隨著組織工程學的興起,多種形態的絲素蛋白(SF)支架已用于各種細胞組織構建的研究,這使得其成為近年來的研究熱點。本文主要介紹了SF的來源、結構、支架的制備方法及該支架用于骨、軟骨、皮膚、血管、神經等組織構建的應用進展,展望了SF支架日后的發展方向,為后續的研究提供參考依據。
引用本文： 殷麗華, 王琳, 余占海. 絲素蛋白構建組織工程支架材料的應用進展. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(2): 467-471. doi: 10.7507/1001-5515.20140086 復制
引言
組織工程學(tissue engineering)是由美國國家科學基金委員會于1987年正式提出和確定的,是指在組織缺損的部位植入載有本體細胞或生長因子和機體可降解吸收的材料,在材料逐漸被體內吸收的同時,細胞增殖，新組織形成,從而達到修復組織缺損和重建功能的目的[1]。隨著組織工程學的飛速發展，其核心技術逐漸成為建立由種子細胞、生物支架材料及相關生長因子構成的三維空間復合體[2]。其中，生物支架材料為種子細胞的生長、繁殖、新陳代謝及新組織的形成提供了基礎，具有關鍵性的作用。絲素蛋白(silk fibroin，SF)作為一種理想的支架材料，近年來倍受專家學者的青睞。本文就SF的來源、結構特點及其構建組織工程支架方面的應用進展作一綜述。
1 SF的來源
節肢動物中的蜘蛛、蝎子、螨蟲和鱗翅目中的蠶蛾科、蓑蛾科、蒼蠅、蝶等昆蟲，以及海洋生物中的部分軟體動物都能夠通過腺體分泌絲蛋白，這其中人們研究最多的是蠶絲和蜘蛛絲[3]。蜘蛛絲是一種力學性能非常優越的天然纖維，拉伸斷裂強度是同直徑鋼材的2倍，彈性極佳，可以延伸到原長的10倍，具有良好的生物相容性，但蜘蛛為獨居性肉食動物，不適合大規模家養，并且每只蜘蛛每年所產的牽引絲極少，實現廣泛應用仍十分困難[4]。而桑蠶是人類最早馴化飼養的昆蟲，蠶絲早在一百多年前就被作為手術縫合線用于臨床，是目前產量最大的天然纖維蛋白之一,故本文主要介紹蠶絲SF。
2 SF的結構和性能
天然蠶絲是由絲膠和絲素兩部分構成，各部分比例為20%~30%和70%~80%。在應用過程中，學者們發現絲膠蛋白(silk sericin)具有疏水性，并且是一種潛在的致敏原，容易引起過敏反應[5]。而SF是一種無生理活性的天然結構性蛋白，基本構象為α-螺旋、β-折疊和無規則卷曲以及大量蛋白重復序列，這些高度重復序列是由甘氨酸、丙氨酸短側鏈氨基酸和帶電長側鏈組氨酸組成的,使得SF具有良好化學穩定性[6]。基于螺旋和折疊結構，SF相比膠原、殼聚糖等其他材料而言有更優良的力度和韌度，甚至優于肌腱和骨[7]。已有大量研究證實，SF對機體細胞的黏附能力強[8]，有緩慢的降解性[9-10]，以及良好的氧氣滲透性[11]。因此，通過將SF單獨或聯合其他生物材料制成膜、水凝膠、海綿體或無紡布等多種形態后，可在醫學領域中得到廣泛的應用(見表 1)。
表1
絲素蛋白應用形式及優缺點
Table1.
