本研究目的是優化肝靶向干擾素(IFN-CSP)在大腸桿菌中的誘導表達條件,以提高蛋白表達量。通過考查培養基pH值、誘導劑IPTG濃度、誘導溫度、誘導時間和起始菌濃度等五個因素對IFN-CSP融合基因原核表達量的影響,在此基礎上,從上述影響因素中各選取4個水平進行正交實驗作進一步分析。結果表明,起始菌濃度和誘導溫度為影響表達的主要因素,最佳組合誘導條件為OD600為0.8時開始誘導、誘導4 h、誘導溫度37℃、誘導劑IPTG濃度0.4 mmol/L、培養基pH值為6.0,融合蛋白的表達量高達74.3%。通過表達優化后,IFN-CSP的產量為688.8 mg/L,提高了1.2倍。這為進一步制定生產工藝和評價IFN-CSP的生物活性奠定基礎。
引用本文： 黃演婷, 盧雪梅, 汪潔, 金小寶, 朱家勇. 肝靶向干擾素(IFN-CSP)融合基因原核表達條件的優化. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(2): 432-438. doi: 10.7507/1001-5515.20140080 復制
引言
干擾素-α2b(interferon-α2b,IFN-α2b)臨床上抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的效果顯著，更是治療慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)的一線藥物之一，但是其HBeAg臨床轉陰率只有約36.67%[1]，這可能是由于IFN-α2b在體內不存在組織分布特異性，未能在肝臟形成有效的抗病毒作用濃度，而加大用藥量又可能會引起不良反應[2-3]。提高或賦予IFN-α2b的肝靶向性，可能是理想的解決途徑。IFN-CSP是我們實驗室通過基因工程方法構建的肝靶向干擾素，是將來源于惡性瘧原蟲環子孢子蛋白(circumsporozoite protein，CSP)中的肝靶向肽 I-plus與IFNα-2b 進行融合，再連接到pET32a載體上表達而獲得的。CSP是瘧原蟲環子孢子表面覆蓋的一層表被蛋白，在瘧疾感染初期，瘧原蟲利用CSP與肝細胞表面受體相互作用從而識別、黏附在肝細胞表面[4]。近年許多研究結果都提示CSP I-plus是一個良好的肝靶向載體[5-8]，利用CSP I-plus高效特異的肝細胞靶向性可將IFN-α2b導向肝臟，使其在肝臟富集，有望提高干擾素治療慢性HBV感染的特異性，減少全身用量，降低毒副反應，提高量效比。我課題組初步研究證實，肝靶向干擾素IFN-CSP具備了CSP I-plus高效而特異的肝細胞靶向性與IFN的抗HBV作用，有重大的開發應用潛力。但如何低成本、大量獲得IFN-CSP以滿足其開發與應用的需求值得深入探索。本研究在前期基礎上，對構建成功的重組工程菌E.coli BL21/pET32a-IFN-CSP的高效誘導表達條件進行了研究。鑒于外源基因在重組菌株中表達時受到多種因素影響，引入單因素實驗和正交實驗設計方法，選取培養基pH、誘導溫度、誘導時間、誘導劑濃度和初始菌濃度五個因素進行表達優化，研究IFN-CSP在大腸桿菌中高水平表達的規律，為規模化生產建立技術基礎，更為肝靶向干擾素的活性評價奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
含IFN-CSP基因的重組菌株E.coli BL21/pET32a-IFN-CSP，系本課題組構建。
1.1.2 培養基
LB培養基: 1% 胰蛋白、0.5%酵母提取物、1% NaCl。
1.1.3 主要試劑
預染蛋白Marker購自Fermentas公司，氨芐青霉素購自Amresco公司，IPTG購自Sigma公司，酵母粉、蛋白胨購自Oxoid公司。大腸桿菌表達載體pET32a(+)及大腸桿菌 E.coli BL21由本實驗室保存。
1.2 方法
1.2.1 甘油種子菌的活化
取接菌環一環E.coli BL21/pET32a-IFN-CSP甘油種子菌劃LB固體平板，37 ℃培養過夜。挑取單菌落轉接至LB培養基(含氨芐青霉素100 μg/mL)中，置振蕩培養箱中37 ℃培養12~14 h，得活化種子菌。
1.2.2 IFN-CSP基因表達條件的單因素優化
