對316L不銹鋼、聚甲醛(POM)以及低溫各向同性熱解碳(LTIC)材料的血液相容性進行了研究,初步探討作為心臟瓣膜瓣葉材料的可行性。通過樣品表面水接觸角的測量判斷親疏水性,利用血小板黏附實驗、凝血酶時間測定以及溶血率實驗評估其血液相容性。結果表明:POM具有疏水性、較低的溶血率,樣品表面血小板的黏附數量和被激活程度均低于316L不銹鋼并與LTIC相近。本研究指出了POM作為雙葉心臟瓣膜瓣葉材料的潛在應用價值。
引用本文： 武亮亮, 宋強, 劉濤, 劉麗, 黃楠. 可用于雙葉心臟瓣膜的聚甲醛的血液相容性評價. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(2): 347-351. doi: 10.7507/1001-5515.20140065 復制
引言
在心臟瓣膜疾病的治療過程中，人工心臟瓣膜發揮著重要的作用，在人工心臟瓣膜發展的40年間已先后約有50余種人造瓣膜[1]應用于臨床，但人工心臟瓣膜仍未達到理想的水平。心臟瓣膜材料與結構對性能影響很大[2]，現在市場上大部分瓣膜瓣葉材料為低溫各向同性熱解碳(low temperature isotropic carbon,LTIC)，其具有與血液相近的密度、良好的自潤滑性能和生物相容性，但它生產成本高，污染大，難加工，材料本身比較脆，容易產生脆斷，直接影響心臟瓣膜的功能。
醫用聚甲醛(polyoxymethylene,POM)是隨著現代生物醫用高分子發展而出現的新材料[3]，具有較好的力學性能，用POM代替LTIC作為心臟瓣膜瓣葉材料不僅可以降低成本，而且還具有加工精度高和性能優異的特點。POM是一種綜合性能優良的工程塑料，具有高的力學性能，如強度、耐磨性、韌性、耐疲勞性、抗蠕變性和可加工性[4]。當醫用級別的POM與機體接觸，除要求具有相應的醫用功能外，還必須具備良好的血液相容性，避免凝血、血栓形成及溶血等不良反應，因此研究瓣葉材料血液相容性極為必要。POM作為醫用高分子材料較早應用于骨錨釘[5]、人工關節[6]等，其體內耐蠕變性能和血液相容性都得到了驗證，可以作為體內植入材料，也曾直接應用人工心臟瓣膜，比如Bjork-Shilcy(聚甲醛單葉瓣)[7]，當時由于材料性能及加工問題，瓣膜植入后產生疲勞磨損以致失效[8]，但其作為植入體的生物相容性得到了確認。最近幾年，POM的性能得到很大的改進，Chen等[9]通過摻雜低密度聚乙烯和乙烯丙烯酸，耐磨性能得到明顯提高，Zhao等[10]則通過添加多壁碳納米管，使POM結晶溫度和結晶速率增加，機械性能得到明顯提高。但目前關于POM的研究均未涉及其血液相容性，因此，利用POM作為雙葉心臟瓣膜瓣葉材料，需要對其血液相容性進一步探討。本文通過水接觸角測量、溶血實驗、凝血酶時間測定、血小板黏附實驗等對醫用POM材料進行了血液相容性評價，以促進對其應用于心臟瓣膜瓣葉可能性的認識。
1 材料與方法
1.1 樣品制備
實驗所需POM為廣東江門市新會區會城江峰棒材廠生產的聚甲醛板材，醫用級別。將板材加工成9 mm×9 mm的方形樣品，厚1.5 mm，在沸水中煮2 h，消除切削應力，然后經過砂紙打磨及拋光機拋光表面，最后依次用丙酮、無水乙醇超聲清洗3 min，再用雙蒸水超聲清洗兩次，每次5 min，干燥后貯存于干燥箱中備用。對比樣品取用316L不銹鋼(316L)和熱解碳(LTIC)(蘭州蘭飛醫療器械有限公司生產)。
1.2 材料及表征
1.2.1 水接觸角測量
利用液滴法測量材料表面的水接觸角，采用JY-82型接觸角測量儀，測試環境：溫度20 ℃，濕度45%，萬級超凈實驗室。
1.2.2 溶血實驗
溶血實驗即為檢測實驗材料對血液紅細胞的溶血作用。實驗過程嚴格按照ISO 10993-4標準規定的溶血實驗的具體操作步驟進行，實驗重復三次(n=4)，首先采用酶標儀測定540 nm波長處溶液的吸光度，然后根據吸光度計算樣品的溶血率。
1.2.3 凝血酶時間檢測
凝血酶時間檢測需要血漿凝血酶原時間(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)和血漿凝血酶時間(thrombin time,TT)測定。主要步驟： 將新鮮抗凝全血，在3 000 r/min轉速下離心10 min，取上層黃色液體得貧血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP)，用其浸泡樣品，然后在37 ℃水浴箱孵育30 min，所得血漿用APTT、PT、TT測定試劑盒進行檢測，用意大利Hospitex公司凝血儀記錄時間。
