骨髓間充質干細胞(BMSCs)作為一種具有多向分化潛能的干細胞廣泛地運用于組織再生工程中。在促BMSCs向心肌樣細胞分化的過程中,我們探討周期性雙軸力學應變對其的影響。本實驗分為三組:力學應變組,將大鼠BMSCs(rBMSCs)接種于硅膠膜上,施加應變大小10%、頻率1 Hz力學應變,持續時間分別為6、12、24 h;空白對照組,將rBMSCs接種于硅膠膜上,用完全培養基培養;基底對照組,將rBMSCs接種于六孔板中,用完全培養基培養。兩組對照組分別于力學應變組加力相同時間點收集樣本。通過實時熒光定量PCR方法檢測各組rBMSCs的GATA4和肌細胞特異性增強因子-2C(MEF-2C)的mRNA表達,并利用Western blot方法檢測各組rBMSCs的縫隙連接蛋白43(Cx43)的表達。本實驗結果表明,不同持續加力時間的力學應變組的GATA4、MEF-2C的mRNA表達量以及Cx43的蛋白表達量比相應的空白對照組明顯增高(P＜0.05)。本研究提示,體外周期性雙軸力學應變可以促進rBMSCs向心肌樣細胞分化,但其具體機制尚未明確。
引用本文： 況薇, 唐敏, 何學令, 吳文超, 劉小菁, 李良. 周期性拉伸應變對大鼠骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞分化的影響. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(3): 596-600. doi: 10.7507/1001-5515.20140112 復制
引言
骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)存在于骨髓基質，是一類具有多向分化潛能的干細胞,在特定的條件下,可以分化為多種細胞系,如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、肌細胞、內皮細胞、神經細胞等[1-2]。實驗室數據和最近的臨床試驗表明,干細胞療法可以改善心臟功能和促進心肌再生[3]。由于心臟的持續搏動，心肌細胞一直處于力學環境中，力學刺激在心肌細胞的生長和成熟中扮演著重要的角色[4]。BMSCs是一種力學敏感性細胞，力學刺激對BMSCs的生長、分化也起著重要的作用[5]。本研究旨在探討體外周期性雙軸拉伸應變對大鼠BMSCs(rat BMSCs,rBMSCs)向心肌樣細胞分化的影響， 為rBMSCs在體外向心肌樣細胞定向分化提供實驗依據。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要儀器和試劑
1.1.1 實驗動物
健康清潔雌性SpragueDawley大鼠(4~6周齡)，體重為100~150 g，由四川大學華西動物實驗中心提供。
1.1.2 主要儀器和試劑
CO2細胞培養孵箱(SANYO公司)，CFX96TM Real-time PCR System(BIO-RAD公司),DMEM低糖培養基干粉(DMEM-LG基礎培養基，Gibco公司),澳洲胎牛血清(FBS，Gibco公司)，Trizol Reagent(Invitrogen公司)，逆轉錄聚合酶鏈反應試劑盒(IScriptTM cDNA Synthesis Kit,BIO-RAD公司)，實時熒光定量PCR試劑盒(SsoFastTM EvaGreen@Supermix,BIO-RAD公司)，雙抗(Penicillin-Streptomycin Solution,Hyclone公司)，縫隙連接蛋白43(connexin 43,Cx43)抗體(Santa公司),辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠抗體(中杉金橋公司)。DMEM-LG完全培養基：DMEM-LG基礎培養基+15%胎牛血清+1%雙抗。
1.1.3 力學加載裝置
本實驗采用我們實驗室(四川大學)自制的周期性雙軸拉伸應變加載的細胞培養裝置，示意圖如圖 1。
圖1
加載周期性雙軸力學應變的細胞培養裝置示意圖
Figure1.