(1) 培養基 pH值對IFN-CSP表達的影響： 將LB培養基 pH 值分別調為 6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，按1∶100接種E.coli BL21/pET32a-IFN-CSP活化菌液，置于37 ℃振蕩培養箱中培養，待菌體密度 OD600達到0.6時，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導培養6 h，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min收集各樣品中的細菌，加入160 μL 5×Tris-HCl和40 μL 5×SDS上樣緩沖液，混勻沸水煮5 min，冷卻后10 000 r/min離心10 min，取上清進行15% SDS-PAGE檢測，80 V、30 min后換成120 V直至電泳結束，Gel DOCTM凝膠成像系統分析各樣品中重組蛋白表達量占菌體總蛋白量的百分數，從而確定合適的工程菌表達肝靶向干擾素的培養基 pH值范圍。
(2) 誘導劑濃度對IFN-CSP表達的影響: 將活化菌液按1∶100接種于pH 值為7.0的LB培養基中，置于37 ℃振蕩培養箱中培養，待菌體密度 OD600達到0.6時，分別加入終濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.5 mmol/L的IPTG，誘導培養 6 h，各產物處理方法如(1) ，經15% SDS-PAGE檢測，Gel DOCTM凝膠成像系統分析各樣品中重組蛋白表達量占菌體總蛋白量的百分數，從而確定合適的工程菌表達肝靶向干擾素的誘導劑濃度。
(3) 誘導溫度對IFN-CSP表達的影響: 按1∶100接種E.coli BL21/pET32a-IFN-CSP活化菌液于pH 值為7.0的LB培養基，置于37 ℃振蕩培養箱中培養，待菌體密度 OD600達到0.6時，加入終濃度為1.0 mmol/L 的 IPTG，分別轉移到 17、22、27、32、37和 42 ℃的振蕩培養箱中培養，誘導培養 6 h，各產物處理方法如(1) ，經15% SDS-PAGE檢測，Gel DOCTM凝膠成像系統分析各樣品中重組蛋白表達量占菌體總蛋白量的百分數，從而確定合適的工程菌表達肝靶向干擾素的誘導劑濃度。
(4) 誘導時間對IFN-CSP表達的影響: 將活化菌液按1∶100接種于pH 值為7.0的LB培養基中，置于37 ℃振蕩培養箱中培養，待菌體密度 OD600達到0.6時，加入終濃度為 1.0 mmol/L的IPTG進行誘導表達，分別于1、2、4、6、8、10、12和 24 h后取樣，各產物處理方法如(1) ，經15% SDS-PAGE檢測，Gel DOCTM凝膠成像系統分析各樣品中重組蛋白表達量占菌體總蛋白量的百分數，從而確定合適的工程菌表達肝靶向干擾素的誘導劑濃度。
(5) 起始菌體密度對IFN-CSP表達的影響: 按1∶100接種E.coli BL21/pET32a-IFN-CSP活化菌液于pH 值為7.0的LB培養基中，置于37 ℃振蕩培養箱中培養，分別于菌體密度 OD600達到0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0時，加入終濃度為 1.0 mmol/L 的IPTG誘導培養6 h后，各產物處理方法如(1) ，經15% SDS-PAGE檢測，Gel DOCTM凝膠成像系統分析各樣品重組蛋白表達量占菌體總蛋白量的百分比，從而確定合適的工程菌表達肝靶向干擾素的誘導劑濃度。
1.2.3
IFN-CSP基因表達條件的正交設計優化 根據單因素優化實驗的結果，用正交設計助手Ⅱ設計L16(45)正交表，選取溫度(A)、誘導時間(B)、起始菌體濃度(C)、誘導劑IPTG濃度(D)及培養基pH值(E)五個因素作為觀察因素，每個因素各選取4個水平，分16個組進行表達，SDS-PAGE檢測各實驗組的重組蛋白表達量，對結果進行直觀分析及方差分析，確定優化表達的條件。對實驗所得出的最佳搭配誘導條件進行驗證并大量制備IFN-CSP。
2 結果
2.1 單因素實驗優化
2.1.1 培養基pH值對IFN-CSP基因表達的影響
本實驗首先考查了培養基起始pH值對該融合基因表達的影響，有報道表示原核系統表達干擾素的培養基最適pH值在7.0左右。根據結果分析培養基pH值在6.0~7.5之間都適宜IFN-CSP的表達，結果顯示在其他誘導條件相同的情況下，培養基起始pH值為6.5時，目的蛋白表達量最高，占菌體總蛋白相對含量的64.8 %(見圖 1)。
圖1
培養基pH值對IFN-CSP表達的影響
M：蛋白質分子量標準；1：
Lane M： molecular weight reference samples； Lane 1：
2.1.2 IPTG 誘導濃度對IFN-CSP基因表達的影響
