為探討間歇性加載力學刺激對骨細胞機械敏感性的影響,應用我們實驗室自制的細胞加力裝置對MLO-Y4骨樣細胞施加周期性壓力(CCF),觀察不同時長間歇期(5、15和30 s)的力學刺激對骨細胞機械敏感性的影響。本研究運用Griess法及酶聯免疫吸附測定(ELISA)法分別檢測一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)分泌水平,采用免疫熒光對細胞骨架F-actin進行染色觀察。結果發現:15 s以上間歇期壓力加載組骨細胞分泌NO及PGE2明顯高于持續加載組(P＜0.05),并且間歇性加載壓力可提高細胞骨架順應力學刺激方向的定向排列。該結果提示,間歇性加載周期性壓力可顯著提高骨細胞的機械敏感性,且與細胞骨架的定向排列有一定關系。
引用本文： 陰健, 浩志超, 廖爽, 劉穎, 沈頡飛, 廖運茂, 王航. 間歇性加載周期性壓力增加骨細胞分泌一氧化氮和前列腺素E2. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(3): 619-624. doi: 10.7507/1001-5515.20140116 復制
引言
骨組織一生都在發生改建，機械刺激是引起骨骼改建的重要因素。根據wolff 定律，骨組織受到機械刺激調整骨質骨量，以達到最佳力學性能[1]。研究發現日常活動并不能增加骨質形成，而高強度運動在啟動初期骨形成后，其成骨作用逐漸衰減[2]。骨對機械刺激的適應有賴于載荷的持續時間[3]、幅度[4] 以及頻率[5]。動物實驗證實，骨組織受到持續性機械刺激時，其成骨效應存在飽和現象[6-8]。但是，在同樣強度刺激中加入適當休息期后，骨骼恢復了對機械刺激的反應性[9-10]。目前，該現象的具體機制尚不清楚，亟待細胞層面的深入研究。
骨組織主要由骨細胞、成骨細胞、破骨細胞及骨襯細胞組成。其中骨細胞因其含量最多(90%~95%)[11]、廣泛分布以及伸出突起相連成網絡等解剖特征被視為主要的應力感受及轉導細胞[12]，并能通過調節成骨細胞和破骨細胞的數量及活性而調控骨改建[13]。研究還證實骨細胞對機械刺激的敏感性強于成骨細胞及骨膜下的成纖維細胞[14]。因此，研究骨代謝的中心細胞--骨細胞[15-16]，對揭示間歇性加載提高骨組織成骨效應的具體機制具有重要意義。
本研究通過對MLO-Y4骨樣細胞系施加插入不同時長間歇期的間歇性周期壓應力，觀察骨細胞迅即信號分子一氧化氮(nitric oxide，NO)及前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的分泌情況，明確間歇性加載是否促進骨細胞對機械刺激的反應性，并通過細胞骨架F-actin免疫熒光染色初步探討細胞骨架在其中的作用。
1 材料與方法
1.1 四點彎曲加力裝置
采用四川大學華西口腔醫學院與電子科技大學聯合研制的FORCELL細胞壓力加載儀(專利號CN2534576Y)對細胞施加周期性壓力(cyclic compressive force,CCF)，以未加力的細胞為對照。
1.2 細胞培養及加載方案
采用Bonewald教授等建立的MLO-Y4骨樣細胞株于α-MEM培養基(Gibco,Grand Island,NY,USA)中體外傳代培養。當細胞長到80%融合時，EDTA+胰酶消化，將約5×105個骨細胞接種到消毒后的加力板上，孵育一夜后加力。