Schematic diagram of biaxial strain device for cultured cells
1.2 rBMSCs的分離與培養
我們采用的本實驗室常規全骨髓貼壁法分離rBMSCs[6]。首先采用斷頸法把實驗用SD大鼠處死，在無菌條件下迅速分離出股骨和脛骨。然后用組織剪將附著在骨上的軟組織、筋膜和骨膜剔除干凈，放于75%乙醇浸泡消毒。將骨置于盛有PBS的培養皿中漂洗，漂洗后去除兩端骨骺，用10 mL注射器吸取10 mL的DMEM-LG基礎培養基,針尖插入骨骺端，沖出腔內骨髓，直至發白。含有骨髓的培養基用15 mL離心管收集，再以900 r/min離心5 min。用吸管輕輕吸取棄掉上清，再加入DMEM-LG完全培養基。小心用吸管將沉底細胞吹散。細胞懸液用細胞計數板計數后按3×105/cm2的細胞密度接種于25 cm2培養瓶中，將培養瓶放置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養孵箱中培養。細胞的首次換液在接種后3 h，棄掉懸浮細胞，換液時小心吸液和加液，以后的72 h內每8 h換液一次。第4 d起，每3 d給細胞換液1 次。當細胞長到80%左右的融合狀態時，用0.25%胰蛋白酶消化已貼壁細胞進行傳代。本實驗選用的是2~3代rBMSCs。接種前對細胞進行臺盼藍細胞活力計數，細胞活力均在98%以上。
1.3 實驗分組
rBMSCs隨機分為三組，分別為拉伸應變組、空白對照組和基底對照組。
1.3.1 拉伸應變組
將rBMSCs以3×104/cm2接種于硅膠膜上，DMEM-LG完全培養基培養，待完全貼膜、細胞長至融合狀態后，利用本實驗室周期性雙軸力學應變加載的細胞培養裝置進行加載，應變幅度大小為10%，加載頻率為1 Hz，分別持續加載6、12、24 h的拉伸應變，加載后收取樣本。
1.3.2 空白對照組
將rBMSCs以3×104/cm2接種于硅膠膜上，DMEM-LG完全培養基培養，細胞完全貼膜、長至融合狀態時作為實驗開始時間，對rBMSCs不進行任何處理，分別在6、12、24 h后收取樣本(取樣時間與力學應變組相同)。
1.3.3 基底對照組
將rBMSCs以3×104/cm2接種于六孔板，DMEM-LG完全培養基培養，細胞完全貼壁、長至融合狀態時作為實驗開始時間，對rBMSCs不進行任何處理，分別在6、12、24 h后收取樣本(取樣時間與力學應變組相同)。
1.4 檢測指標
1.4.1 實時定量PCR法測定各組中GATA4、肌細胞特異性增強因子-2C(myocyte-specific enhancer factor,MEF-2C)的mRNA表達
依據Invitrogen公司提供的Trizol Reagent試劑說明書，分別在相對應的時間點提取各組rBMSCs的總mRNA。將提取的總mRNA利用1%瓊脂糖凝膠電泳的方法，檢測各組mRNA的完整性。判定各組mRNA的純度，則用紫外分光光度計檢測A260與A280的比值，然后計算出mRNA濃度。每組樣品取1.5 μg的總mRNA來逆轉錄生成cDNA，根據濃度算出所需體積。依據BIO-RAD公司所提供的逆轉錄試劑盒使用說明書依次加入反應液及樣本mRNA到EP管中。將EP管放入PCR儀中，設定逆轉錄反應程序參數，25 ℃ 5 min,42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，進行逆轉錄。生成的cDNA取1 μL作為模板進行實時熒光定量PCR，根據SsoFastTMEvaGreen@Supermix試劑盒說明書進行操作，反應體系10 μL。熒光定量PCR的反應參數：95 ℃變性10 s，59 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，總共40 個循環。與此同時做溶解曲線分析。目的基因相對表達量通過內參基因表達量的校正，即用目的基因的測量值與內參GAPDH測量值的比值表示。內參GAPDH mRNA、GATA4 mRNA和MEF-2C mRNA的實時熒光定量PCR的引物序列如表 1所示。
表1
GAPDH mRNA、GATA4 mRNA、MEF-2C mRNA的實時熒光定量PCR的引物序列
Table1.
