在微電極陣列植入的有創電生理實驗條件下,記錄大鼠麻醉過程中初級視覺皮層(V1)局部場電位(LFP),采用非線性動力學分析方法得到時間演化的復雜度變化曲線,并結合熱刺激甩尾延遲時間和心率兩項麻醉深度輔助判定指標,通過視覺刺激實驗驗證復雜度判定麻醉狀態的可靠性。實驗結果表明,麻醉過程中LFP的復雜度變化趨勢相似,在相同麻醉狀態下,視覺刺激前后大鼠初級視覺皮層響應LFP的復雜度差異不顯著;但是不同麻醉狀態下視覺刺激前后的LFP的復雜度具有顯著性差異,說明復雜度可以作為麻醉深度判定的指標。進一步利用優化方法得到判定麻醉深度的復雜度閾值,其可靠性和準確率較高,為開顱手術的患者臨床麻醉狀態檢測提供了有效的方法。
引用本文： 李曉媛, 師黎, 萬紅, 胡玉霞. 基于大鼠初級視覺皮層局部場電位的復雜度麻醉狀態監測及效果分析. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(2): 245-250. doi: 10.7507/1001-5515.20140046 復制
引言
有創的微電極陣列植入技術是動物神經電生理研究的主要手段，開顱手術過程中必須實施麻醉保證良好的操作條件，但是麻醉能夠改變大腦神經元的活動，不同的麻醉藥物和深度對手術順利進行、動物生理功能和信號采集有效性具有很大的影響[1]。為了獲得相對穩定的視覺刺激響應，選用高效的腦電(electroencephalogram,EEG)信號分析方法實現麻醉深度在線監測具有非常重要的臨床應用價值。
目前臨床上應用EEG信號進行麻醉深度監測主要采用從顱外頭皮表面無創記錄的EEG信號[2]，各種麻醉狀態監測的方法(如時域、頻域、時頻域、雙譜域、神經網絡以及非線性動力學等分析方法[3-4])都具有一定的適用范圍和缺陷。得到臨床應用的雙譜指數(bispectral index scale，BIS)[5]和Narcotrend指數[6]方法明顯依賴麻醉藥，對于藥物聯合使用無法起到預測作用，不能反映麻醉深度中的鎮痛成分。研究表明EEG活動顯示出非常復雜的非線性特性[7]，近年來發展起來的定量評價信號變化復雜性的復雜度(Lempel-ziv complexity，LZC)方法能有效地反映大腦在生理、病理和不同藥物作用下的非線性變化特征，且算法簡單，計算速度快，具有較好的抗干擾能力，許多研究運用復雜度分析進行臨床麻醉監控和大腦疾病診斷[8-11]方面的探索。但是上述文獻只定性闡述EEG的復雜度與麻醉深度的關系，沒有定量求出表征不同麻醉深度的復雜度閾值，缺乏臨床應用的基礎。另一方面，基于EEG非線性動力學分析麻醉深度的方法應用在臨床監控麻醉狀態效果并不令人滿意的原因主要由于EEG自身的特點所決定。首先EEG信號只反映大腦皮層不同區域功能活動的綜合，不反映皮層下組織的功能狀態，而后者才是對傷害性刺激的基本反射中樞，從而導致基于EEG分析的監測方法對某些傷害性刺激反映不敏感[12]；其次，EEG信號是頭皮表面綜合信息的反映，信號非常微弱，對噪聲影響敏感，常受到肌電活動的干擾；最后，EEG信號的頻帶通常在0~30 Hz，缺少適用于麻醉深度精確分析的高頻信息(如γ頻帶)，制約了基于的EEG的復雜度麻醉分析方法的應用[13]。
通過微電極植入技術記錄到的局部場電位(local field potential,LFP)信號是在顱骨下獲得的局部神經元突觸后電位的綜合，反映皮層下的腦功能活動，能有效對傷害性刺激做出反映。現在越來越多的研究表明LFP不易受肌電信號的影響，且具有適用于麻醉深度精確分析的高頻信息，能更精確地反映麻醉效果[14-15]。因此，在有創電極植入的電生理實驗中，利用LFP提取麻醉狀態特征能更有效地實現麻醉狀態的實時監控，并且為開顱手術患者的麻醉狀態監控提供了新思路，具有非常重要的科學研究和臨床實際應用價值。