pET原核表達體系利用IPTG誘導lacUV5啟動子來過量表達T7RNA聚合酶，從而產生大量的目的蛋白。誘導劑IPTG濃度對IFN-CSP蛋白表達量的影響結果如圖 2所示，可見在其他誘導條件相同的情況下，當 IPTG 濃度達到0.8 mmol/L時IFN-CSP蛋白表達量最高，占菌體總蛋白相對含量的65.1%。繼續增加IPTG的濃度(1.0~1.5 mmol/L)未見表達水平有所提高。
圖2
誘導劑濃度對IFN-CSP表達的影響
M：蛋白質分子量標準；1：
Lane M： molecular weight reference samples； Lane 1：
2.1.3 誘導溫度對IFN-CSP基因表達的影響
誘導溫度對IFN-CSP蛋白表達量有較大的影響，在重組蛋白誘導表達時，37 ℃是被常用的誘導溫度。這可以歸因于37 ℃有利于外源蛋白表達且是各種酶類活性的最適溫度。結果顯示在其他誘導條件相同的情況下，當培養溫度為37 ℃時IFN-CSP蛋白表達量最高，占菌體總蛋白相對含量的66.9%(見圖 3)。
圖3
誘導溫度對IFN-CSP表達的影響
M：蛋白質分子量標準；1：
Lane M： molecular weight reference samples； Lane 1：
2.1.4 誘導時間對IFN-CSP基因表達的影響
隨著誘導時間的增加，IFN-CSP蛋白表達量也逐步增加，在加入IPTG誘導6 h后，融合蛋白表達量達最高(見圖 4)，占菌體總蛋白相對含量的66.7%。繼續延長誘導時間，目的蛋白表達量稍見下降，可能是由于外源蛋白過量表達影響了菌體的正常生長。
圖4
誘導時間對IFN-CSP表達的影響
M：蛋白質分子量標準；1：
Lane M： molecular weight reference samples； Lane 1：
2.1.5 菌體密度對IFN-CSP基因表達的影響
許多相關的研究都會考查起始菌體濃度OD600對外源基因表達的影響，因為誘導菌齡對外源基因的表達形式起著決定性作用[9-10]。當培養基的菌體密度OD600達到0.1時，E.coli BL21/pET32a-IFN-CSP活化種子菌達到對數生長期，融合蛋白表達量開始顯著增加，當菌體密度 OD600達到0.4時加入IPTG誘導，目的蛋白表達量最高，占菌體總蛋白相對含量的70.8%(見圖 5) 。
圖5
起始菌體濃度對IFN-CSP表達的影響
M：蛋白質分子量標準；1：
Lane M： molecular weight reference samples； Lane 1：
綜合以上單因素實驗得出的結果，重組菌株E.coli BL21/pET32a-IFN-CSP較優的表達條件是: 在37 ℃條件下，當菌體密度OD600達到0.4時，加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG誘導6 h。在此誘導條件下，融合蛋白的表達量高達70.8%。
2.2 正交設計實驗優化
正交設計是研究多因素多水平的一種設計方法，是一種高效率、快速、經濟的實驗設計方法。根據正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備了“均勻分散、齊整可比”的特點，正交試驗設計是分析因式設計的主要方法。本實驗的正交設計是根據上述單因素的實驗結果所設置的，具體水平數據參數如表 1所示。
表1
正交實驗選取因素及其水平
Table1.
Processing parameters and their levels in the orthogonal experiment
圖 6為正交實驗16個實驗號結果的SDS-PAGE分析圖。運用正交實驗直觀分析法得出的條件優化結果如表 2所示。極差分析可知C＞A＞D＞B＞E，即對IFN-CSP表達量影響的因素為：起始菌體濃度＞誘導溫度＞誘導劑濃度＞誘導時間＞pH值。這一結果表明誘導時的起始菌濃度對于原核表達系統成功地轉錄和翻譯外源基因有著非常重要的意義。在實驗條件下優化水平的最佳組合為：A3B1C4D1E1，即培養基pH值為6.0，IPTG的濃度0.4 mmol/L，誘導溫度37 ℃，誘導表達時間4 h，誘導菌體濃度OD600值0.8。在此誘導條件下，融合蛋白的表達比例高達74.3%，蛋白產量為688.8 mg/L。為進一步驗證上述結果的可靠性和穩定性，按正交設計優化的最佳條件重復進行了3次誘導，結果發現IFN-CSP的表達量均穩定地占菌總蛋白的74%左右，是非優化條件下誘導表達的1.2倍。
圖6
正交實驗L16(45)結果SDS-PAGE分析
M：蛋白質分子量標準；1：
Lane M： molecular weight reference samples； Lane 1：
表2
L16(45)正交設計及實驗結果與分析
Table2.