參數設置為強度2 000微應變(με，1ε=106με)、頻率2 Hz、時間30 min。設置空白對照組(不加載)、持續加載組(間歇期0 s)、5 s組(間歇期5 s)、15 s組(間歇期15 s)和30 s組(間歇期30 s)。
為進一步研究間歇性加載對CCF刺激骨細胞分泌NO及PGE2的影響，加載前培養基中分別加入NO合成抑制劑L-NAME(50 μmol/L)及前列腺素合成酶抑制劑NS-398(30 μmol/L)處理細胞1 h，后施加插入15 s間歇期和持續性加載的CCF力學刺激。
1.3 Griess法及ELISA法分別檢測NO和PGE2分泌水平
收集加載后培養基，1 000 r/min離心2 min去除雜質，-20℃保存備用。
嚴格按照說明書操作測定NO及PGE2(Beyotime，China)含量，設置標準曲線及3個復孔，540 nm測定吸光度。
1.4 細胞骨架F-actin免疫熒光染色
將各組細胞固定于含4%甲醛的PBS液20 min，含0.1% Triton X-100 的PBS液10 min，PBS液終止進行免疫染色，以肌動蛋白(actin)的單克隆抗體作為一抗(2 h)，Alexa-Fluor 488 作為二抗(30 min)，然后使用熒光顯微鏡觀察骨細胞內肌動蛋白微絲的重組和細胞形態。
1.5 統計學處理
所有實驗至少重復3次。采用統計學軟件SPSS13.0處理，多組之間采用單因素方差(One-Way ANOVA)分析。數據均以
2 結果
2.1 間歇性加載顯著提高骨細胞分泌NO及PGE2
如圖 1及圖 2所示，持續性加載刺激后骨細胞分泌NO及PGE2較空白對照組顯著升高(P＜0.05)。插入間歇期15 s及30 s的加載后，NO及PGE2分泌量進一步升高(P＜0.05)。而5 s組NO及PGE2分泌較持續加載組未見明顯增加(P＞0.05)。
圖1
MLO-Y4骨樣細胞分泌NO水平
L表示L-NAME,N表示NS-398；*
L: L-NAME,N: NS-398; *
圖2
MLO-Y4骨樣細胞分泌NO水平
*
*
預孵抑制劑后對細胞施加插入15 s間歇期和持續性加載的CCF刺激(見圖 1、圖 2)。結果顯示，預孵L-NAME和NS-398后的15 s組NO分泌水平低于單純15 s間歇期加載組(P＜0.05)，而與單純持續加載組比較差異無統計學意義(P＞0.05)；預孵兩種抑制劑的持續性加載組NO分泌與單純持續性加載組比較也無明顯差異(P＞0.05)。預孵L-NAME和NS-398后施加間歇性和持續性加載，PGE2分泌水平均明顯低于單純持續加載組(P＜0.05)。
2.2 間歇性加載對細胞骨架的影響
如圖 3所示，無力學刺激的對照組，細胞呈星形或多角形，從細胞體上伸出多個分支，呈現典型的骨細胞形態，細胞排列無明顯方向性。如圖 4所示，施加了CCF機械刺激后，部分細胞呈梭形甚至長條形。與持續性加力組相比，間歇性加載組梭形細胞的比例提高，且細胞排列表現出一定的方向性。間歇期時間越長，這種細胞形態上的改變愈加明顯。
圖3
空白對照組(C)細胞骨架F-actin免疫熒光染色
Figure3.
Immunofluorescence stain of cytoskeleton F-actin in the control group
圖4
插入不同間歇期間歇性加載細胞骨架F-actin免疫熒光染色,×200
Figure4.