Primer sequences of the real-time PCR for GAPDH mRNA,GATA4 mRNA and MEF-2C mRNA
1.4.2 蛋白免疫印記實驗(Western blot)檢測Cx43的蛋白表達
在相對應的取樣時間點，分別棄掉力學應變組、空白對照組和基底對照組的細胞培養液，用4 ℃預冷的PBS漂洗細胞3次，再加入適量RIPA蛋白裂解液，用細胞刮子刮下細胞，將含有細胞碎片的裂解液移至EP管中，在冰上裂解30 min，然后以12 000 r/min在4 ℃下離心8 min，小心吸取上清到新的EP管。利用BCA試劑盒對各組的總蛋白進行定量，檢測蛋白樣品濃度后，與適量的5× Loading buffer混勻煮沸變性8 min，－20 ℃保存待用。取30 μg蛋白質樣品加入上樣孔，經10% SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白轉移至PVDF膜上，含5%脫脂奶粉封閉液于37 ℃封閉2 h。分別加入1∶200的內參β-actin和1∶200的Cx43抗體的一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜。第2天用TBST漂洗3次，分別加入1∶5 000的辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗的稀釋液，37 ℃孵育2~3 h。再用TBST清洗3次，加入ECL顯色液后，利用凝膠成像儀掃描檢測蛋白條帶。電泳條帶的灰度值用Image Lab軟件進行分析。
1.5 統計學分析
本實驗均重復3次，所有數據均用統計軟件SPSS 17.0處理。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行組間差別比較，組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls(SNK)方法。每組數據以均數±標準差(
2 結果
2.1 GATA4 mRNA的表達
如圖 2所示，空白對照組與基底對照組各時間點rBMSCs的GATA4 mRNA表達量均無差異(P＞0.05)。加力持續時間6、12和24 h的拉伸應變組rBMSCs的GATA4 mRNA的表達量分別是相應空白對照組的2.54、2.43和3.94倍(P＜0.05)。
圖2
各組rBMSCs的GATA4 mRNA、MEF-2C mRNA的相對表達量(*：與相應的空白對照組比較，
*:
2.2 MEF-2C mRNA的表達
如圖 2所示，空白對照組與基底對照組各時間點rBMSCs的MEF-2C mRNA表達量均無明顯差異(P＞0.05)。加力持續時間6、12和24 h的拉伸應變組rBMSCs的MEF-2C mRNA表達量分別是相應空白對照組的2.57、4.22和5.55倍(P＜0.05)。各拉伸應變組間比較，加力持續時間24 h組rBMSCs的MEF-2C mRNA表達最為明顯，與6 h和12 h組之間差異有統計學意義(P＜0.05)。
圖3
各組rBMSCs的Cx43蛋白電泳條帶及其相對表達量(M:力學應變組；C:空白對照組；B:基底對照組。*：與相對應的空白對照組相比，
M: the mechanical strain groups; C:the control groups; B:the blank groups. *: P＜
2.3 Cx43的蛋白表達量
如圖 3所示，加力持續時間6、12和24 h的力學應變組rBMSCs的Cx43蛋白表達量分別為相應空白對照組的1.79、1.91和2.04倍(P＜0.05)；加力12 h和24 h組與6 h組之間比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。
3 討論
以心肌血供減少為特征的缺血性心臟病已經成為世界上主要的死亡原因，當它病程遷延，最終將發展成為心力衰竭[1-2]。治療缺血性心臟病以及心力衰竭除了用藥對癥治療、心臟移植之外，通過干細胞的植入實現心肌再生已經成為一種新的治療策略。而植入心肌內進行再生治療的干細胞有很多種，例如胚胎干細胞[7]、BMSCs[8]、脂肪間充質干細胞[9]等。
目前已有促BMSCs向心肌樣細胞分化的方法，例如將rBMSCs與新生大鼠心室肌細胞共同培養，發現部分rBMSCs有心肌特異性蛋白TNNT2的陽性表達[10]；而化學試劑5-氮胞苷的處理也使BMSCs成功地表達了心肌相關的特異性基因[11]。但是，這些方法效率都不高，所以科學研究者正在努力尋求新的誘導方法來促BMSCs向心肌樣細胞分化。