鑒于上述原因和研究手段，本文提出一種基于LFP信號復雜度定量閾值分析的麻醉深度監測方法。首先，計算得到麻醉過程中大鼠視覺皮層V1區LFP信號的時間演化復雜度曲線，結合大鼠尾部熱刺激的甩尾延遲時間和心率輔助麻醉狀態判定標準進行麻醉過程狀態劃分。然后進行不同麻醉深度下各通道的相關性比較，確定合適的麻醉監控通道，并利用統計分析方法優化得出表示麻醉深度的復雜度閾值。結果表明LFP的復雜度很好地表征麻醉狀態變化趨勢，優化得到的復雜度閾值作為判定麻醉深度的指標可靠性和準確率較高，并且能夠滿足實時麻醉深度監測的要求，也為視覺刺激最佳時段和麻醉藥物補充時間的確定提供了有益的探索。
1 基于LFP的復雜度麻醉狀態分析
1.1 通道的選擇
為了選取合適的通道進行麻醉狀態監測，必須考察不同的麻醉狀態對多通道自發LFP信號的獨立性影響，采用互相關系數分析不同通道之間的相關性。Pearson互相關系數定義為
| $r=\frac{\sum\limits_{i=1}^{n}{\left( {{x}_{i}}-\bar{x} \right)\left( {{y}_{i}}-\bar{y} \right)}}{\sqrt{\sum\limits_{i=1}^{n}{{{\left( {{x}_{i}}-\bar{x} \right)}^{2}}\sum\limits_{i=1}^{n}{{{\left( {{y}_{i}}-\bar{y} \right)}^{2}}}}}}$ |
其中
1.2 LFP的復雜度分析
復雜度是一種非線性動力學分析方法，可以有效反映地EGT變化過程中的特征信息，揭示大腦在不同麻醉狀態下的活動變化規律。LZC分析[16]是基于粗粒化的方法，因其計算速度快非常適合麻醉深度評估等臨床實際應用。
首先將LFP信號按照一定的采樣率進行粗粒化，得到其二值化的時間序列P={s1，s2，…,sn}。分別定義S和Q為時間序列P的子串，SQ為S和Q的級聯，SQπ表示從SQ序列中刪掉最后一個字母，v(SQπ)表示SQπ的所有不同子串的集合，C(n)為序列P的復雜度，計算步驟如下：
(1) 數值初始化：C(n)=1，S=(s1)，Q=(s2),則SQπ=(s1)；
(2) 如果Q∈v(SQπ)，表示Q是SQπ的子串，S保持不變，待求序列的下一個字母級聯至Q，則Q=(s2,s3)；如果Q?v(SQπ)，那么Q不是SQπ的子串，表示產生一個新模式，S重新賦予S和Q的級聯，即S=SQ=(s1,s2)，將Q清空后賦予待求序列的下一個字母，Q=(s3)。同時，C(n)=C(n)+1；
(3) 重復過程(2)，判斷Q是否屬于v(SQπ)，直到Q取到待求序列P的最后一個字母；
C(n)表示將序列分成C(n)個不同的子串，對于任意(0,1)隨機序列，當n→∞，復雜度C(n)的最大邊界量為：
| $\underset{n\to \infty }{\mathop{\lim }}\,C\left( n \right)=b\left( n \right)=\frac{n}{{{\log }_{2}}n}$ |
為了獲得與序列長度無關的復雜度，對C(n)進行歸一化，得到標準的復雜測度LZC：
| $\text{LZC=}\frac{C\left( n \right)}{b\left( n \right)}$ |
該復雜度作為一種模型獨立的非線性測度，反映了任意序列隨時間產生新模式的速率。同時，LFP的復雜測度隨著信號的長度、采樣頻率和時間會發生變化[17]，當采樣數據達到足夠多時，復雜度趨于穩定值，為了提高計算速度，本文選取10 s的LFP信號作為一個片段計算LZC。
1.3 判定麻醉深度的LZC閾值優化