Immunofluorescence stain of cytoskeleton F-actin in the loading groups
3 討論
骨骼受到的機械刺激主要包括剪切力、壓應力和張應力三種[17]。骨骼在跑跳等活動中發生彎曲形變，因此骨骼細胞隨著基質形變受到壓應力刺激。在日常活動中，脊椎動物的骨骼受到的應力范圍在2 000~3 500 μstrain[18]，頻率為1~3 Hz[19]。本課題運用四點彎曲細胞加力裝置體外模擬骨細胞受到的周期性壓應力，參數設置為2 000 μstrain、2 Hz及30 min，模擬日常活動受到的力學刺激。
骨骼長期受到持續性動態載荷刺激，其成骨反應會出現飽和。由于機械刺激的成骨效應在啟動后很快達到飽和臨界點，使骨骼不再對隨后的刺激做出反應，因而飽和狀態的存在不利于骨質的形成和更新。Robling等[10]研究大鼠脛骨四點彎曲加力模型發現，加力周期中加入14 s間歇期組的成骨效應顯著強于持續加力組。除此之外，恢復期的引入可以顯著降低誘導骨形成的加載閾值(周期和載幅)[20]，在低頻加載中插入≥10 s的休息期可以顯著促進鼠脛骨的成骨[21]。細胞層面研究也有類似結論。對成骨細胞施加流體剪切力發現，在力學刺激周期中插入數秒(5、10和15 s)的間歇期，其成骨相關效應分子PGE2、骨橋蛋白(oesteopontin,OPN)及COX-2表達顯著高于持續加力組[4, 22]。Klein-Nulend等[23]體外對胎鼠頭骨施加間歇性壓應力，發現肥大軟骨細胞及成骨細胞的成骨效應顯著增強。
并且，對間充質干細胞[24]及骨骼肌細胞[25]的研究也證實了細胞對力學刺激存在飽和現象，而間歇期的插入可明顯提高細胞對力學刺激的反應能力。雖然對成骨細胞等的研究初步提示了間歇性加載對骨改建的作用機制，但是對主要的應力感受及調控骨改建的中心細胞--骨細胞卻缺乏相關研究。
骨細胞通過分泌如NO和PGE2等可溶性分子進行細胞間通信調控骨改建[26]。Klein-Nulend等[27]證實骨細胞受到機械刺激后5 min內NO生成迅速升高。NO具有調控成骨和破骨細胞活性的功能[28]，參與機械刺激引起大鼠的骨形成[29]。骨細胞以及成骨細胞系細胞均能大量分泌PGE2，該細胞因子對機械刺激下的骨形成具有重要作用[30]。
本研究結果發現，L-NAME和NS-398能夠抑制間歇性加載引起的NO升高，以及間歇性和持續性加載引起的PGE2升高，但對持續性加載引起的NO分泌升高無明顯影響。研究表明，NO與環氧合酶(cyclooxygenase,COX)信號通路存在復雜的交聯。NO能提高COX活性而增加PGE2的生成[31-33]，COX-2活性也能影響NO的分泌[34]。細胞分泌NO主要由兩條途徑介導：內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和誘導型NOS(inducible NOS,iNOS)[35]。L-NAME主要為eNOS的可逆性抑制劑，這是一種鈣離子依賴的NO合成系統，胞內鈣離子濃度的變化直接影響其活性。與持續性加載相比，受到間歇性加載細胞的胞內鈣離子濃度升高的次數及幅度明顯增加[4]，胞內鈣離子濃度的波動可引起eNOS的激活而分泌NO。NS-398為特異性環氧合酶-2(COX-2)抑制劑，研究表明抑制COX-2對iNOS無明顯影響[34-36]。因此，無論是L-NAME及NS-398僅能抑制間歇性加載造成的NO增加，但如前述，它們能分別直接或間接地抑制兩種加載引起的PGE2升高。我們推測，持續性加載的細胞是通過iNOS分泌NO，例如通過分泌其他細胞因子激活iNOS。