1.2.4 血小板黏附實驗
將新鮮抗凝全血在1 500 r/min轉速下離心15 min，取上層黃色液體得富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)，在樣品表面滴加50 μL PRP，然后在37 ℃水浴箱孵育0.5 h和2 h，用PBS溶液清洗三次，再用2.5%戊二醛溶液固定6 h以上，然后用50%、75%、90%和100%的無水乙醇(水為溶劑)分別脫水15 min，接著用50%、75%、90%和100%的乙酸異戊酯(無水乙醇為溶劑)溶液分別脫醇15 min，最后用CO2臨界點干燥樣品，干燥后用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察血小板的形態并拍照。另外，對上述用戊二醛固定的樣品，對血小板的膜骨架進行免疫熒光染色(染料為羅丹明123)，然后用400倍的顯微鏡對每個試驗樣品隨機拍10個視野，進行人工計數和統計處理[11]。
2 結果與討論
2.1 水接觸角
水接觸角是表征材料表面親疏水性的一種簡便方法，水接觸角的測定結果如圖 1所示。可見，316L不銹鋼表面的水接觸角約為70°，LTIC表面的水接觸角約為85°，POM樣品表面的水接觸角約為95°，為疏水材料，其趨勢是316L＜LTIC＜POM。
圖1
樣品表面的水接觸角
Figure1.
Water contact angle of sample surfaces
2.2 溶血率
316 L不銹鋼和LTIC分別作為生產血管支架、心臟瓣膜瓣葉的主要材料，其不溶血的性能早已被證實[12]，本次溶血實驗測得POM樣品溶血率平均為0.2%，均小于5%，離心后試管中紅細胞下沉，上清液變清無紅色，吸取少量含紅細胞的下層液進行顯微鏡下觀察，未發現紅細胞破裂現象，符合ISO10993-4標準的規定，材料溶血實驗檢測合格，可以作為血液接觸類生物材料[13]，表明POM植入體內不會導致紅細胞溶解和血紅蛋白釋放，不會引起急性溶血，具有良好的血液相容性。
2.3 凝血酶時間
PT和APTT測定是外源性和內源性凝血系統的過篩試驗，TT則主要檢測血漿纖維蛋白原的減少或抗凝物質的增多。結果如表 1所示，三種樣品的PT/TT無明顯差異，APTT檢測結果較正常血漿偏長，與316L和LTIC無明顯差異，POM具有和正常血漿一樣的凝血時間，不會引起外源性和內源性凝血。
表1
APTT/PT/TT結果
Table1.
Results of APTT/PT/TT
2.4 血小板實驗
圖 2為樣品表面黏附血小板的掃描電鏡照片。從血小板的形態看，三種樣品表面的血小板受到一定程度的激活，部分血小板明顯地伸出偽足；316L表面的血小板被激活程度較高，有明顯的偽足伸出，并且大部分血小板嚴重變形，在材料表面完全鋪展開；而LTIC和POM表面的血小板形態相對比較圓整，部分被激活，激活程度低于316L，兩者比較中，POM激活程度更低。從血小板的黏附數量看，孵育0.5 h血小板黏附數量相差不大，孵育2 h后POM的黏附數量較316L和LTIC少。
圖2
樣品表面血小板黏附的掃描電鏡圖(3 000×)
(a)、(d) 316L；(b)、(e) POM；(c)、(f) LTIC
Figure2. SEM images for the sample surfaces with platelet adhesion (3 000×)熒光染色結果如圖 3所示，孵育0.5 h血小板黏附數量相差不大，孵育2 h后POM的黏附數量較316L和LTIC少，與掃描電鏡結果一致。通過熒光染色照片對血小板的黏附數量進行統計分析，結果如圖 4所示。在0.5 h時，316L、POM和LTIC三種樣品表面的血小板黏附數量約為2 000 個/cm2，且無明顯差異；經過2 h的孵化后，三種樣品表面的血小板黏附數量明顯增多，316L表面血小板黏附數量約為10 000 個/cm2，LTCT和POM表面血小板黏附數量則約為7 000 個/cm2，316L表面的血小板黏附數量明顯多于LTCT和POM，與掃描電鏡結果一致。
圖3
不同樣品的免疫熒光圖片(400×)
(a)、(d) 316L；(b)、(e) POM；(c)、(f) LTIC
Figure3. Immunofluorescence images of different samples (400×)
圖4
樣品表面血小板的黏附數量
Figure4.
