper-Runx1-shRNA重組質粒
Figure2. Identification of the recombination plasmid by enzyme digestionM： marker； 12： pSuper plasmid； 1-11,13，14： pSuper-Runx1-shRNA recombinant plasmid
2.3 測序
將菌落PCR、酶切鑒定結果均為陽性的重組質粒進行序列分析，測序結果顯示與pSuper載體重組的目的shRNA序列沒有發生任何基因突變(見圖 3)。
圖3
重組質粒測序比對結果
Sequence 0:重組質粒堿基序列；Sequence 1:Runx1 shRNA堿基序列。序列前后數字代表該行首個堿基及末尾堿基在此序列中的位置
Figure3. The BLAST result of recombination plasmid sequenceSequence 0: base sequence of recombinant plasmid； Sequence 1: base sequence of Runx1 shRNA. The numbers befor and behind the sequences represent the positions of the first and last bases of each row in the sequences
2.4 轉染效率
Runx1 shRNA重組質粒轉染A549細胞后，通過計算熒光細胞數占總細胞數的比例可估算轉染效率，由圖 4可知：本實驗中將該重組質粒轉染于A549細胞的效率可達60%左右。
圖4
Runx1 shRNA重組質粒轉染A549細胞的轉染效率圖(200×)
Figure4.
Transfection efficiency of Runx1 shRNA plasmid transfected A549 cells (200×)
2.5 Runx1 siRNA抑制A549細胞的Runx1表達
轉染重組質粒于A549細胞48 h后，檢測Runx1的mRNA及蛋白表達水平。結果提示：Runx1 shRNA質粒顯著抑制了A549細胞中Runx1的mRNA和蛋白的表達，其中Runx1 mRNA表達抑制率約33%，蛋白表達抑制率約50%，且差異有統計學意義(P＜0.05)。圖 5為Western blot結果。
圖5
Runx1蛋白的western blot 結果
siRNA: Runx1 shRNA重組質粒轉染組；Scr:陰性對照質粒轉染組
Figure5. Western blot result of Runx1 proteinsiRNA: transfection group of Runx1 shRNA recombinant plasmid； Scr: transfection group of scramble plasmid
3 討論
Runx1是生物體內重要的轉錄因子，參與多種物質轉錄表達的調節。Runx1具有三種不同的選擇性剪接體，分別為AML1a、AML1b、AML1c，且這三種轉錄產物均存在第六外顯子的缺失。與AML1b、AML1c相比，AML1a缺乏正常的轉錄調節功能，但更具靶基因親和力，可以與AMLlb競爭性結合靶基因DNA序列，從而抑制AML1基因的正常轉錄[9]。近年來，有學者發現一種新的Runx1轉錄本，是由外顯子5和外顯子6首尾相接形成的環狀RNA[10]，但仍缺乏關于該轉錄本的進一步研究。有研究證實，在胸腺和脾臟中，AML1c及AML1b的轉錄產物明顯高于其他組織[11]，這提示在啟動子區域可能存在組織特異性調節因素。而此三種轉錄本在肺部的表達差異以及與其他組織表達水平的比較尚不清楚。本實驗根據Runx1的全長mRNA序列，設計可作用于此三種轉錄本的Runx1 shRNA序列，并驗證其在A549細胞中對Runx1表達的抑制作用。
RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由雙鏈RNA分子介導的mRNA特異性降解，繼而抑制基因表達的生物學過程。其機制是雙鏈RNA與RNaseⅢ核酶家族的Dicer結合，其發卡結構可被剪切為小分子RNA片段，即小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)。siRNA與RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)結合，解旋成單鏈，特異性地與靶mRNA互補結合，降解其mRNA，抑制其蛋白表達[12]。