Test results and analysis of orthogonal design
3 討論
用于表達重組蛋白的系統有大腸桿菌系統、甲醇酵母系統、昆蟲表達系統等，因其具有成本低廉、目的基因表達水平高等特點，大腸桿菌原核表達系統在目前生物藥物研究中應用最為廣泛。由于干擾素在腫瘤、乙型肝炎等治療領域的廣泛應用，國內外學者對如何低成本、大量高效生產制備干擾素進行著不斷的探索。有研究者在轉基因小鼠乳腺中表達重組hIFN-α2b，得到的干擾素活性為2.8×107 IU/mg，但得率只有29.71 μg/L[11]。近年為延長干擾素的半衰期、擴展其生物學活性，許多研究構建干擾素的融合蛋白。王磊等[12]成功構建了IFN-α2b與人IgG免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白并在畢赤酵母中表達，產物體內半衰期明顯延長，但是按IFN-α2b和Fcγ分子重量比率折算，IFN-α2b的得率只為150 mg/L。朱筠等[13]選用重組大腸桿菌BL21(pBAI)表達hIFN-α2b，采用恒速流補充葡萄糖的方式，其表達量高達到6 540 mg/L。通過比較以上研究結果的得率，可知原核表達系統較其他系統具有優勢，更能高效地獲得重組干擾素，所以目前用于臨床的干擾素多來源于大腸桿菌原核系統。
本研究的IFN-CSP融合基因是采用pET32a原核表達載體，這一載體與其它表達載體不同之處在于當進行基因表達時，表達產物為帶有硫氧還原蛋白和6×His的的融合蛋白。硫氧還原蛋白在提高目的蛋白表達量和保護融合蛋白免受蛋白酶降解中具有一定作用，而6×His與鎳離子金屬螯合層析柱有特異性的親和能力，可以對融合蛋白的純化提供便捷。本實驗中，IFN-CSP在E.coli BL21/pET32a中成功誘導表達，其表達產物主要以包涵體的形式存在，這有利于大量獲得目的蛋白并進一步提純，經優化表達條件后獲得了約74%的高效表達。
許多研究表明細菌生長速率嚴重影響著外源蛋白的表達，而外源基因在細菌中高效表達也必然會影響宿主菌的生長和代謝，如何合理地調節好外源基因高效表達與宿主菌的生長代謝之間的關系，是提高外源基因表達不可缺少的一個環節[14]。外源蛋白的表達常規研究因素有培養基pH值、誘導溫度、誘導菌體起始濃度、誘導劑濃度、誘導時間等，每個表達條件都會對外源基因的表達或宿主菌的生長代謝產生影響。例如：① 弱酸性的培養基是最適合原核系統快速合成蛋白的，但隨著發酵液中菌體的大量增殖與產物的堆積，培養基中的營養物質被轉化或降解導致pH開始偏堿性，菌體合成蛋白的速度放慢甚至停止。所以選取培養基pH值為弱酸性(6.0、6.5)、中性(7.0、7.5)及弱堿性(8.0)進行條件優化。② 27~32 ℃的誘導溫度有利于外源蛋白表達，而37~42 ℃的誘導溫度是多數細菌酶類活性的最適溫度[15-16]。因此以5為跨度，研究17~42 ℃中哪個溫度最適合工程菌表達靶向干擾素。③ 初始細菌濃度OD600為0.5時是細菌的對數生長期，此時細菌活性高、生長狀態好，而細菌數量增長到OD600為1.0時開始誘導，則有利于目的蛋白量增加[16]。所以在OD600為0.5和1.0左右取三個點進行條件優化。④ 誘導劑IPTG終濃度選取0.5 mmol/L時對宿主菌的毒性小，利于細菌生長但是誘導表達速度相對低，而IPTG終濃度為1.0 mmol/L更適合高效快速地誘導外源蛋白表達，但可能對宿主菌產生毒性作用[17]。鑒于IPTG的誘導效率及毒性作用，選取0.1~1.5 mmol/L的IPTG進行條件優化。⑤ 一般的外源蛋白誘導在4 h后，重組蛋白的表達接近最大值，但針對個別弱表達的外源蛋白誘導時間得延長至7 h。因此在4~7 h前后分別設置時間點，研究何時工程菌的肝靶向干擾素表達量達最高。
利用統計學考查各誘導條件的相互作用和各誘導條件對最終得率的綜合影響，從而優化整個表達過程，使我們得以簡化并優化表達過程，最終達到降低生產成本的目的[17]。因為在利用大腸桿菌誘導表達外源基因時各誘導條件之間有一定的內在關系，所以在單因素實驗的基礎上，采用正交實驗以尋求各誘導條件的最佳配比。本研究采用單因素實驗與正交設計相結合的方法，對常規表達條件進行優化，以提高目的蛋白的表達水平。先對大腸桿菌表達外源基因的五個主要影響因素進行單因素實驗，得出該工程菌合適的表達條件范圍。再根據單因素實驗得出的結果從五個因素中選取四個水平設計正交實驗，從而進一步確定其最佳表達條件的組合。