心臟作為機體的“泵”，是重要的動力器官，處于不斷搏動的狀態，所以心肌細胞時刻處于一個力、電、生物化學的微環境中。力學刺激對細胞的生長、增殖、分化等生物學行為有著重要的影響，BMSCs的分化也不例外。迄今為止，國內外就力學刺激促BMSCs向心肌細胞分化影響的相關報道還較少。Schmelter等[12]的實驗表明小鼠胚胎干細胞源性的類胚體在經過2 h應變大小為10%的靜態力學應變后，心肌特異性標志物α-actinin的表達量增加。Illi等[13]的研究發現經過10 dyn/cm2流體剪切應力處理培養的小鼠胚胎干細胞，其心肌相關基因MEF-2C的表達上調，預示了流體剪切力可能應用于體外促干細胞向心肌細胞分化。本實驗室的前期實驗也證明，利用低頻脈沖電磁場以及雙向脈沖電刺激能促rBMSCs向心肌樣細胞分化[6, 14]。本實驗想通過另外一些物理刺激手段比如力學刺激來誘導rBMSCs向心肌樣細胞分化，進一步完善在體外促rBMSCs向心肌樣細胞分化的實驗誘導條件。
心肌早期發育的重要轉錄因子GATA4是一類具有鋅指結構的轉錄因子，它是調節胚胎心臟發生和誘導心肌分化的重要基因之一。MEF-2C參與了心臟形態發生、肌細胞生成和血管的發展。Cx43是心肌細胞間閏盤的組成蛋白之一，在促進心肌細胞同步收縮以及細胞間信號傳遞過程中起著重要作用。所以本實驗選取這三種指標來反映rBMSCs向心肌樣細胞分化的情況。
對于心肌細胞來說,雙軸牽拉應變可以更好地模擬心臟搏動的生理情況下心肌細胞的受力變化，與體內心肌受到的機械載荷比較相似。目前多數研究認為,應變大小為10%左右的拉伸應變對于心肌細胞屬于正性刺激，而頻率1 Hz與平常心臟跳動的節奏類似。Huang等[15]發現在頻率為1 Hz、 應變大小為10%的單軸拉伸力學應變下，BMSCs心肌細胞特異性基因Nkx2.5表達明顯增高。本實驗所用力學應變加載裝置是周期性雙軸力學牽拉應變的細胞培養裝置，能很好地模擬心臟搏動時細胞所受的力學刺激。我們采用應變幅度為10%、頻率為1 Hz的雙軸周期性拉伸應變，持續加載時間分別為6、12和24 h。實驗結果顯示，力學應變加載后其心肌特異性基因GATA4和MEF-2C的表達明顯高于相應的對照組(P＜0.05)，其中MEF-2C的相對表達量在加力持續時間24 h組增高最為明顯；力學應變加載后力學應變組Cx43蛋白表達量明顯高于相應對照組，而且加載持續時間12 h和24 h組Cx43蛋白較6 h組明顯增高。本實驗得出結論：在體外周期性雙軸力學應變能促進rBMSCs向心肌樣細胞分化，而比較好的加載參數為力學應變幅度大小10%、加載頻率1 Hz和持續加載時間24 h，但是力學應變促其分化的機制尚不明確，與其他如電、生化等相關誘導因素聯合作用的效應也還未知，有待我們進一步研究。
引言
骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)存在于骨髓基質，是一類具有多向分化潛能的干細胞,在特定的條件下,可以分化為多種細胞系,如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、肌細胞、內皮細胞、神經細胞等[1-2]。實驗室數據和最近的臨床試驗表明,干細胞療法可以改善心臟功能和促進心肌再生[3]。由于心臟的持續搏動，心肌細胞一直處于力學環境中，力學刺激在心肌細胞的生長和成熟中扮演著重要的角色[4]。BMSCs是一種力學敏感性細胞，力學刺激對BMSCs的生長、分化也起著重要的作用[5]。本研究旨在探討體外周期性雙軸拉伸應變對大鼠BMSCs(rat BMSCs,rBMSCs)向心肌樣細胞分化的影響， 為rBMSCs在體外向心肌樣細胞定向分化提供實驗依據。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要儀器和試劑
1.1.1 實驗動物
健康清潔雌性SpragueDawley大鼠(4~6周齡)，體重為100~150 g，由四川大學華西動物實驗中心提供。
1.1.2 主要儀器和試劑
CO2細胞培養孵箱(SANYO公司)，CFX96TM Real-time PCR System(BIO-RAD公司),DMEM低糖培養基干粉(DMEM-LG基礎培養基，Gibco公司),澳洲胎牛血清(FBS，Gibco公司)，Trizol Reagent(Invitrogen公司)，逆轉錄聚合酶鏈反應試劑盒(IScriptTM cDNA Synthesis Kit,BIO-RAD公司)，實時熒光定量PCR試劑盒(SsoFastTM EvaGreen@Supermix,BIO-RAD公司)，雙抗(Penicillin-Streptomycin Solution,Hyclone公司)，縫隙連接蛋白43(connexin 43,Cx43)抗體(Santa公司),辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠抗體(中杉金橋公司)。DMEM-LG完全培養基：DMEM-LG基礎培養基+15%胎牛血清+1%雙抗。
1.1.3 力學加載裝置
本實驗采用我們實驗室(四川大學)自制的周期性雙軸拉伸應變加載的細胞培養裝置，示意圖如圖 1。
圖1
加載周期性雙軸力學應變的細胞培養裝置示意圖
Figure1.