本實驗設計合成了針對Runx1的siRNA,并將其克隆至真核表達載體pSuper質粒中重組形成pSuper-Runx1-shRNA表達質粒，再將該質粒轉染于A549細胞中，分別從mRNA水平及蛋白水平來觀察Runx1表達量的改變。pSuper具有RNA聚合酶Ⅲ的H1啟動子，所以以其作為產生siRNA的載體時，能夠精確定位轉錄開始，從而特異、高效地轉錄出發卡狀RNA，得到發揮RNA干擾效應的siRNA。本研究構建的Runx1重組質粒經酶切鑒定結果符合預期，質粒測序顯示目的shRNA序列連接到載體的克隆位點，且沒有發生任何點突變，這些均證實質粒構建成功。在重組質粒轉染A549細胞48 h后，采用熒光定量PCR與Western blot的方法檢測Runx1的表達量。結果顯示：Runx1 shRNA質粒抑制了A549細胞中Runx1在mRNA和蛋白水平的表達，抑制率分別為33%和50%。這表明pSuper-Runx1-shRNA表達質粒對A549細胞中Runx1的表達有明顯抑制作用。有學者發現，人非小細胞肺癌中Runx1 mRNA的表達率明顯低于肺良性病變旁正常肺組織[13]，這提示Runx1可能在肺癌中發揮著抑癌基因的作用，但其抑癌機制尚不明確。通過構建針對Runx1基因的表達質粒，利用其對肺癌細胞中Runx1表達的抑制作用，為更深入研究Runx1對肺癌發生、發展的調控機制提供了實驗室手段。
本實驗成功構建真核表達質粒pSuper-Runx1-shRNA，證實其在A549細胞中有效抑制Runx1的表達，為進一步探索Runx1的生物學功能提供重要工具，為研究Runx1基因在肺癌及其他肺部疾病中的作用機制提供實驗室依據。
引言
Runx家族是具有高度保守的DNA結合結構域的異源二聚體轉錄因子家族，在生物的生長、發育中起著重要作用[1]。在哺乳動物體內，Runx家族已發現三個成員:Runx1、Runx2、Runx3，其中Runx1最早發現于急性骨髓白血病[2]。
Runx1又稱作急性髓性白血病1蛋白(acute myeloid leukemia-1 protein，AML-1)，是調節造血干細胞向成熟血細胞分化的重要轉錄因子，在定向造血過程中必不可少，同時也是人類白血病發生染色體易位的常見靶位點，有研究表明，人類白血病中約30%與Runx1的變異及其功能喪失或異常有關[3-7]。除此之外，Runx1在其它多種腫瘤中也發揮了重要作用。Fijneman等[8]發現在Runx1基因敲除小鼠中，胃腸道腫瘤的發生率明顯增加，這提示Runx1可能發揮了抑癌基因的作用。類似作用也出現在乳腺癌中[7]。這提示我們Runx1可能在多種腫瘤中發揮著抑癌作用。近年來，學者們越來越重視對Runx1與除白血病以外的其他疾病相互作用的研究，但目前關于其與肺部疾病的研究仍不夠深入，Runx1在肺部疾病中的作用機制尚不明確。
本實驗擬采用基因重組技術，構建特異性沉默人Runx1的表達質粒，將其轉染人肺腺癌細胞A549，觀察抑制效率，為研究Runx1基因在肺癌等肺部疾病中的影響及作用機制提供實驗室依據。
1 材料與方法
1.1 主要材料
表達載體pSuper由本實驗室提供。限制性內切酶BglⅡ、HindⅢ、T4 DNA連接酶購自Thermo Fisher公司；質粒提取試劑盒、DH5α感受態細胞購自天根生化科技有限公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；所有的DNA序列由Invitrogen公司合成，A549細胞保存于本實驗室。
1.2 實驗方法
1.2.1 Runx1 shRNA設計
根據Runx1的全長mRNA序列,遵循設計原則，尋找特異性結合位點，NCBI BLAST分析其特異性，綜合分析、設計的可作用于Runx1三種轉錄本(AML1a、AML1b、AML1c)的Runx1 shRNA序列為：5′-CTGTGAATGCTTCTGATTT-3′。根據目的序列及pSuper載體的結構特點，添加相應的酶切位點及莖環結構后shRNA序列如下：Sense oligo: 5′-GAT-CCCCCTGTGAATGCTTCTGATTTTTCAAGA-GAAAATCAGAAGCATTCACAGTTTTTGGA-AA-3′; Antisense oligo： 5′-AGCTTTTCCAAAA-ACTGTGAATGCTTCTGATTTTCTCTTGAAA-AATCAGAAGCATTCACAGGGG-3′。
1.2.2 shRNA表達載體構建及鑒定
(1)質粒重組：用無菌的ddH2O將shRNA完全溶解，使其終濃度為100 nmol/mL,退火形成雙鏈DNA。同時采用BglⅡ和HindⅢ限制性內切酶酶切pSuper載體，使其形成粘性末端缺口的線性雙鏈DNA，在T4連接酶的作用下，雙鏈shRNA與線性化的pSuper質粒DNA按照堿基互補形成重組環狀雙鏈質粒。
(2)重組質粒篩選和鑒定：將重組質粒轉化于DH5α感受態菌，通過菌落PCR擴增目的片段初篩陽性重組質粒。PCR引物序列為F: 5′-TGGCAGGAAGATGGCTGTG-3′； R: 5′-AGGGTGATGGTTCACGTAG-3′。PCR擴增條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，90 s；共30個循環；72 ℃，7 min延長；4 ℃，保存。隨后采用vector NTI軟件分析選取XbaⅠ和XhoⅠ為酶切位點進一步鑒定重組質粒是否為陽性。最后通過測序，分析目的序列是否發生基因突變。