Application areas and advantages and disadvantages of silk fibroin
3 SF組織工程支架材料的制備方法
SF支架三維空間復合結構主要由制備方法決定。大多數文獻報道用5 g/L Na2CO3溶液[25]或9 mol/L LiBr[26] 溶液等在一定溫度下可以溶解絲素纖維，再經過透析、濃縮等可以得到高純度的、較為穩定的SF水溶液。目前，將高純度SF溶液制備成多孔絲素支架材料的方法主要包括：冷凍干燥法、鹽析致孔法、氣體發泡致孔法、靜電紡絲技術等。
(1) 冷凍干燥法[27]：在SF水溶液中添加一些凝固劑，如乙醇、二縮水甘油醚等，將其制成凝膠狀，放入冷凍干燥機中進行冷凍，其中的溶劑由于發生汽化而與SF分離，利用冰晶可得到孔隙率較高的支架。
(2) 鹽析致孔法[28]：在高純度的SF溶液中，加入一定量的致孔劑NaCl顆粒，使其均勻地分散在溶液中。待SF凝結后，用甲醇或乙醇進行不溶化處理，使蛋白構象轉變成β-折疊，再用水浸泡將NaCl除去，其所占的空間變成孔隙，便可制得多孔支架。
(3) 氣體發泡致孔法[29]：將CO2和NH3用高壓法壓入SF水溶液中，直至溶液飽和，然后恢復到常壓狀態，CO2和NH3會逐漸變大、揮發產生孔狀結構。此法制備的支架材料有較高的彈性模量和強度。此外，相比其他方法而言，孔隙之間具有更好的貫通性。
(4) 靜電紡絲技術[30-33]：將高純度的SF溶解干燥后制成無定形結構為主的再生SF膜，然后溶解在六氟異丙醇、甲酸等溶劑中進行靜電紡絲，最后溶劑揮發，收集板收集到無紡布式無序的納米纖維。該工藝已經較為成熟，制備出的納米纖維其直徑與天然細胞外基質(extracellular matrix,ECM)結構更加相近，能夠較好地仿生人體內ECM環境。
4 SF支架材料在組織工程中的應用
4.1 骨組織工程
臨床上骨損傷和骨缺損很常見，近年來，骨科領域應用的替代物包括金屬和有機高分子等材料，但在生物相容性和力學性能方面都不夠理想。而SF則以其各方面良好的性能受到了廣大研究者的關注[34]。 Meinel 等[35]首次將SF水溶液制作成三維多孔支架用于骨組織工程研究，并將人體間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)植于支架上，然后再植入鼠頭蓋骨創傷模型上，觀察5周后發現能誘導骨形成，說明SF可用于骨重建和再生，并表現出較好的機械穩定性和持久性。Park 等[36]利用SF溶液通過靜電紡絲技術制作納米級三維多孔支架，直徑為6 mm，壁厚為1.5 mm，植入成骨細胞，經過DNA計數和四甲基偶氮唑鹽比色法 (MTT)，分析細胞的增殖和新陳代謝能力，細胞生長良好，把支架移植入骨損傷的小鼠體內，7 d后，小鼠的骨完全恢復。說明了SF和電紡技術在骨組織工程研究和應用上是有潛力的。Rockwood等[37]將SF顆粒與hMSC基質在體外以質量比為2∶1培養后，觀察到隨著SF顆粒的增加，hMSC的骨化能力增強，說明了適度增加SF支架的強度可以促進新骨的形成。Correia等[38]將SF溶解于六氟異丙醇溶液中制成三維多孔支架，與人體脂肪干細胞(human adipose stem cells，hASCs)復合培養7周后，植入骨損傷的小鼠體內，觀察發現堿性磷酸酶、骨橋蛋白、骨涎蛋白及Ⅰ型膠原蛋白表達上調。