Schematic diagram of biaxial strain device for cultured cells
1.2 rBMSCs的分離與培養
我們采用的本實驗室常規全骨髓貼壁法分離rBMSCs[6]。首先采用斷頸法把實驗用SD大鼠處死，在無菌條件下迅速分離出股骨和脛骨。然后用組織剪將附著在骨上的軟組織、筋膜和骨膜剔除干凈，放于75%乙醇浸泡消毒。將骨置于盛有PBS的培養皿中漂洗，漂洗后去除兩端骨骺，用10 mL注射器吸取10 mL的DMEM-LG基礎培養基,針尖插入骨骺端，沖出腔內骨髓，直至發白。含有骨髓的培養基用15 mL離心管收集，再以900 r/min離心5 min。用吸管輕輕吸取棄掉上清，再加入DMEM-LG完全培養基。小心用吸管將沉底細胞吹散。細胞懸液用細胞計數板計數后按3×105/cm2的細胞密度接種于25 cm2培養瓶中，將培養瓶放置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養孵箱中培養。細胞的首次換液在接種后3 h，棄掉懸浮細胞，換液時小心吸液和加液，以后的72 h內每8 h換液一次。第4 d起，每3 d給細胞換液1 次。當細胞長到80%左右的融合狀態時，用0.25%胰蛋白酶消化已貼壁細胞進行傳代。本實驗選用的是2~3代rBMSCs。接種前對細胞進行臺盼藍細胞活力計數，細胞活力均在98%以上。
1.3 實驗分組
rBMSCs隨機分為三組，分別為拉伸應變組、空白對照組和基底對照組。
1.3.1 拉伸應變組
將rBMSCs以3×104/cm2接種于硅膠膜上，DMEM-LG完全培養基培養，待完全貼膜、細胞長至融合狀態后，利用本實驗室周期性雙軸力學應變加載的細胞培養裝置進行加載，應變幅度大小為10%，加載頻率為1 Hz，分別持續加載6、12、24 h的拉伸應變，加載后收取樣本。
1.3.2 空白對照組
將rBMSCs以3×104/cm2接種于硅膠膜上，DMEM-LG完全培養基培養，細胞完全貼膜、長至融合狀態時作為實驗開始時間，對rBMSCs不進行任何處理，分別在6、12、24 h后收取樣本(取樣時間與力學應變組相同)。
1.3.3 基底對照組
將rBMSCs以3×104/cm2接種于六孔板，DMEM-LG完全培養基培養，細胞完全貼壁、長至融合狀態時作為實驗開始時間，對rBMSCs不進行任何處理，分別在6、12、24 h后收取樣本(取樣時間與力學應變組相同)。
1.4 檢測指標
1.4.1 實時定量PCR法測定各組中GATA4、肌細胞特異性增強因子-2C(myocyte-specific enhancer factor,MEF-2C)的mRNA表達
依據Invitrogen公司提供的Trizol Reagent試劑說明書，分別在相對應的時間點提取各組rBMSCs的總mRNA。將提取的總mRNA利用1%瓊脂糖凝膠電泳的方法，檢測各組mRNA的完整性。判定各組mRNA的純度，則用紫外分光光度計檢測A260與A280的比值，然后計算出mRNA濃度。每組樣品取1.5 μg的總mRNA來逆轉錄生成cDNA，根據濃度算出所需體積。依據BIO-RAD公司所提供的逆轉錄試劑盒使用說明書依次加入反應液及樣本mRNA到EP管中。將EP管放入PCR儀中，設定逆轉錄反應程序參數，25 ℃ 5 min,42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，進行逆轉錄。生成的cDNA取1 μL作為模板進行實時熒光定量PCR，根據SsoFastTMEvaGreen@Supermix試劑盒說明書進行操作，反應體系10 μL。熒光定量PCR的反應參數：95 ℃變性10 s，59 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，總共40 個循環。與此同時做溶解曲線分析。目的基因相對表達量通過內參基因表達量的校正，即用目的基因的測量值與內參GAPDH測量值的比值表示。內參GAPDH mRNA、GATA4 mRNA和MEF-2C mRNA的實時熒光定量PCR的引物序列如表 1所示。
表1
GAPDH mRNA、GATA4 mRNA、MEF-2C mRNA的實時熒光定量PCR的引物序列
Table1.