1.2.3 重組質粒功能鑒定
轉染前一天將人肺腺癌細胞(A549細胞)接種到六孔板，待細胞密度達70%~80%，采用lipofectamine2000將每孔4 μg的重組質粒及陰性對照質粒(scramble plasmid)轉染于細胞中，轉染后6 h換成1640完全培養基，于37 ℃，5% CO2中孵育培養48 h。采用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達來計算轉染效率：轉染率(%)＝發熒光細胞數/同一視野下所有細胞個數×100%。
1.2.4 Runx1 mRNA表達水平檢測
采用Trizol充分裂解轉染重組質粒及陰性對照質粒48 h后的A549細胞，酚氯仿法提取細胞總RNA。采用Rever Tra Ace qPCR RT Kit (QPS-201，TOYOBO)將1.5 μg總RNA在37 ℃ 15 min、98 ℃ 5 min的條件下逆轉錄成cDNA，再以cDNA為模板采用實時熒光定量PCR技術檢測Runx1的mRNA表達水平(共進行三次生物學重復)。引物序列F： 5′-GTGGTCCTACGATCAGTCCT-3′； R: 5′-GTTCTGCAGAGAGGGTTGTC-3′。
1.2.5 Runx1蛋白表達水平檢測
用含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液充分裂解兩組轉染細胞，提取細胞總蛋白，采用Pierce蛋白定量試劑盒BCA法，測定每個蛋白樣本的總蛋白濃度，以每孔25 μg的蛋白上樣量進行SDS-PAGE分離目的蛋白，再將蛋白轉移至PVDF膜，用兔抗Runx1抗體(Abcam，1∶1 000)和山羊抗兔的二抗(1∶3 000)孵育，ECL顯色曝光，Bio-Rad凝膠成像系統采集圖片，Quantity one軟件分析其灰度值，統計分析Runx1蛋白表達水平(共進行三次生物學重復)。
1.3 統計學方法
實驗結果以均數±標準差(
2 結果
2.1 菌落PCR鑒定陽性重組質粒
通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離、鑒定。陽性重組子(C11-C7)的PCR產物片段大小為536 bp，空質粒擴增產物大小為472 bp(見圖 1)。
圖1
Runx1 shRNA重組質粒的菌落PCR鑒定結果
M：marker；N:空質粒；C11~C7:多個菌落
Figure1. PCR Identification result of bacterial colonies of Runx1 shRNA recombinant plasmidM: marker； N: pSuper plasmid； C11-C7: bacterial colonies
2.2 酶切鑒定陽性重組質粒
選取XbaⅠ和XhoⅠ為酶切位點對陽性重組質粒進行酶切分析，陽性重組質粒被切為兩段，大小分別為2 144 bp和3 472 bp，空載體則被切成一條大小為5.6 kb左右的線性DNA片段(見圖 2)。
圖2
重組質粒XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定結果
M：marker；12：空質粒；1~11,13,14：pSuper-Runx1-shRNA重組質粒
Figure2. Identification of the recombination plasmid by enzyme digestionM： marker； 12： pSuper plasmid； 1-11,13，14： pSuper-Runx1-shRNA recombinant plasmid
2.3 測序
將菌落PCR、酶切鑒定結果均為陽性的重組質粒進行序列分析，測序結果顯示與pSuper載體重組的目的shRNA序列沒有發生任何基因突變(見圖 3)。
圖3
重組質粒測序比對結果
Sequence 0:重組質粒堿基序列；Sequence 1:Runx1 shRNA堿基序列。序列前后數字代表該行首個堿基及末尾堿基在此序列中的位置
Figure3. The BLAST result of recombination plasmid sequenceSequence 0: base sequence of recombinant plasmid； Sequence 1: base sequence of Runx1 shRNA. The numbers befor and behind the sequences represent the positions of the first and last bases of each row in the sequences
2.4 轉染效率
Runx1 shRNA重組質粒轉染A549細胞后，通過計算熒光細胞數占總細胞數的比例可估算轉染效率，由圖 4可知：本實驗中將該重組質粒轉染于A549細胞的效率可達60%左右。
圖4
Runx1 shRNA重組質粒轉染A549細胞的轉染效率圖(200×)
Figure4.