4.2 軟骨組織工程
軟骨自我修復能力差，基質的更新速度較為緩慢，再加上缺乏血供系統，往往在外傷性或老年退變性嚴重軟骨損傷后難以再生。臨床上大多患者治療軟骨損傷局限于功能的恢復，療效有限。而三維多孔SF支架有利于軟骨細胞的黏附促進其再生。Cheon等[39]將SF和羊毛角質成分(wool keratose，WK)用鹽析致孔法處理后再進行靜電紡絲處理，初步得到三維多孔支架，與膝關節軟骨細胞復合培養，電子顯微鏡下觀察發現該支架有利于細胞的黏附和增殖，并能促進葡糖胺聚糖等ECM的分泌。Kambe等[40]的研究顯示，轉基因蠶產生的轉基因SF支架不僅可以促進軟骨細胞黏附，還不改變軟骨細胞的基因型，且可促進軟骨再生。
4.3 皮膚組織工程
皮膚組織工程支架材料的要求是在最短的時間內生長出永久覆蓋性的假體皮膚，使用具SF為材料制備的納米纖維多孔支架，并植入種子細胞來再生更接近于實體皮膚的“人造皮膚”，受到了眾多學者的青睞。Jeong 等[41]用氧氣和甲烷對SF支架表面進行改性，并與人表皮角質細胞共同培養，數小時后，細胞黏附率很高，并且增殖和遷移態勢良好，可見這樣的支架適合皮膚的再生。Guan等[42]將冷凍干燥法制備的多孔SF支架植入大鼠皮膚中，同時將聚乙烯醇海綿支架也植入大鼠皮膚中作為對照組，進行膠原基質沉積、皮膚再生、炎性細胞浸潤等三個方面的對比，觀察到膠原基質在SF支架中比聚乙烯醇支架中沉積得更早更快，且炎性細胞浸潤少，新生皮膚組織生長更快，說明SF支架在皮膚再生中可發揮一定的潛能。Bhardwaj等[43]將SF用冷凍凝膠技術制備成三維多孔支架，用掃描電鏡觀察孔隙大小為60~110 nm，力學性能測試表明支架抗壓強度為20~40 kPa，與人表皮角質細胞共同培養5 d 后，細胞表現出良好的增殖活力。
4.4 人工血管組織工程
目前，臨床上所使用的人工血管各有優勢，但最大的不足在于大多數不具有生物降解性，或是降解后的產物會引起受體的炎癥反應。隨著研究的不斷深入，SF用于構建組織工程血管有較好的前景[44]。 Zhang 等[45]將SF水溶液進行電紡，然后植入髖動脈內皮細胞培養24 h，電鏡圖顯示，髖動脈內皮細胞在支架上黏附與增殖良好，7 d以后，髖動脈內皮細胞爬滿整個支架，形成了一個內皮組織層，這證明了SF與血管內皮細胞具有良好的相容性，是制備人工血管的優質基質材料之一。Soffer 等[46]利用SF和聚氧乙烯作電紡液，利用靜電紡絲技術制備了內徑為0.15 mm、彈性模量為(2.45±0.47) MPa、抗張強度為(2.42±0.48) MPa、平均爆破壓為811 mm Hg 的血管支架，約為上限病理值(180~220 mm Hg)的4倍，表明該支架理論上具有適宜血管移植的良好機械性能和抵抗血流沖擊的潛能。
4.5 神經組織工程
修復由于外傷、疾病等造成的不規則神經創傷是當今醫學的一大難題，現臨床多采用自體神經移植和手術直接吻合的方法，但效果均不理想，亦存在著來源受限、免疫排斥等問題。SF材料已用于骨、軟骨、皮膚、血管等組織工程，為了證明SF可用于神經再生，Tang等[47]的實驗研究證實了SF在中樞神經系統中的生物相容性，觀察到海馬神經元細胞可在SF支架中較好地生長，細胞增殖活躍。Tang等[48]在進一步的實驗中，把SF制作成神經導管后，與雪旺細胞、背根神經節細胞及生長因子共同復合培養4周，再將其植入大鼠約10 mm長的缺損坐骨神經中，12周后進行組織學及功能評價，發現SF神經導管顯著增加了神經軸突的生長，上調了神經鈣粘素和PMP22的表達，有助于早期神經再生。