按照上述預處理方法記錄并計算麻醉全程LFP的復雜度LZC，為了能夠得到量化的判定麻醉深度的LZC閾值，首先隨機選取18只大鼠的重復實驗過程中的所有不同狀態的70%的LZC片段作為訓練樣本，針對不同麻醉狀態LZC分布，本文選取閾值r∈(0,1)，間隔Δr=0.2循環求解不同狀態的LZC統計學分布，優化選取最佳閾值ro，當LZC＞ro時，認為該時段動物處于淺麻狀態，否則處于深麻狀態。其余的30%LZC片段作為測試樣本，檢驗判定結果的準確性。
2 材料和方法
2.1 手術及準備
實驗動物選用視力較好的非白化Long Evans(LE)大鼠18只，體重(260±20) g，雌雄不拘，由河南省動物中心提供(許可證號SCXK(豫)2010-0002)，動物的實驗符合動物管理和使用委員會的各項規定。手術時首次按照4.0 mL/kg 腹腔注射10%的水合氯醛誘導麻醉[18]，縫制測試眼的眼線圈。將動物固定在立體定位儀上(ST-5ND-C，成都儀器)，用耳桿固定頭部，應用小動物監測系統(MouseSTAT-CO2，KENT)將大鼠體溫控制在37~38℃，連續監視心率(heart rate，HR)、血氧飽和度(oxyhemoglobin saturation，SpO2)和血流灌注指數(perfusion index，PI)等生理參數。根據LE大鼠腦定位圖譜(George Paxinos and Charles Watson，Compact sixth edition 2009)，確定V1區的中心位置(前囟Bregma向后7.08 mm，中心旁開2.5 mm)，用顱鉆開顱，利用體視顯微鏡(SZX7，Olympus)剝除硬腦膜，最后采用微型操作器(MX7600，Siskiyou)植入鉑銥合金材質的16通道Microprobe微電極陣列(MEA)，植入深度為350~600 μm。
2.2 LFP數據采集和視覺刺激
LFP信號采集采用美國Blackrock Microsystems公司生產的128通道Cerebus多通道神經信號采集系統，各通道電極阻抗為0.50~1.0 MΩ，放大器的頻率通帶為0.3~250 Hz，采樣頻率為2 kHz。為了去除工頻噪聲的干擾，采用了50 Hz工頻陷波濾波。
按照文獻[10]對麻醉過程的分段，結合尾部熱刺激甩尾時間(間隔5 min檢測一次，最長刺激時間10 s以防止大鼠組織受傷)和心率(間隔10 s)輔助標準[19-20]，將麻醉過程分成實驗前階段、誘導階段、麻醉持續階段和恢復階段。實驗前階段是指從完成電極植入手術后，大鼠甩尾延遲時間Ts＜5 s和心率HR＞380 beats/min時的大鼠接近清醒狀態的時間段；誘導階段為從加入微量泵注射麻醉藥(0.4 mL/kg/h)開始持續約持續10 min；麻醉持續階段為大鼠甩尾延遲時間Ts＞5 s和心率HR＜360 beats/min時的平穩麻醉階段；恢復階段為從停止微量泵注射麻藥到接近清醒的記錄時間段。LFP記錄和分析只包含誘導、持續和恢復三個階段，為了便于分析不同麻醉深度對視覺實驗的影響，本文將誘導和恢復階段合并記為淺麻階段；將麻醉持續階段定義為深麻階段。
為了研究不同麻醉深度對于視覺刺激響應的影響，LFP信號的采集包括自發EEG信號和視覺刺激誘發EEG信號。視覺刺激為單眼刺激，即暴露測試眼，遮蓋另一只眼進行視覺刺激實驗。視覺刺激圖像在LED顯示器(HM903DT，Eizo，亮度50 cd/m2，分辨率1 024×768，刷新率60 Hz)進行顯示。該顯示器置于大鼠測試眼正前方15 cm處，刺激范圍為60°×60°視角，視覺刺激的平均亮度為20 cd/m2，對比度為100 %。視覺刺激圖像采用運動的正弦光柵，時間頻率為4 Hz，包含12個方向(間隔30°，空間頻率為0.1 cpd)隨機出現，刺激1 s，灰屏間隔1 s，每組重復實驗20次。
2.3 統計分析