Primer sequences of the real-time PCR for GAPDH mRNA,GATA4 mRNA and MEF-2C mRNA
1.4.2 蛋白免疫印記實驗(Western blot)檢測Cx43的蛋白表達
在相對應的取樣時間點，分別棄掉力學應變組、空白對照組和基底對照組的細胞培養液，用4 ℃預冷的PBS漂洗細胞3次，再加入適量RIPA蛋白裂解液，用細胞刮子刮下細胞，將含有細胞碎片的裂解液移至EP管中，在冰上裂解30 min，然后以12 000 r/min在4 ℃下離心8 min，小心吸取上清到新的EP管。利用BCA試劑盒對各組的總蛋白進行定量，檢測蛋白樣品濃度后，與適量的5× Loading buffer混勻煮沸變性8 min，－20 ℃保存待用。取30 μg蛋白質樣品加入上樣孔，經10% SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白轉移至PVDF膜上，含5%脫脂奶粉封閉液于37 ℃封閉2 h。分別加入1∶200的內參β-actin和1∶200的Cx43抗體的一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜。第2天用TBST漂洗3次，分別加入1∶5 000的辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗的稀釋液，37 ℃孵育2~3 h。再用TBST清洗3次，加入ECL顯色液后，利用凝膠成像儀掃描檢測蛋白條帶。電泳條帶的灰度值用Image Lab軟件進行分析。
1.5 統計學分析
本實驗均重復3次，所有數據均用統計軟件SPSS 17.0處理。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行組間差別比較，組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls(SNK)方法。每組數據以均數±標準差(
2 結果
2.1 GATA4 mRNA的表達
如圖 2所示，空白對照組與基底對照組各時間點rBMSCs的GATA4 mRNA表達量均無差異(P＞0.05)。加力持續時間6、12和24 h的拉伸應變組rBMSCs的GATA4 mRNA的表達量分別是相應空白對照組的2.54、2.43和3.94倍(P＜0.05)。
圖2
各組rBMSCs的GATA4 mRNA、MEF-2C mRNA的相對表達量(*：與相應的空白對照組比較，
*:
2.2 MEF-2C mRNA的表達
如圖 2所示，空白對照組與基底對照組各時間點rBMSCs的MEF-2C mRNA表達量均無明顯差異(P＞0.05)。加力持續時間6、12和24 h的拉伸應變組rBMSCs的MEF-2C mRNA表達量分別是相應空白對照組的2.57、4.22和5.55倍(P＜0.05)。各拉伸應變組間比較，加力持續時間24 h組rBMSCs的MEF-2C mRNA表達最為明顯，與6 h和12 h組之間差異有統計學意義(P＜0.05)。
圖3
各組rBMSCs的Cx43蛋白電泳條帶及其相對表達量(M:力學應變組；C:空白對照組；B:基底對照組。*：與相對應的空白對照組相比，
M: the mechanical strain groups; C:the control groups; B:the blank groups. *: P＜
2.3 Cx43的蛋白表達量
如圖 3所示，加力持續時間6、12和24 h的力學應變組rBMSCs的Cx43蛋白表達量分別為相應空白對照組的1.79、1.91和2.04倍(P＜0.05)；加力12 h和24 h組與6 h組之間比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。