本實驗考察了培養基pH值(6.0、6.5、7.0、7.5和8.0)、誘導劑IPTG的濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.5 mmol/L)、誘導溫度 (17、22、27、32、37和 42 ℃)、誘導時間(1、2、4、6、8、10、12和 24 h)和誘導起始菌濃度 OD600 (0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0) 對融合蛋白表達的影響。經過優化后，IFN-CSP融合蛋白的表達量是未優化時的1.2倍，在實驗室制備水平上最終產量為688.8 mg/L。通過表達優化后獲得的較高表達量為下游的純化、復性研究提供了物質基礎，間接提高了蛋白的回收率，更為進一步制定生產工藝和評價IFN-CSP的生物活性奠定了基礎。最后，由于本研究只在實驗室水平優化肝靶向干擾素的表達條件，該數據在中試或者工業化生產中并不完全適用，也不全面，例如對于工業化生產中較重要的溶氧量，在本實驗中并未考查，所以在今后的研究中可以繼續深入探討，以求獲得更高產量的肝靶向干擾素。
引言
干擾素-α2b(interferon-α2b,IFN-α2b)臨床上抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的效果顯著，更是治療慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)的一線藥物之一，但是其HBeAg臨床轉陰率只有約36.67%[1]，這可能是由于IFN-α2b在體內不存在組織分布特異性，未能在肝臟形成有效的抗病毒作用濃度，而加大用藥量又可能會引起不良反應[2-3]。提高或賦予IFN-α2b的肝靶向性，可能是理想的解決途徑。IFN-CSP是我們實驗室通過基因工程方法構建的肝靶向干擾素，是將來源于惡性瘧原蟲環子孢子蛋白(circumsporozoite protein，CSP)中的肝靶向肽 I-plus與IFNα-2b 進行融合，再連接到pET32a載體上表達而獲得的。CSP是瘧原蟲環子孢子表面覆蓋的一層表被蛋白，在瘧疾感染初期，瘧原蟲利用CSP與肝細胞表面受體相互作用從而識別、黏附在肝細胞表面[4]。近年許多研究結果都提示CSP I-plus是一個良好的肝靶向載體[5-8]，利用CSP I-plus高效特異的肝細胞靶向性可將IFN-α2b導向肝臟，使其在肝臟富集，有望提高干擾素治療慢性HBV感染的特異性，減少全身用量，降低毒副反應，提高量效比。我課題組初步研究證實，肝靶向干擾素IFN-CSP具備了CSP I-plus高效而特異的肝細胞靶向性與IFN的抗HBV作用，有重大的開發應用潛力。但如何低成本、大量獲得IFN-CSP以滿足其開發與應用的需求值得深入探索。本研究在前期基礎上，對構建成功的重組工程菌E.coli BL21/pET32a-IFN-CSP的高效誘導表達條件進行了研究。鑒于外源基因在重組菌株中表達時受到多種因素影響，引入單因素實驗和正交實驗設計方法，選取培養基pH、誘導溫度、誘導時間、誘導劑濃度和初始菌濃度五個因素進行表達優化，研究IFN-CSP在大腸桿菌中高水平表達的規律，為規模化生產建立技術基礎，更為肝靶向干擾素的活性評價奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
含IFN-CSP基因的重組菌株E.coli BL21/pET32a-IFN-CSP，系本課題組構建。
1.1.2 培養基
LB培養基: 1% 胰蛋白、0.5%酵母提取物、1% NaCl。
1.1.3 主要試劑
預染蛋白Marker購自Fermentas公司，氨芐青霉素購自Amresco公司，IPTG購自Sigma公司，酵母粉、蛋白胨購自Oxoid公司。大腸桿菌表達載體pET32a(+)及大腸桿菌 E.coli BL21由本實驗室保存。
1.2 方法
1.2.1 甘油種子菌的活化
取接菌環一環E.coli BL21/pET32a-IFN-CSP甘油種子菌劃LB固體平板，37 ℃培養過夜。挑取單菌落轉接至LB培養基(含氨芐青霉素100 μg/mL)中，置振蕩培養箱中37 ℃培養12~14 h，得活化種子菌。
1.2.2 IFN-CSP基因表達條件的單因素優化