Transfection efficiency of Runx1 shRNA plasmid transfected A549 cells (200×)
2.5 Runx1 siRNA抑制A549細胞的Runx1表達
轉染重組質粒于A549細胞48 h后，檢測Runx1的mRNA及蛋白表達水平。結果提示：Runx1 shRNA質粒顯著抑制了A549細胞中Runx1的mRNA和蛋白的表達，其中Runx1 mRNA表達抑制率約33%，蛋白表達抑制率約50%，且差異有統計學意義(P＜0.05)。圖 5為Western blot結果。
圖5
Runx1蛋白的western blot 結果
siRNA: Runx1 shRNA重組質粒轉染組；Scr:陰性對照質粒轉染組
Figure5. Western blot result of Runx1 proteinsiRNA: transfection group of Runx1 shRNA recombinant plasmid； Scr: transfection group of scramble plasmid
3 討論
Runx1是生物體內重要的轉錄因子，參與多種物質轉錄表達的調節。Runx1具有三種不同的選擇性剪接體，分別為AML1a、AML1b、AML1c，且這三種轉錄產物均存在第六外顯子的缺失。與AML1b、AML1c相比，AML1a缺乏正常的轉錄調節功能，但更具靶基因親和力，可以與AMLlb競爭性結合靶基因DNA序列，從而抑制AML1基因的正常轉錄[9]。近年來，有學者發現一種新的Runx1轉錄本，是由外顯子5和外顯子6首尾相接形成的環狀RNA[10]，但仍缺乏關于該轉錄本的進一步研究。有研究證實，在胸腺和脾臟中，AML1c及AML1b的轉錄產物明顯高于其他組織[11]，這提示在啟動子區域可能存在組織特異性調節因素。而此三種轉錄本在肺部的表達差異以及與其他組織表達水平的比較尚不清楚。本實驗根據Runx1的全長mRNA序列，設計可作用于此三種轉錄本的Runx1 shRNA序列，并驗證其在A549細胞中對Runx1表達的抑制作用。
RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由雙鏈RNA分子介導的mRNA特異性降解，繼而抑制基因表達的生物學過程。其機制是雙鏈RNA與RNaseⅢ核酶家族的Dicer結合，其發卡結構可被剪切為小分子RNA片段，即小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)。siRNA與RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)結合，解旋成單鏈，特異性地與靶mRNA互補結合，降解其mRNA，抑制其蛋白表達[12]。
本實驗設計合成了針對Runx1的siRNA,并將其克隆至真核表達載體pSuper質粒中重組形成pSuper-Runx1-shRNA表達質粒，再將該質粒轉染于A549細胞中，分別從mRNA水平及蛋白水平來觀察Runx1表達量的改變。pSuper具有RNA聚合酶Ⅲ的H1啟動子，所以以其作為產生siRNA的載體時，能夠精確定位轉錄開始，從而特異、高效地轉錄出發卡狀RNA，得到發揮RNA干擾效應的siRNA。本研究構建的Runx1重組質粒經酶切鑒定結果符合預期，質粒測序顯示目的shRNA序列連接到載體的克隆位點，且沒有發生任何點突變，這些均證實質粒構建成功。在重組質粒轉染A549細胞48 h后，采用熒光定量PCR與Western blot的方法檢測Runx1的表達量。結果顯示：Runx1 shRNA質粒抑制了A549細胞中Runx1在mRNA和蛋白水平的表達，抑制率分別為33%和50%。這表明pSuper-Runx1-shRNA表達質粒對A549細胞中Runx1的表達有明顯抑制作用。有學者發現，人非小細胞肺癌中Runx1 mRNA的表達率明顯低于肺良性病變旁正常肺組織[13]，這提示Runx1可能在肺癌中發揮著抑癌基因的作用，但其抑癌機制尚不明確。通過構建針對Runx1基因的表達質粒，利用其對肺癌細胞中Runx1表達的抑制作用，為更深入研究Runx1對肺癌發生、發展的調控機制提供了實驗室手段。
本實驗成功構建真核表達質粒pSuper-Runx1-shRNA，證實其在A549細胞中有效抑制Runx1的表達，為進一步探索Runx1的生物學功能提供重要工具，為研究Runx1基因在肺癌及其他肺部疾病中的作用機制提供實驗室依據。