Smith 等[37]證實機械刺激下骨細胞迅速大量分泌PGE2，進一步研究顯示該過程與肌動蛋白--細胞骨架密切相關。當加入環保菌素B(cytochalasin B)分解肌動蛋白絲后，可抑制流動刺激引起的PGE2分泌增加[38]。細胞骨架可物理性地聯系細胞內外結構，將外界刺激傳入細胞內部并參與轉化為生物化學信號。細胞骨架接受機械刺激發生形變后，通過機械效應及化學效應調節多個信號通路[39]。McGarry等[40]對骨細胞及成骨細胞施加流體剪切力發現，細胞骨架尤其是肌動蛋白絲與力的方向平行排列，且與骨細胞分泌NO和PGE2有關。故本實驗通過檢測骨細胞受到力學刺激后分泌NO及PGE2水平以及F-actin細胞骨架排列，可以揭示骨細胞對機械刺激的反應性。
本研究首次證實，間歇性機械刺激可顯著提高骨細胞的機械敏感性。插入15 s以上間歇期的壓應力可顯著提高骨細胞受力后分泌NO及PGE2水平，與既往體外實驗結果一致，并初步證實細胞骨架F-actin的定向排列參與其中。實驗結果揭示了間歇性加載促進骨形成的部分分子機制，為進一步研究骨改建奠定基礎。但本研究尚存在許多不足之處，如加載幅度、時間及頻率設置單一，間歇期長短可更豐富與細化；受到機械刺激，細胞內鈣離子濃度的波動敏感而迅速[41]，是細胞機械敏感性的重要指標，遺憾的是由于實驗裝置限制本實驗未能進行檢測；不同加載方式下骨細胞分泌NO及PGE2的不同未深入探討；細胞骨架的研究局限于定性的形態學研究，尚需在分子水平定量研究。
引言
骨組織一生都在發生改建，機械刺激是引起骨骼改建的重要因素。根據wolff 定律，骨組織受到機械刺激調整骨質骨量，以達到最佳力學性能[1]。研究發現日常活動并不能增加骨質形成，而高強度運動在啟動初期骨形成后，其成骨作用逐漸衰減[2]。骨對機械刺激的適應有賴于載荷的持續時間[3]、幅度[4] 以及頻率[5]。動物實驗證實，骨組織受到持續性機械刺激時，其成骨效應存在飽和現象[6-8]。但是，在同樣強度刺激中加入適當休息期后，骨骼恢復了對機械刺激的反應性[9-10]。目前，該現象的具體機制尚不清楚，亟待細胞層面的深入研究。
骨組織主要由骨細胞、成骨細胞、破骨細胞及骨襯細胞組成。其中骨細胞因其含量最多(90%~95%)[11]、廣泛分布以及伸出突起相連成網絡等解剖特征被視為主要的應力感受及轉導細胞[12]，并能通過調節成骨細胞和破骨細胞的數量及活性而調控骨改建[13]。研究還證實骨細胞對機械刺激的敏感性強于成骨細胞及骨膜下的成纖維細胞[14]。因此，研究骨代謝的中心細胞--骨細胞[15-16]，對揭示間歇性加載提高骨組織成骨效應的具體機制具有重要意義。
本研究通過對MLO-Y4骨樣細胞系施加插入不同時長間歇期的間歇性周期壓應力，觀察骨細胞迅即信號分子一氧化氮(nitric oxide，NO)及前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的分泌情況，明確間歇性加載是否促進骨細胞對機械刺激的反應性，并通過細胞骨架F-actin免疫熒光染色初步探討細胞骨架在其中的作用。
1 材料與方法
1.1 四點彎曲加力裝置
采用四川大學華西口腔醫學院與電子科技大學聯合研制的FORCELL細胞壓力加載儀(專利號CN2534576Y)對細胞施加周期性壓力(cyclic compressive force,CCF)，以未加力的細胞為對照。
1.2 細胞培養及加載方案
采用Bonewald教授等建立的MLO-Y4骨樣細胞株于α-MEM培養基(Gibco,Grand Island,NY,USA)中體外傳代培養。當細胞長到80%融合時，EDTA+胰酶消化，將約5×105個骨細胞接種到消毒后的加力板上，孵育一夜后加力。
參數設置為強度2 000微應變(με，1ε=106με)、頻率2 Hz、時間30 min。設置空白對照組(不加載)、持續加載組(間歇期0 s)、5 s組(間歇期5 s)、15 s組(間歇期15 s)和30 s組(間歇期30 s)。
為進一步研究間歇性加載對CCF刺激骨細胞分泌NO及PGE2的影響，加載前培養基中分別加入NO合成抑制劑L-NAME(50 μmol/L)及前列腺素合成酶抑制劑NS-398(30 μmol/L)處理細胞1 h，后施加插入15 s間歇期和持續性加載的CCF力學刺激。
1.3 Griess法及ELISA法分別檢測NO和PGE2分泌水平