5 展望
SF因其良好的生物相容性、穩定的化學性能、優良的力學性能、可降解性等，在組織工程中的應用越來越廣泛。尤其是SF構建的三維多孔支架為各種類型細胞的黏附、增殖、分化提供了良好的ECM環境。但目前SF離臨床應用還有一段距離，例如：① 如何精確調控SF支架孔徑的大小，以適應各種類型細胞增殖、分化、遷移的需要；② 如何精確載入生長因子等生物信號分子，并調控其釋放速度、活性保持時間等；③ 能否使SF的降解速率和組織生成速率協調一致，這可能是絲素材料應用成功的關鍵，也是后續研究的熱點之一；④ 現階段SF的研究僅限于動物實驗，并不一定適用于人體。總之，解決上述問題將成為未來SF組織工程支架材料重要的研究發展方向。
引言
組織工程學(tissue engineering)是由美國國家科學基金委員會于1987年正式提出和確定的,是指在組織缺損的部位植入載有本體細胞或生長因子和機體可降解吸收的材料,在材料逐漸被體內吸收的同時,細胞增殖，新組織形成,從而達到修復組織缺損和重建功能的目的[1]。隨著組織工程學的飛速發展，其核心技術逐漸成為建立由種子細胞、生物支架材料及相關生長因子構成的三維空間復合體[2]。其中，生物支架材料為種子細胞的生長、繁殖、新陳代謝及新組織的形成提供了基礎，具有關鍵性的作用。絲素蛋白(silk fibroin，SF)作為一種理想的支架材料，近年來倍受專家學者的青睞。本文就SF的來源、結構特點及其構建組織工程支架方面的應用進展作一綜述。
1 SF的來源
節肢動物中的蜘蛛、蝎子、螨蟲和鱗翅目中的蠶蛾科、蓑蛾科、蒼蠅、蝶等昆蟲，以及海洋生物中的部分軟體動物都能夠通過腺體分泌絲蛋白，這其中人們研究最多的是蠶絲和蜘蛛絲[3]。蜘蛛絲是一種力學性能非常優越的天然纖維，拉伸斷裂強度是同直徑鋼材的2倍，彈性極佳，可以延伸到原長的10倍，具有良好的生物相容性，但蜘蛛為獨居性肉食動物，不適合大規模家養，并且每只蜘蛛每年所產的牽引絲極少，實現廣泛應用仍十分困難[4]。而桑蠶是人類最早馴化飼養的昆蟲，蠶絲早在一百多年前就被作為手術縫合線用于臨床，是目前產量最大的天然纖維蛋白之一,故本文主要介紹蠶絲SF。
2 SF的結構和性能
天然蠶絲是由絲膠和絲素兩部分構成，各部分比例為20%~30%和70%~80%。在應用過程中，學者們發現絲膠蛋白(silk sericin)具有疏水性，并且是一種潛在的致敏原，容易引起過敏反應[5]。而SF是一種無生理活性的天然結構性蛋白，基本構象為α-螺旋、β-折疊和無規則卷曲以及大量蛋白重復序列，這些高度重復序列是由甘氨酸、丙氨酸短側鏈氨基酸和帶電長側鏈組氨酸組成的,使得SF具有良好化學穩定性[6]。基于螺旋和折疊結構，SF相比膠原、殼聚糖等其他材料而言有更優良的力度和韌度，甚至優于肌腱和骨[7]。已有大量研究證實，SF對機體細胞的黏附能力強[8]，有緩慢的降解性[9-10]，以及良好的氧氣滲透性[11]。因此，通過將SF單獨或聯合其他生物材料制成膜、水凝膠、海綿體或無紡布等多種形態后，可在醫學領域中得到廣泛的應用(見表 1)。
表1
絲素蛋白應用形式及優缺點
Table1.