由于LFP信號不服從正態分布，本文用Kruskal-Wallis非參數檢驗方法分析不同麻醉階段組間復雜度LZC差異是否具有統計學差異。在顯著性水平條件下，如果不同麻醉階段組間復雜度LZC差異具有統計學差異，利用Mann-Whitney秩和檢驗進行多重比較，檢驗不同麻醉階段視覺刺激響應和自發響應組間復雜度LZC差異性，即P＜0.05為差異有統計學意義 。
3 實驗結果和討論
3.1 不同麻醉深度各通道LFP的相關性
為了實現麻醉狀態的有效實時監測必須選取合理的通道采集和分析LFP數據，首先進行各通道LFP預處理，挑選LFP基線在30 μV以內，波形正常的通道，再研究各通道LFP信號之間相關性，為優選分析通道提供依據。以第7通道為例，圖 1(a)和(b)分別為微量泵注射麻醉藥物后120~130 s(淺麻狀態)和1 600~1 610 s(深麻狀態)的自發LFP數據，當大鼠處于深麻狀態，大腦活動受到嚴重抑制，LFP呈現出低頻高幅的慢波；反之大鼠處在接近清醒或淺麻狀態時，大腦活躍性增強，低頻波被阻斷，呈現出高頻低幅的快波。圖 1(c)為兩種不同的麻醉狀態下各通道LFP的相關性，結果表明隨著麻醉深度的加深，各通道LFP之間的相關性增加，表明麻醉會抑制大腦的活動狀態，使得各神經元的活動趨于一致。在淺麻狀態下各通道LFP之間的相關性降低，表明大腦神經元活躍程度高。
圖1
V1區LFP數據的特性
(a)補充注射麻醉藥物后記錄的120~130 s原始LFP數據(淺麻狀態)；(b)記錄的1 600~1 610 s原始LFP數據(深麻狀態)；(c)在不同的麻醉狀態記錄的16個通道LFP之間的互相關性，灰度圖中只顯示不重復的兩通道之間的互相關特性
Figure1. Signal characteristics of neocortical local field potentials in V1 area(a) original LFP signals recorded 120-130 s data after injection chloral hydrate (in slight DOA)； (b) original LFP recorded 1 600-1 610 s data after injection chloral hydrate (in deepen DOA)； (c) Cross correlation of LFP recorded from 16 channels,each colorscale-coded matrix contains values obtained from non-redundant pairwise combinations of recording sites
進一步研究各通道隨時間演化的LFP復雜度變化曲線(見圖 2)之間的相關性，結果表明各通道隨時間演化的LFP復雜度變化趨勢的相關性明顯高于LFP自身的相關性，說明各通道LFP復雜度的變化趨勢相似，只要選取經過預處理LFP波形正常的一個通道進行麻醉狀態監控即可，各通道效果相似。
圖2
大鼠麻醉過程16個通道自發LFP的復雜度LZC變化曲線
Figure2.
The curve of complexity measure LZC of spontaneous LFPs for 16 channels during the process of anesthesia
3.2 麻醉全程自發LFP的復雜度隨時間演化過程
從完成電極植入手術后再次補充麻藥開始到大鼠接近清醒(甩尾延遲時間Ts＜5 s和心率HR＞380 beats/min)的麻醉全程，記錄16通道自發LFP信號，分析LZC隨時間的變化趨勢對于確定麻醉的狀態具有重要意義。圖 2為麻醉全程16通道LZC的時間演化過程，中間黑色粗線為16個通道的復雜度平均值，灰色區域為均方差。由圖可知當大鼠清醒或者處在淺麻狀態下，大腦神經元活躍，其復雜度LZC較大；反之大鼠處在深麻狀態，大腦神經元活動受到嚴重抑制，各通道神經元活動趨于一致，其復雜度LZC相應減小，這與文獻中利用EEG信號的復雜度監測麻醉狀態變化相似[10-11]。