收集加載后培養基，1 000 r/min離心2 min去除雜質，-20℃保存備用。
嚴格按照說明書操作測定NO及PGE2(Beyotime，China)含量，設置標準曲線及3個復孔，540 nm測定吸光度。
1.4 細胞骨架F-actin免疫熒光染色
將各組細胞固定于含4%甲醛的PBS液20 min，含0.1% Triton X-100 的PBS液10 min，PBS液終止進行免疫染色，以肌動蛋白(actin)的單克隆抗體作為一抗(2 h)，Alexa-Fluor 488 作為二抗(30 min)，然后使用熒光顯微鏡觀察骨細胞內肌動蛋白微絲的重組和細胞形態。
1.5 統計學處理
所有實驗至少重復3次。采用統計學軟件SPSS13.0處理，多組之間采用單因素方差(One-Way ANOVA)分析。數據均以
2 結果
2.1 間歇性加載顯著提高骨細胞分泌NO及PGE2
如圖 1及圖 2所示，持續性加載刺激后骨細胞分泌NO及PGE2較空白對照組顯著升高(P＜0.05)。插入間歇期15 s及30 s的加載后，NO及PGE2分泌量進一步升高(P＜0.05)。而5 s組NO及PGE2分泌較持續加載組未見明顯增加(P＞0.05)。
圖1
MLO-Y4骨樣細胞分泌NO水平
L表示L-NAME,N表示NS-398；*
L: L-NAME,N: NS-398; *
圖2
MLO-Y4骨樣細胞分泌NO水平
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預孵抑制劑后對細胞施加插入15 s間歇期和持續性加載的CCF刺激(見圖 1、圖 2)。結果顯示，預孵L-NAME和NS-398后的15 s組NO分泌水平低于單純15 s間歇期加載組(P＜0.05)，而與單純持續加載組比較差異無統計學意義(P＞0.05)；預孵兩種抑制劑的持續性加載組NO分泌與單純持續性加載組比較也無明顯差異(P＞0.05)。預孵L-NAME和NS-398后施加間歇性和持續性加載，PGE2分泌水平均明顯低于單純持續加載組(P＜0.05)。
2.2 間歇性加載對細胞骨架的影響
如圖 3所示，無力學刺激的對照組，細胞呈星形或多角形，從細胞體上伸出多個分支，呈現典型的骨細胞形態，細胞排列無明顯方向性。如圖 4所示，施加了CCF機械刺激后，部分細胞呈梭形甚至長條形。與持續性加力組相比，間歇性加載組梭形細胞的比例提高，且細胞排列表現出一定的方向性。間歇期時間越長，這種細胞形態上的改變愈加明顯。
圖3
空白對照組(C)細胞骨架F-actin免疫熒光染色
Figure3.
Immunofluorescence stain of cytoskeleton F-actin in the control group
圖4
插入不同間歇期間歇性加載細胞骨架F-actin免疫熒光染色,×200
Figure4.
Immunofluorescence stain of cytoskeleton F-actin in the loading groups
3 討論
骨骼受到的機械刺激主要包括剪切力、壓應力和張應力三種[17]。骨骼在跑跳等活動中發生彎曲形變，因此骨骼細胞隨著基質形變受到壓應力刺激。在日常活動中，脊椎動物的骨骼受到的應力范圍在2 000~3 500 μstrain[18]，頻率為1~3 Hz[19]。本課題運用四點彎曲細胞加力裝置體外模擬骨細胞受到的周期性壓應力，參數設置為2 000 μstrain、2 Hz及30 min，模擬日常活動受到的力學刺激。
骨骼長期受到持續性動態載荷刺激，其成骨反應會出現飽和。由于機械刺激的成骨效應在啟動后很快達到飽和臨界點，使骨骼不再對隨后的刺激做出反應，因而飽和狀態的存在不利于骨質的形成和更新。Robling等[10]研究大鼠脛骨四點彎曲加力模型發現，加力周期中加入14 s間歇期組的成骨效應顯著強于持續加力組。除此之外，恢復期的引入可以顯著降低誘導骨形成的加載閾值(周期和載幅)[20]，在低頻加載中插入≥10 s的休息期可以顯著促進鼠脛骨的成骨[21]。細胞層面研究也有類似結論。對成骨細胞施加流體剪切力發現，在力學刺激周期中插入數秒(5、10和15 s)的間歇期，其成骨相關效應分子PGE2、骨橋蛋白(oesteopontin,OPN)及COX-2表達顯著高于持續加力組[4, 22]。Klein-Nulend等[23]體外對胎鼠頭骨施加間歇性壓應力，發現肥大軟骨細胞及成骨細胞的成骨效應顯著增強。