(1) 培養基 pH值對IFN-CSP表達的影響： 將LB培養基 pH 值分別調為 6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，按1∶100接種E.coli BL21/pET32a-IFN-CSP活化菌液，置于37 ℃振蕩培養箱中培養，待菌體密度 OD600達到0.6時，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導培養6 h，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min收集各樣品中的細菌，加入160 μL 5×Tris-HCl和40 μL 5×SDS上樣緩沖液，混勻沸水煮5 min，冷卻后10 000 r/min離心10 min，取上清進行15% SDS-PAGE檢測，80 V、30 min后換成120 V直至電泳結束，Gel DOCTM凝膠成像系統分析各樣品中重組蛋白表達量占菌體總蛋白量的百分數，從而確定合適的工程菌表達肝靶向干擾素的培養基 pH值范圍。
(2) 誘導劑濃度對IFN-CSP表達的影響: 將活化菌液按1∶100接種于pH 值為7.0的LB培養基中，置于37 ℃振蕩培養箱中培養，待菌體密度 OD600達到0.6時，分別加入終濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.5 mmol/L的IPTG，誘導培養 6 h，各產物處理方法如(1) ，經15% SDS-PAGE檢測，Gel DOCTM凝膠成像系統分析各樣品中重組蛋白表達量占菌體總蛋白量的百分數，從而確定合適的工程菌表達肝靶向干擾素的誘導劑濃度。
(3) 誘導溫度對IFN-CSP表達的影響: 按1∶100接種E.coli BL21/pET32a-IFN-CSP活化菌液于pH 值為7.0的LB培養基，置于37 ℃振蕩培養箱中培養，待菌體密度 OD600達到0.6時，加入終濃度為1.0 mmol/L 的 IPTG，分別轉移到 17、22、27、32、37和 42 ℃的振蕩培養箱中培養，誘導培養 6 h，各產物處理方法如(1) ，經15% SDS-PAGE檢測，Gel DOCTM凝膠成像系統分析各樣品中重組蛋白表達量占菌體總蛋白量的百分數，從而確定合適的工程菌表達肝靶向干擾素的誘導劑濃度。
(4) 誘導時間對IFN-CSP表達的影響: 將活化菌液按1∶100接種于pH 值為7.0的LB培養基中，置于37 ℃振蕩培養箱中培養，待菌體密度 OD600達到0.6時，加入終濃度為 1.0 mmol/L的IPTG進行誘導表達，分別于1、2、4、6、8、10、12和 24 h后取樣，各產物處理方法如(1) ，經15% SDS-PAGE檢測，Gel DOCTM凝膠成像系統分析各樣品中重組蛋白表達量占菌體總蛋白量的百分數，從而確定合適的工程菌表達肝靶向干擾素的誘導劑濃度。
(5) 起始菌體密度對IFN-CSP表達的影響: 按1∶100接種E.coli BL21/pET32a-IFN-CSP活化菌液于pH 值為7.0的LB培養基中，置于37 ℃振蕩培養箱中培養，分別于菌體密度 OD600達到0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0時，加入終濃度為 1.0 mmol/L 的IPTG誘導培養6 h后，各產物處理方法如(1) ，經15% SDS-PAGE檢測，Gel DOCTM凝膠成像系統分析各樣品重組蛋白表達量占菌體總蛋白量的百分比，從而確定合適的工程菌表達肝靶向干擾素的誘導劑濃度。
1.2.3
IFN-CSP基因表達條件的正交設計優化 根據單因素優化實驗的結果，用正交設計助手Ⅱ設計L16(45)正交表，選取溫度(A)、誘導時間(B)、起始菌體濃度(C)、誘導劑IPTG濃度(D)及培養基pH值(E)五個因素作為觀察因素，每個因素各選取4個水平，分16個組進行表達，SDS-PAGE檢測各實驗組的重組蛋白表達量，對結果進行直觀分析及方差分析，確定優化表達的條件。對實驗所得出的最佳搭配誘導條件進行驗證并大量制備IFN-CSP。
2 結果
2.1 單因素實驗優化
2.1.1 培養基pH值對IFN-CSP基因表達的影響
本實驗首先考查了培養基起始pH值對該融合基因表達的影響，有報道表示原核系統表達干擾素的培養基最適pH值在7.0左右。根據結果分析培養基pH值在6.0~7.5之間都適宜IFN-CSP的表達，結果顯示在其他誘導條件相同的情況下，培養基起始pH值為6.5時，目的蛋白表達量最高，占菌體總蛋白相對含量的64.8 %(見圖 1)。
圖1
培養基pH值對IFN-CSP表達的影響
M：蛋白質分子量標準；1：
Lane M： molecular weight reference samples； Lane 1：
2.1.2 IPTG 誘導濃度對IFN-CSP基因表達的影響