實驗選取18只大鼠麻醉全程三種不同麻醉階段下共4 950個片段進行組間自發LFP的LZC的差異性統計分析，麻醉誘導、維持和恢復階段自發LFP的LZC平均值分別為0.52、0.24和0.64，Kruskal-Wallis方差檢驗P=0.021＜0.05，說明不同的麻醉階段對復雜度LZC具有顯著影響。進一步利用Mann-Whitney秩和檢驗不同麻醉階段組間復雜度LZC是否具有統計意義的差異，統計結果表明誘導和維持階段、恢復和維持階段組間復雜度LZC檢驗P＜0.05，而誘導和恢復階段組間復雜度LZC檢驗P＞0.05，說明深麻和淺麻狀態組間自發LFP的復雜度LZC具有顯著性差異，而淺麻狀態的不同階段組間自發LFP的復雜度LZC不具有顯著性差異。
3.3 麻醉深度對于視覺刺激實驗的影響
為了驗證復雜度分析在不同麻醉狀態下的檢測效果，我們設計視覺刺激實驗模式，分別在大鼠處于深麻(自發LFP的LZC的均值為0.24)和淺麻(自發LFP的LZC的均值為0.61)兩種狀態下進行視覺刺激實驗，實驗條件在2.2節詳述。針對18只大鼠分別在相同麻醉狀態下記錄自發和視覺刺激誘發的LFP信號，分別選取淺麻自發、淺麻刺激、深麻自發和深麻刺激4種條件下的LFP片段各180個，進行多重方差比較檢驗，如圖 3所示。大鼠在深麻狀態下，自發和視覺刺激響應的復雜度LZC沒有顯著性差異，且組均值差很小，為0.056；大鼠在淺麻狀態下自發和視覺刺激誘發的LFP信號復雜度沒有顯著性差異，組均值差達到0.23；但是深麻與淺麻狀態之間具有顯著性差異。上述分析說明深麻抑制視覺信息響應，阻礙皮層之間的信息交流，與神經生理學研究得到的麻醉損傷大腦大規模的信息集成的功能，破壞意識知覺的觀點一致[21-22]。雖然大鼠在淺麻狀態下自發和視覺刺激誘發LFP信號之間的復雜度沒有顯著性差異，但是組均差較大，說明在淺麻狀態下大鼠V1區神經元對視覺刺激的響應比較活躍，有利于提取視覺刺激的神經元特征，為視覺刺激實驗的數據采集和分析提供了可靠的依據。
圖3
不同麻醉深度下自發和刺激實驗LFP的復雜度LZC的方差統計
Figure3.
Variance analysis results of LZC between spontaneous LFP and evoked responses by visual stimulation under two different anesthesia states
3.4 表征不同麻醉深度的LZC閾值優化
從統計學分析可知，兩種麻醉狀態之間的復雜度具有顯著性差異，說明LZC的大小能較好地反映麻醉狀態的變化，雖然視覺刺激對LFP信號的復雜度有一定的影響，但是并不影響麻醉狀態的判定，關鍵的問題是確定表征不同麻醉深度的LZC準確的閾值，為麻醉在線監測提供可靠的判斷標準。
除去檢測的壞道和超出范圍的無效數據，共檢測記錄到4 950個片段信號。隨機選取18只大鼠在水合氯醛麻醉全程中約70%不同麻醉狀態下響應(共3 600個片段)作為訓練樣本，結合心率和熱刺激甩尾延時體征指標進行統計分析，圖 4為復雜度LZC訓練樣本在不同麻醉深度的分布統計，統計優化處理方法，選擇LZC的優化閾值。利用其余的數據作為測試樣本得到的統計結果如表 1所示，當分類LZC閾值時ro=0.32，兩種不同麻醉狀態分類效果均衡，達到最優麻醉狀態分類效果，淺麻和深麻狀態的識別正確率分別為92.5%和92.3%。
圖4
兩種麻醉狀態LFP訓練樣本復雜度的統計結果
Figure4.
Statistical results of LZC in two different anesthesia states
表1
18只大鼠麻醉過程中不同麻醉狀態下的性能指標的統計結果
Table1.