Adhesion amount of platelets on the samples
血小板黏附實驗結果表明：由于POM和LTIC表面血小板的黏附數量和被激活的程度均低于316L，因而它們具有優于316L的抗凝血效果并且POM具有和LTIC相似的抗凝血效果，可以用來植入體內。
3 結論
人工心臟瓣膜作為國家第三類醫療器械，對人體具有潛在危險，對其安全性、有效性必須嚴格控制，因此，瓣膜材料的選材尤為重要，在滿足瓣膜的基本功能要求外，必須首先滿足植入體內的血液相容性要求。良好的血液相容性是心臟瓣膜材料的必要特性，通過體外血液實驗研究表明：與316L和LTIC相比，POM具有疏水性，溶血率低，不會引起外源性和內源性凝血，具有與LTIC相近的血液相容性，可以作為植入器械植入人體。POM材料密度接近血液，血液流動過程中不會額外增加能量損失[14]。POM材料又具有良好的加工性能，雙葉機械瓣膜瓣葉結構復雜，但可以通過模具注塑加工或者數控機床加工用于雙葉機械心臟瓣膜的瓣葉，工藝相對簡單，成本低，因此POM材料具有應用于雙葉機械心臟瓣膜的潛力。
POM能夠做為植入醫療器械材料，其本身具有良好的血液相容性，后續還可以采用表面接枝改性、引入生物活性分子、表面涂層等進一步改善POM表面的血液相容性，使其具有更好的生物相容性[15]。實際上應用POM作為瓣葉材料，還要包括了對材料其它性能如物理、機械性能、化學穩定性、毒性、加工成型性等方面的要求。本文僅研究其生物相容性，提出POM作為雙葉心臟瓣膜的可能，在后續的實驗中更應該考慮其疲勞耐磨以及綜合性能，更需必要的動物實驗和人體試驗進行驗證。
引言
在心臟瓣膜疾病的治療過程中，人工心臟瓣膜發揮著重要的作用，在人工心臟瓣膜發展的40年間已先后約有50余種人造瓣膜[1]應用于臨床，但人工心臟瓣膜仍未達到理想的水平。心臟瓣膜材料與結構對性能影響很大[2]，現在市場上大部分瓣膜瓣葉材料為低溫各向同性熱解碳(low temperature isotropic carbon,LTIC)，其具有與血液相近的密度、良好的自潤滑性能和生物相容性，但它生產成本高，污染大，難加工，材料本身比較脆，容易產生脆斷，直接影響心臟瓣膜的功能。
醫用聚甲醛(polyoxymethylene,POM)是隨著現代生物醫用高分子發展而出現的新材料[3]，具有較好的力學性能，用POM代替LTIC作為心臟瓣膜瓣葉材料不僅可以降低成本，而且還具有加工精度高和性能優異的特點。POM是一種綜合性能優良的工程塑料，具有高的力學性能，如強度、耐磨性、韌性、耐疲勞性、抗蠕變性和可加工性[4]。當醫用級別的POM與機體接觸，除要求具有相應的醫用功能外，還必須具備良好的血液相容性，避免凝血、血栓形成及溶血等不良反應，因此研究瓣葉材料血液相容性極為必要。POM作為醫用高分子材料較早應用于骨錨釘[5]、人工關節[6]等，其體內耐蠕變性能和血液相容性都得到了驗證，可以作為體內植入材料，也曾直接應用人工心臟瓣膜，比如Bjork-Shilcy(聚甲醛單葉瓣)[7]，當時由于材料性能及加工問題，瓣膜植入后產生疲勞磨損以致失效[8]，但其作為植入體的生物相容性得到了確認。最近幾年，POM的性能得到很大的改進，Chen等[9]通過摻雜低密度聚乙烯和乙烯丙烯酸，耐磨性能得到明顯提高，Zhao等[10]則通過添加多壁碳納米管，使POM結晶溫度和結晶速率增加，機械性能得到明顯提高。但目前關于POM的研究均未涉及其血液相容性，因此，利用POM作為雙葉心臟瓣膜瓣葉材料，需要對其血液相容性進一步探討。本文通過水接觸角測量、溶血實驗、凝血酶時間測定、血小板黏附實驗等對醫用POM材料進行了血液相容性評價，以促進對其應用于心臟瓣膜瓣葉可能性的認識。