Application areas and advantages and disadvantages of silk fibroin
3 SF組織工程支架材料的制備方法
SF支架三維空間復合結構主要由制備方法決定。大多數文獻報道用5 g/L Na2CO3溶液[25]或9 mol/L LiBr[26] 溶液等在一定溫度下可以溶解絲素纖維，再經過透析、濃縮等可以得到高純度的、較為穩定的SF水溶液。目前，將高純度SF溶液制備成多孔絲素支架材料的方法主要包括：冷凍干燥法、鹽析致孔法、氣體發泡致孔法、靜電紡絲技術等。
(1) 冷凍干燥法[27]：在SF水溶液中添加一些凝固劑，如乙醇、二縮水甘油醚等，將其制成凝膠狀，放入冷凍干燥機中進行冷凍，其中的溶劑由于發生汽化而與SF分離，利用冰晶可得到孔隙率較高的支架。
(2) 鹽析致孔法[28]：在高純度的SF溶液中，加入一定量的致孔劑NaCl顆粒，使其均勻地分散在溶液中。待SF凝結后，用甲醇或乙醇進行不溶化處理，使蛋白構象轉變成β-折疊，再用水浸泡將NaCl除去，其所占的空間變成孔隙，便可制得多孔支架。
(3) 氣體發泡致孔法[29]：將CO2和NH3用高壓法壓入SF水溶液中，直至溶液飽和，然后恢復到常壓狀態，CO2和NH3會逐漸變大、揮發產生孔狀結構。此法制備的支架材料有較高的彈性模量和強度。此外，相比其他方法而言，孔隙之間具有更好的貫通性。
(4) 靜電紡絲技術[30-33]：將高純度的SF溶解干燥后制成無定形結構為主的再生SF膜，然后溶解在六氟異丙醇、甲酸等溶劑中進行靜電紡絲，最后溶劑揮發，收集板收集到無紡布式無序的納米纖維。該工藝已經較為成熟，制備出的納米纖維其直徑與天然細胞外基質(extracellular matrix,ECM)結構更加相近，能夠較好地仿生人體內ECM環境。
4 SF支架材料在組織工程中的應用
4.1 骨組織工程
臨床上骨損傷和骨缺損很常見，近年來，骨科領域應用的替代物包括金屬和有機高分子等材料，但在生物相容性和力學性能方面都不夠理想。而SF則以其各方面良好的性能受到了廣大研究者的關注[34]。 Meinel 等[35]首次將SF水溶液制作成三維多孔支架用于骨組織工程研究，并將人體間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)植于支架上，然后再植入鼠頭蓋骨創傷模型上，觀察5周后發現能誘導骨形成，說明SF可用于骨重建和再生，并表現出較好的機械穩定性和持久性。Park 等[36]利用SF溶液通過靜電紡絲技術制作納米級三維多孔支架，直徑為6 mm，壁厚為1.5 mm，植入成骨細胞，經過DNA計數和四甲基偶氮唑鹽比色法 (MTT)，分析細胞的增殖和新陳代謝能力，細胞生長良好，把支架移植入骨損傷的小鼠體內，7 d后，小鼠的骨完全恢復。說明了SF和電紡技術在骨組織工程研究和應用上是有潛力的。Rockwood等[37]將SF顆粒與hMSC基質在體外以質量比為2∶1培養后，觀察到隨著SF顆粒的增加，hMSC的骨化能力增強，說明了適度增加SF支架的強度可以促進新骨的形成。Correia等[38]將SF溶解于六氟異丙醇溶液中制成三維多孔支架，與人體脂肪干細胞(human adipose stem cells，hASCs)復合培養7周后，植入骨損傷的小鼠體內，觀察發現堿性磷酸酶、骨橋蛋白、骨涎蛋白及Ⅰ型膠原蛋白表達上調。
4.2 軟骨組織工程
軟骨自我修復能力差，基質的更新速度較為緩慢，再加上缺乏血供系統，往往在外傷性或老年退變性嚴重軟骨損傷后難以再生。臨床上大多患者治療軟骨損傷局限于功能的恢復，療效有限。而三維多孔SF支架有利于軟骨細胞的黏附促進其再生。Cheon等[39]將SF和羊毛角質成分(wool keratose，WK)用鹽析致孔法處理后再進行靜電紡絲處理，初步得到三維多孔支架，與膝關節軟骨細胞復合培養，電子顯微鏡下觀察發現該支架有利于細胞的黏附和增殖，并能促進葡糖胺聚糖等ECM的分泌。Kambe等[40]的研究顯示，轉基因蠶產生的轉基因SF支架不僅可以促進軟骨細胞黏附，還不改變軟骨細胞的基因型，且可促進軟骨再生。