pET原核表達體系利用IPTG誘導lacUV5啟動子來過量表達T7RNA聚合酶，從而產生大量的目的蛋白。誘導劑IPTG濃度對IFN-CSP蛋白表達量的影響結果如圖 2所示，可見在其他誘導條件相同的情況下，當 IPTG 濃度達到0.8 mmol/L時IFN-CSP蛋白表達量最高，占菌體總蛋白相對含量的65.1%。繼續增加IPTG的濃度(1.0~1.5 mmol/L)未見表達水平有所提高。
圖2
誘導劑濃度對IFN-CSP表達的影響
M：蛋白質分子量標準；1：
Lane M： molecular weight reference samples； Lane 1：
2.1.3 誘導溫度對IFN-CSP基因表達的影響
誘導溫度對IFN-CSP蛋白表達量有較大的影響，在重組蛋白誘導表達時，37 ℃是被常用的誘導溫度。這可以歸因于37 ℃有利于外源蛋白表達且是各種酶類活性的最適溫度。結果顯示在其他誘導條件相同的情況下，當培養溫度為37 ℃時IFN-CSP蛋白表達量最高，占菌體總蛋白相對含量的66.9%(見圖 3)。
圖3
誘導溫度對IFN-CSP表達的影響
M：蛋白質分子量標準；1：
Lane M： molecular weight reference samples； Lane 1：
2.1.4 誘導時間對IFN-CSP基因表達的影響
隨著誘導時間的增加，IFN-CSP蛋白表達量也逐步增加，在加入IPTG誘導6 h后，融合蛋白表達量達最高(見圖 4)，占菌體總蛋白相對含量的66.7%。繼續延長誘導時間，目的蛋白表達量稍見下降，可能是由于外源蛋白過量表達影響了菌體的正常生長。
圖4
誘導時間對IFN-CSP表達的影響
M：蛋白質分子量標準；1：
Lane M： molecular weight reference samples； Lane 1：
2.1.5 菌體密度對IFN-CSP基因表達的影響
許多相關的研究都會考查起始菌體濃度OD600對外源基因表達的影響，因為誘導菌齡對外源基因的表達形式起著決定性作用[9-10]。當培養基的菌體密度OD600達到0.1時，E.coli BL21/pET32a-IFN-CSP活化種子菌達到對數生長期，融合蛋白表達量開始顯著增加，當菌體密度 OD600達到0.4時加入IPTG誘導，目的蛋白表達量最高，占菌體總蛋白相對含量的70.8%(見圖 5) 。
圖5
起始菌體濃度對IFN-CSP表達的影響
M：蛋白質分子量標準；1：
Lane M： molecular weight reference samples； Lane 1：
綜合以上單因素實驗得出的結果，重組菌株E.coli BL21/pET32a-IFN-CSP較優的表達條件是: 在37 ℃條件下，當菌體密度OD600達到0.4時，加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG誘導6 h。在此誘導條件下，融合蛋白的表達量高達70.8%。
2.2 正交設計實驗優化
正交設計是研究多因素多水平的一種設計方法，是一種高效率、快速、經濟的實驗設計方法。根據正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備了“均勻分散、齊整可比”的特點，正交試驗設計是分析因式設計的主要方法。本實驗的正交設計是根據上述單因素的實驗結果所設置的，具體水平數據參數如表 1所示。
表1
正交實驗選取因素及其水平
Table1.
Processing parameters and their levels in the orthogonal experiment
圖 6為正交實驗16個實驗號結果的SDS-PAGE分析圖。運用正交實驗直觀分析法得出的條件優化結果如表 2所示。極差分析可知C＞A＞D＞B＞E，即對IFN-CSP表達量影響的因素為：起始菌體濃度＞誘導溫度＞誘導劑濃度＞誘導時間＞pH值。這一結果表明誘導時的起始菌濃度對于原核表達系統成功地轉錄和翻譯外源基因有著非常重要的意義。在實驗條件下優化水平的最佳組合為：A3B1C4D1E1，即培養基pH值為6.0，IPTG的濃度0.4 mmol/L，誘導溫度37 ℃，誘導表達時間4 h，誘導菌體濃度OD600值0.8。在此誘導條件下，融合蛋白的表達比例高達74.3%，蛋白產量為688.8 mg/L。為進一步驗證上述結果的可靠性和穩定性，按正交設計優化的最佳條件重復進行了3次誘導，結果發現IFN-CSP的表達量均穩定地占菌總蛋白的74%左右，是非優化條件下誘導表達的1.2倍。
圖6
正交實驗L16(45)結果SDS-PAGE分析
M：蛋白質分子量標準；1：
Lane M： molecular weight reference samples； Lane 1：
表2
L16(45)正交設計及實驗結果與分析
Table2.