3 討論
以心肌血供減少為特征的缺血性心臟病已經成為世界上主要的死亡原因，當它病程遷延，最終將發展成為心力衰竭[1-2]。治療缺血性心臟病以及心力衰竭除了用藥對癥治療、心臟移植之外，通過干細胞的植入實現心肌再生已經成為一種新的治療策略。而植入心肌內進行再生治療的干細胞有很多種，例如胚胎干細胞[7]、BMSCs[8]、脂肪間充質干細胞[9]等。
目前已有促BMSCs向心肌樣細胞分化的方法，例如將rBMSCs與新生大鼠心室肌細胞共同培養，發現部分rBMSCs有心肌特異性蛋白TNNT2的陽性表達[10]；而化學試劑5-氮胞苷的處理也使BMSCs成功地表達了心肌相關的特異性基因[11]。但是，這些方法效率都不高，所以科學研究者正在努力尋求新的誘導方法來促BMSCs向心肌樣細胞分化。
心臟作為機體的“泵”，是重要的動力器官，處于不斷搏動的狀態，所以心肌細胞時刻處于一個力、電、生物化學的微環境中。力學刺激對細胞的生長、增殖、分化等生物學行為有著重要的影響，BMSCs的分化也不例外。迄今為止，國內外就力學刺激促BMSCs向心肌細胞分化影響的相關報道還較少。Schmelter等[12]的實驗表明小鼠胚胎干細胞源性的類胚體在經過2 h應變大小為10%的靜態力學應變后，心肌特異性標志物α-actinin的表達量增加。Illi等[13]的研究發現經過10 dyn/cm2流體剪切應力處理培養的小鼠胚胎干細胞，其心肌相關基因MEF-2C的表達上調，預示了流體剪切力可能應用于體外促干細胞向心肌細胞分化。本實驗室的前期實驗也證明，利用低頻脈沖電磁場以及雙向脈沖電刺激能促rBMSCs向心肌樣細胞分化[6, 14]。本實驗想通過另外一些物理刺激手段比如力學刺激來誘導rBMSCs向心肌樣細胞分化，進一步完善在體外促rBMSCs向心肌樣細胞分化的實驗誘導條件。
心肌早期發育的重要轉錄因子GATA4是一類具有鋅指結構的轉錄因子，它是調節胚胎心臟發生和誘導心肌分化的重要基因之一。MEF-2C參與了心臟形態發生、肌細胞生成和血管的發展。Cx43是心肌細胞間閏盤的組成蛋白之一，在促進心肌細胞同步收縮以及細胞間信號傳遞過程中起著重要作用。所以本實驗選取這三種指標來反映rBMSCs向心肌樣細胞分化的情況。
對于心肌細胞來說,雙軸牽拉應變可以更好地模擬心臟搏動的生理情況下心肌細胞的受力變化，與體內心肌受到的機械載荷比較相似。目前多數研究認為,應變大小為10%左右的拉伸應變對于心肌細胞屬于正性刺激，而頻率1 Hz與平常心臟跳動的節奏類似。Huang等[15]發現在頻率為1 Hz、 應變大小為10%的單軸拉伸力學應變下，BMSCs心肌細胞特異性基因Nkx2.5表達明顯增高。本實驗所用力學應變加載裝置是周期性雙軸力學牽拉應變的細胞培養裝置，能很好地模擬心臟搏動時細胞所受的力學刺激。我們采用應變幅度為10%、頻率為1 Hz的雙軸周期性拉伸應變，持續加載時間分別為6、12和24 h。實驗結果顯示，力學應變加載后其心肌特異性基因GATA4和MEF-2C的表達明顯高于相應的對照組(P＜0.05)，其中MEF-2C的相對表達量在加力持續時間24 h組增高最為明顯；力學應變加載后力學應變組Cx43蛋白表達量明顯高于相應對照組，而且加載持續時間12 h和24 h組Cx43蛋白較6 h組明顯增高。本實驗得出結論：在體外周期性雙軸力學應變能促進rBMSCs向心肌樣細胞分化，而比較好的加載參數為力學應變幅度大小10%、加載頻率1 Hz和持續加載時間24 h，但是力學應變促其分化的機制尚不明確，與其他如電、生化等相關誘導因素聯合作用的效應也還未知，有待我們進一步研究。