并且，對間充質干細胞[24]及骨骼肌細胞[25]的研究也證實了細胞對力學刺激存在飽和現象，而間歇期的插入可明顯提高細胞對力學刺激的反應能力。雖然對成骨細胞等的研究初步提示了間歇性加載對骨改建的作用機制，但是對主要的應力感受及調控骨改建的中心細胞--骨細胞卻缺乏相關研究。
骨細胞通過分泌如NO和PGE2等可溶性分子進行細胞間通信調控骨改建[26]。Klein-Nulend等[27]證實骨細胞受到機械刺激后5 min內NO生成迅速升高。NO具有調控成骨和破骨細胞活性的功能[28]，參與機械刺激引起大鼠的骨形成[29]。骨細胞以及成骨細胞系細胞均能大量分泌PGE2，該細胞因子對機械刺激下的骨形成具有重要作用[30]。
本研究結果發現，L-NAME和NS-398能夠抑制間歇性加載引起的NO升高，以及間歇性和持續性加載引起的PGE2升高，但對持續性加載引起的NO分泌升高無明顯影響。研究表明，NO與環氧合酶(cyclooxygenase,COX)信號通路存在復雜的交聯。NO能提高COX活性而增加PGE2的生成[31-33]，COX-2活性也能影響NO的分泌[34]。細胞分泌NO主要由兩條途徑介導：內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和誘導型NOS(inducible NOS,iNOS)[35]。L-NAME主要為eNOS的可逆性抑制劑，這是一種鈣離子依賴的NO合成系統，胞內鈣離子濃度的變化直接影響其活性。與持續性加載相比，受到間歇性加載細胞的胞內鈣離子濃度升高的次數及幅度明顯增加[4]，胞內鈣離子濃度的波動可引起eNOS的激活而分泌NO。NS-398為特異性環氧合酶-2(COX-2)抑制劑，研究表明抑制COX-2對iNOS無明顯影響[34-36]。因此，無論是L-NAME及NS-398僅能抑制間歇性加載造成的NO增加，但如前述，它們能分別直接或間接地抑制兩種加載引起的PGE2升高。我們推測，持續性加載的細胞是通過iNOS分泌NO，例如通過分泌其他細胞因子激活iNOS。
Smith 等[37]證實機械刺激下骨細胞迅速大量分泌PGE2，進一步研究顯示該過程與肌動蛋白--細胞骨架密切相關。當加入環保菌素B(cytochalasin B)分解肌動蛋白絲后，可抑制流動刺激引起的PGE2分泌增加[38]。細胞骨架可物理性地聯系細胞內外結構，將外界刺激傳入細胞內部并參與轉化為生物化學信號。細胞骨架接受機械刺激發生形變后，通過機械效應及化學效應調節多個信號通路[39]。McGarry等[40]對骨細胞及成骨細胞施加流體剪切力發現，細胞骨架尤其是肌動蛋白絲與力的方向平行排列，且與骨細胞分泌NO和PGE2有關。故本實驗通過檢測骨細胞受到力學刺激后分泌NO及PGE2水平以及F-actin細胞骨架排列，可以揭示骨細胞對機械刺激的反應性。
本研究首次證實，間歇性機械刺激可顯著提高骨細胞的機械敏感性。插入15 s以上間歇期的壓應力可顯著提高骨細胞受力后分泌NO及PGE2水平，與既往體外實驗結果一致，并初步證實細胞骨架F-actin的定向排列參與其中。實驗結果揭示了間歇性加載促進骨形成的部分分子機制，為進一步研究骨改建奠定基礎。但本研究尚存在許多不足之處，如加載幅度、時間及頻率設置單一，間歇期長短可更豐富與細化；受到機械刺激，細胞內鈣離子濃度的波動敏感而迅速[41]，是細胞機械敏感性的重要指標，遺憾的是由于實驗裝置限制本實驗未能進行檢測；不同加載方式下骨細胞分泌NO及PGE2的不同未深入探討；細胞骨架的研究局限于定性的形態學研究，尚需在分子水平定量研究。