4.3 皮膚組織工程
皮膚組織工程支架材料的要求是在最短的時間內生長出永久覆蓋性的假體皮膚，使用具SF為材料制備的納米纖維多孔支架，并植入種子細胞來再生更接近于實體皮膚的“人造皮膚”，受到了眾多學者的青睞。Jeong 等[41]用氧氣和甲烷對SF支架表面進行改性，并與人表皮角質細胞共同培養，數小時后，細胞黏附率很高，并且增殖和遷移態勢良好，可見這樣的支架適合皮膚的再生。Guan等[42]將冷凍干燥法制備的多孔SF支架植入大鼠皮膚中，同時將聚乙烯醇海綿支架也植入大鼠皮膚中作為對照組，進行膠原基質沉積、皮膚再生、炎性細胞浸潤等三個方面的對比，觀察到膠原基質在SF支架中比聚乙烯醇支架中沉積得更早更快，且炎性細胞浸潤少，新生皮膚組織生長更快，說明SF支架在皮膚再生中可發揮一定的潛能。Bhardwaj等[43]將SF用冷凍凝膠技術制備成三維多孔支架，用掃描電鏡觀察孔隙大小為60~110 nm，力學性能測試表明支架抗壓強度為20~40 kPa，與人表皮角質細胞共同培養5 d 后，細胞表現出良好的增殖活力。
4.4 人工血管組織工程
目前，臨床上所使用的人工血管各有優勢，但最大的不足在于大多數不具有生物降解性，或是降解后的產物會引起受體的炎癥反應。隨著研究的不斷深入，SF用于構建組織工程血管有較好的前景[44]。 Zhang 等[45]將SF水溶液進行電紡，然后植入髖動脈內皮細胞培養24 h，電鏡圖顯示，髖動脈內皮細胞在支架上黏附與增殖良好，7 d以后，髖動脈內皮細胞爬滿整個支架，形成了一個內皮組織層，這證明了SF與血管內皮細胞具有良好的相容性，是制備人工血管的優質基質材料之一。Soffer 等[46]利用SF和聚氧乙烯作電紡液，利用靜電紡絲技術制備了內徑為0.15 mm、彈性模量為(2.45±0.47) MPa、抗張強度為(2.42±0.48) MPa、平均爆破壓為811 mm Hg 的血管支架，約為上限病理值(180~220 mm Hg)的4倍，表明該支架理論上具有適宜血管移植的良好機械性能和抵抗血流沖擊的潛能。
4.5 神經組織工程
修復由于外傷、疾病等造成的不規則神經創傷是當今醫學的一大難題，現臨床多采用自體神經移植和手術直接吻合的方法，但效果均不理想，亦存在著來源受限、免疫排斥等問題。SF材料已用于骨、軟骨、皮膚、血管等組織工程，為了證明SF可用于神經再生，Tang等[47]的實驗研究證實了SF在中樞神經系統中的生物相容性，觀察到海馬神經元細胞可在SF支架中較好地生長，細胞增殖活躍。Tang等[48]在進一步的實驗中，把SF制作成神經導管后，與雪旺細胞、背根神經節細胞及生長因子共同復合培養4周，再將其植入大鼠約10 mm長的缺損坐骨神經中，12周后進行組織學及功能評價，發現SF神經導管顯著增加了神經軸突的生長，上調了神經鈣粘素和PMP22的表達，有助于早期神經再生。
5 展望
SF因其良好的生物相容性、穩定的化學性能、優良的力學性能、可降解性等，在組織工程中的應用越來越廣泛。尤其是SF構建的三維多孔支架為各種類型細胞的黏附、增殖、分化提供了良好的ECM環境。但目前SF離臨床應用還有一段距離，例如：① 如何精確調控SF支架孔徑的大小，以適應各種類型細胞增殖、分化、遷移的需要；② 如何精確載入生長因子等生物信號分子，并調控其釋放速度、活性保持時間等；③ 能否使SF的降解速率和組織生成速率協調一致，這可能是絲素材料應用成功的關鍵，也是后續研究的熱點之一；④ 現階段SF的研究僅限于動物實驗，并不一定適用于人體。總之，解決上述問題將成為未來SF組織工程支架材料重要的研究發展方向。