Test results and analysis of orthogonal design
3 討論
用于表達重組蛋白的系統有大腸桿菌系統、甲醇酵母系統、昆蟲表達系統等，因其具有成本低廉、目的基因表達水平高等特點，大腸桿菌原核表達系統在目前生物藥物研究中應用最為廣泛。由于干擾素在腫瘤、乙型肝炎等治療領域的廣泛應用，國內外學者對如何低成本、大量高效生產制備干擾素進行著不斷的探索。有研究者在轉基因小鼠乳腺中表達重組hIFN-α2b，得到的干擾素活性為2.8×107 IU/mg，但得率只有29.71 μg/L[11]。近年為延長干擾素的半衰期、擴展其生物學活性，許多研究構建干擾素的融合蛋白。王磊等[12]成功構建了IFN-α2b與人IgG免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白并在畢赤酵母中表達，產物體內半衰期明顯延長，但是按IFN-α2b和Fcγ分子重量比率折算，IFN-α2b的得率只為150 mg/L。朱筠等[13]選用重組大腸桿菌BL21(pBAI)表達hIFN-α2b，采用恒速流補充葡萄糖的方式，其表達量高達到6 540 mg/L。通過比較以上研究結果的得率，可知原核表達系統較其他系統具有優勢，更能高效地獲得重組干擾素，所以目前用于臨床的干擾素多來源于大腸桿菌原核系統。
本研究的IFN-CSP融合基因是采用pET32a原核表達載體，這一載體與其它表達載體不同之處在于當進行基因表達時，表達產物為帶有硫氧還原蛋白和6×His的的融合蛋白。硫氧還原蛋白在提高目的蛋白表達量和保護融合蛋白免受蛋白酶降解中具有一定作用，而6×His與鎳離子金屬螯合層析柱有特異性的親和能力，可以對融合蛋白的純化提供便捷。本實驗中，IFN-CSP在E.coli BL21/pET32a中成功誘導表達，其表達產物主要以包涵體的形式存在，這有利于大量獲得目的蛋白并進一步提純，經優化表達條件后獲得了約74%的高效表達。
許多研究表明細菌生長速率嚴重影響著外源蛋白的表達，而外源基因在細菌中高效表達也必然會影響宿主菌的生長和代謝，如何合理地調節好外源基因高效表達與宿主菌的生長代謝之間的關系，是提高外源基因表達不可缺少的一個環節[14]。外源蛋白的表達常規研究因素有培養基pH值、誘導溫度、誘導菌體起始濃度、誘導劑濃度、誘導時間等，每個表達條件都會對外源基因的表達或宿主菌的生長代謝產生影響。例如：① 弱酸性的培養基是最適合原核系統快速合成蛋白的，但隨著發酵液中菌體的大量增殖與產物的堆積，培養基中的營養物質被轉化或降解導致pH開始偏堿性，菌體合成蛋白的速度放慢甚至停止。所以選取培養基pH值為弱酸性(6.0、6.5)、中性(7.0、7.5)及弱堿性(8.0)進行條件優化。② 27~32 ℃的誘導溫度有利于外源蛋白表達，而37~42 ℃的誘導溫度是多數細菌酶類活性的最適溫度[15-16]。因此以5為跨度，研究17~42 ℃中哪個溫度最適合工程菌表達靶向干擾素。③ 初始細菌濃度OD600為0.5時是細菌的對數生長期，此時細菌活性高、生長狀態好，而細菌數量增長到OD600為1.0時開始誘導，則有利于目的蛋白量增加[16]。所以在OD600為0.5和1.0左右取三個點進行條件優化。④ 誘導劑IPTG終濃度選取0.5 mmol/L時對宿主菌的毒性小，利于細菌生長但是誘導表達速度相對低，而IPTG終濃度為1.0 mmol/L更適合高效快速地誘導外源蛋白表達，但可能對宿主菌產生毒性作用[17]。鑒于IPTG的誘導效率及毒性作用，選取0.1~1.5 mmol/L的IPTG進行條件優化。⑤ 一般的外源蛋白誘導在4 h后，重組蛋白的表達接近最大值，但針對個別弱表達的外源蛋白誘導時間得延長至7 h。因此在4~7 h前后分別設置時間點，研究何時工程菌的肝靶向干擾素表達量達最高。
利用統計學考查各誘導條件的相互作用和各誘導條件對最終得率的綜合影響，從而優化整個表達過程，使我們得以簡化并優化表達過程，最終達到降低生產成本的目的[17]。因為在利用大腸桿菌誘導表達外源基因時各誘導條件之間有一定的內在關系，所以在單因素實驗的基礎上，采用正交實驗以尋求各誘導條件的最佳配比。本研究采用單因素實驗與正交設計相結合的方法，對常規表達條件進行優化，以提高目的蛋白的表達水平。先對大腸桿菌表達外源基因的五個主要影響因素進行單因素實驗，得出該工程菌合適的表達條件范圍。再根據單因素實驗得出的結果從五個因素中選取四個水平設計正交實驗，從而進一步確定其最佳表達條件的組合。本實驗考察了培養基pH值(6.0、6.5、7.0、7.5和8.0)、誘導劑IPTG的濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.5 mmol/L)、誘導溫度 (17、22、27、32、37和 42 ℃)、誘導時間(1、2、4、6、8、10、12和 24 h)和誘導起始菌濃度 OD600 (0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0) 對融合蛋白表達的影響。經過優化后，IFN-CSP融合蛋白的表達量是未優化時的1.2倍，在實驗室制備水平上最終產量為688.8 mg/L。通過表達優化后獲得的較高表達量為下游的純化、復性研究提供了物質基礎，間接提高了蛋白的回收率，更為進一步制定生產工藝和評價IFN-CSP的生物活性奠定了基礎。最后，由于本研究只在實驗室水平優化肝靶向干擾素的表達條件，該數據在中試或者工業化生產中并不完全適用，也不全面，例如對于工業化生產中較重要的溶氧量，在本實驗中并未考查，所以在今后的研究中可以繼續深入探討，以求獲得更高產量的肝靶向干擾素。