1 材料與方法
1.1 樣品制備
實驗所需POM為廣東江門市新會區會城江峰棒材廠生產的聚甲醛板材，醫用級別。將板材加工成9 mm×9 mm的方形樣品，厚1.5 mm，在沸水中煮2 h，消除切削應力，然后經過砂紙打磨及拋光機拋光表面，最后依次用丙酮、無水乙醇超聲清洗3 min，再用雙蒸水超聲清洗兩次，每次5 min，干燥后貯存于干燥箱中備用。對比樣品取用316L不銹鋼(316L)和熱解碳(LTIC)(蘭州蘭飛醫療器械有限公司生產)。
1.2 材料及表征
1.2.1 水接觸角測量
利用液滴法測量材料表面的水接觸角，采用JY-82型接觸角測量儀，測試環境：溫度20 ℃，濕度45%，萬級超凈實驗室。
1.2.2 溶血實驗
溶血實驗即為檢測實驗材料對血液紅細胞的溶血作用。實驗過程嚴格按照ISO 10993-4標準規定的溶血實驗的具體操作步驟進行，實驗重復三次(n=4)，首先采用酶標儀測定540 nm波長處溶液的吸光度，然后根據吸光度計算樣品的溶血率。
1.2.3 凝血酶時間檢測
凝血酶時間檢測需要血漿凝血酶原時間(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)和血漿凝血酶時間(thrombin time,TT)測定。主要步驟： 將新鮮抗凝全血，在3 000 r/min轉速下離心10 min，取上層黃色液體得貧血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP)，用其浸泡樣品，然后在37 ℃水浴箱孵育30 min，所得血漿用APTT、PT、TT測定試劑盒進行檢測，用意大利Hospitex公司凝血儀記錄時間。
1.2.4 血小板黏附實驗
將新鮮抗凝全血在1 500 r/min轉速下離心15 min，取上層黃色液體得富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)，在樣品表面滴加50 μL PRP，然后在37 ℃水浴箱孵育0.5 h和2 h，用PBS溶液清洗三次，再用2.5%戊二醛溶液固定6 h以上，然后用50%、75%、90%和100%的無水乙醇(水為溶劑)分別脫水15 min，接著用50%、75%、90%和100%的乙酸異戊酯(無水乙醇為溶劑)溶液分別脫醇15 min，最后用CO2臨界點干燥樣品，干燥后用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察血小板的形態并拍照。另外，對上述用戊二醛固定的樣品，對血小板的膜骨架進行免疫熒光染色(染料為羅丹明123)，然后用400倍的顯微鏡對每個試驗樣品隨機拍10個視野，進行人工計數和統計處理[11]。
2 結果與討論
2.1 水接觸角
水接觸角是表征材料表面親疏水性的一種簡便方法，水接觸角的測定結果如圖 1所示。可見，316L不銹鋼表面的水接觸角約為70°，LTIC表面的水接觸角約為85°，POM樣品表面的水接觸角約為95°，為疏水材料，其趨勢是316L＜LTIC＜POM。
圖1
樣品表面的水接觸角
Figure1.
Water contact angle of sample surfaces
2.2 溶血率
316 L不銹鋼和LTIC分別作為生產血管支架、心臟瓣膜瓣葉的主要材料，其不溶血的性能早已被證實[12]，本次溶血實驗測得POM樣品溶血率平均為0.2%，均小于5%，離心后試管中紅細胞下沉，上清液變清無紅色，吸取少量含紅細胞的下層液進行顯微鏡下觀察，未發現紅細胞破裂現象，符合ISO10993-4標準的規定，材料溶血實驗檢測合格，可以作為血液接觸類生物材料[13]，表明POM植入體內不會導致紅細胞溶解和血紅蛋白釋放，不會引起急性溶血，具有良好的血液相容性。
2.3 凝血酶時間
PT和APTT測定是外源性和內源性凝血系統的過篩試驗，TT則主要檢測血漿纖維蛋白原的減少或抗凝物質的增多。結果如表 1所示，三種樣品的PT/TT無明顯差異，APTT檢測結果較正常血漿偏長，與316L和LTIC無明顯差異，POM具有和正常血漿一樣的凝血時間，不會引起外源性和內源性凝血。
表1
APTT/PT/TT結果
Table1.
Results of APTT/PT/TT
2.4 血小板實驗
圖 2為樣品表面黏附血小板的掃描電鏡照片。從血小板的形態看，三種樣品表面的血小板受到一定程度的激活，部分血小板明顯地伸出偽足；316L表面的血小板被激活程度較高，有明顯的偽足伸出，并且大部分血小板嚴重變形，在材料表面完全鋪展開；而LTIC和POM表面的血小板形態相對比較圓整，部分被激活，激活程度低于316L，兩者比較中，POM激活程度更低。從血小板的黏附數量看，孵育0.5 h血小板黏附數量相差不大，孵育2 h后POM的黏附數量較316L和LTIC少。
圖2
樣品表面血小板黏附的掃描電鏡圖(3 000×)
(a)、(d) 316L；(b)、(e) POM；(c)、(f) LTIC
Figure2. SEM images for the sample surfaces with platelet adhesion (3 000×)熒光染色結果如圖 3所示，孵育0.5 h血小板黏附數量相差不大，孵育2 h后POM的黏附數量較316L和LTIC少，與掃描電鏡結果一致。通過熒光染色照片對血小板的黏附數量進行統計分析，結果如圖 4所示。在0.5 h時，316L、POM和LTIC三種樣品表面的血小板黏附數量約為2 000 個/cm2，且無明顯差異；經過2 h的孵化后，三種樣品表面的血小板黏附數量明顯增多，316L表面血小板黏附數量約為10 000 個/cm2，LTCT和POM表面血小板黏附數量則約為7 000 個/cm2，316L表面的血小板黏附數量明顯多于LTCT和POM，與掃描電鏡結果一致。
圖3
不同樣品的免疫熒光圖片(400×)
(a)、(d) 316L；(b)、(e) POM；(c)、(f) LTIC
Figure3. Immunofluorescence images of different samples (400×)
圖4
樣品表面血小板的黏附數量
Figure4.
Adhesion amount of platelets on the samples
血小板黏附實驗結果表明：由于POM和LTIC表面血小板的黏附數量和被激活的程度均低于316L，因而它們具有優于316L的抗凝血效果并且POM具有和LTIC相似的抗凝血效果，可以用來植入體內。
3 結論
人工心臟瓣膜作為國家第三類醫療器械，對人體具有潛在危險，對其安全性、有效性必須嚴格控制，因此，瓣膜材料的選材尤為重要，在滿足瓣膜的基本功能要求外，必須首先滿足植入體內的血液相容性要求。良好的血液相容性是心臟瓣膜材料的必要特性，通過體外血液實驗研究表明：與316L和LTIC相比，POM具有疏水性，溶血率低，不會引起外源性和內源性凝血，具有與LTIC相近的血液相容性，可以作為植入器械植入人體。POM材料密度接近血液，血液流動過程中不會額外增加能量損失[14]。POM材料又具有良好的加工性能，雙葉機械瓣膜瓣葉結構復雜，但可以通過模具注塑加工或者數控機床加工用于雙葉機械心臟瓣膜的瓣葉，工藝相對簡單，成本低，因此POM材料具有應用于雙葉機械心臟瓣膜的潛力。
POM能夠做為植入醫療器械材料，其本身具有良好的血液相容性，后續還可以采用表面接枝改性、引入生物活性分子、表面涂層等進一步改善POM表面的血液相容性，使其具有更好的生物相容性[15]。實際上應用POM作為瓣葉材料，還要包括了對材料其它性能如物理、機械性能、化學穩定性、毒性、加工成型性等方面的要求。本文僅研究其生物相容性，提出POM作為雙葉心臟瓣膜的可能，在后續的實驗中更應該考慮其疲勞耐磨以及綜合性能，更需必要的動物實驗和人體試驗進行驗證。