The statistical analysis of characteristic criterions in different anesthesia depths for 18 Long Evans rats
4 結論
綜合上述分析，復雜度是表征麻醉深度的一種直觀有效的方法。通過對18只LE實驗大鼠補充麻醉藥物后麻醉全程LFP的復雜度特征提取和統計分析，結果表明隨著麻醉深度的加深，各通道LFP的相似性增加，并且各通道麻醉狀態的轉變過程中隨時間演化的LZC呈現出相似的變化趨勢，表明LFP的復雜度LZC能夠有效地表征麻醉狀態。進一步通過設計全屏運動的正弦光柵視覺刺激實驗分析不同麻醉狀態對視覺刺激響應產生的影響，不同麻醉階段組間復雜度LZC具有統計學差異，但是相同麻醉狀態下視覺刺激與否組間復雜度LZC不具有統計學差異，表明視覺刺激并不影響麻醉狀態的分類。最后通過統計優化處理方法，找到合適的LZC閾值進行高效的麻醉深度監測，識別的正確率和有效性較好。
另外，V1區大部分神經元在視覺刺激下誘發的LFP的復雜度高于相同麻醉條件下自發LFP的復雜度，并且淺麻狀態下引起的LFP復雜度變化的差異性較大。上述分析說明深麻抑制視覺信息響應，阻礙皮層之間的信息交流，在淺麻狀態下大鼠V1區神經元對視覺刺激的響應比較活躍，有利于提取視覺刺激的神經元特征，為視覺刺激實驗的數據采集和分析時段的選取、麻醉藥物的補充時間提供了有效的依據，對保證研究視覺通路工作機理的電生理實驗條件的一致性具有重要意義。
本文使用的復雜度分析方法只對微電極陣列植入手術中水合氯醛麻醉藥物的應用做了檢驗，沒有比較和分析不同的麻醉藥物的狀態預測效果。該方法更適合進行腹腔注射全麻方式長期監測，對于臨床廣泛應用還需要進一步分析和研究。
引言
有創的微電極陣列植入技術是動物神經電生理研究的主要手段，開顱手術過程中必須實施麻醉保證良好的操作條件，但是麻醉能夠改變大腦神經元的活動，不同的麻醉藥物和深度對手術順利進行、動物生理功能和信號采集有效性具有很大的影響[1]。為了獲得相對穩定的視覺刺激響應，選用高效的腦電(electroencephalogram,EEG)信號分析方法實現麻醉深度在線監測具有非常重要的臨床應用價值。
目前臨床上應用EEG信號進行麻醉深度監測主要采用從顱外頭皮表面無創記錄的EEG信號[2]，各種麻醉狀態監測的方法(如時域、頻域、時頻域、雙譜域、神經網絡以及非線性動力學等分析方法[3-4])都具有一定的適用范圍和缺陷。得到臨床應用的雙譜指數(bispectral index scale，BIS)[5]和Narcotrend指數[6]方法明顯依賴麻醉藥，對于藥物聯合使用無法起到預測作用，不能反映麻醉深度中的鎮痛成分。研究表明EEG活動顯示出非常復雜的非線性特性[7]，近年來發展起來的定量評價信號變化復雜性的復雜度(Lempel-ziv complexity，LZC)方法能有效地反映大腦在生理、病理和不同藥物作用下的非線性變化特征，且算法簡單，計算速度快，具有較好的抗干擾能力，許多研究運用復雜度分析進行臨床麻醉監控和大腦疾病診斷[8-11]方面的探索。但是上述文獻只定性闡述EEG的復雜度與麻醉深度的關系，沒有定量求出表征不同麻醉深度的復雜度閾值，缺乏臨床應用的基礎。另一方面，基于EEG非線性動力學分析麻醉深度的方法應用在臨床監控麻醉狀態效果并不令人滿意的原因主要由于EEG自身的特點所決定。首先EEG信號只反映大腦皮層不同區域功能活動的綜合，不反映皮層下組織的功能狀態，而后者才是對傷害性刺激的基本反射中樞，從而導致基于EEG分析的監測方法對某些傷害性刺激反映不敏感[12]；其次，EEG信號是頭皮表面綜合信息的反映，信號非常微弱，對噪聲影響敏感，常受到肌電活動的干擾；最后，EEG信號的頻帶通常在0~30 Hz，缺少適用于麻醉深度精確分析的高頻信息(如γ頻帶)，制約了基于的EEG的復雜度麻醉分析方法的應用[13]。
通過微電極植入技術記錄到的局部場電位(local field potential,LFP)信號是在顱骨下獲得的局部神經元突觸后電位的綜合，反映皮層下的腦功能活動，能有效對傷害性刺激做出反映。現在越來越多的研究表明LFP不易受肌電信號的影響，且具有適用于麻醉深度精確分析的高頻信息，能更精確地反映麻醉效果[14-15]。因此，在有創電極植入的電生理實驗中，利用LFP提取麻醉狀態特征能更有效地實現麻醉狀態的實時監控，并且為開顱手術患者的麻醉狀態監控提供了新思路，具有非常重要的科學研究和臨床實際應用價值。
鑒于上述原因和研究手段，本文提出一種基于LFP信號復雜度定量閾值分析的麻醉深度監測方法。首先，計算得到麻醉過程中大鼠視覺皮層V1區LFP信號的時間演化復雜度曲線，結合大鼠尾部熱刺激的甩尾延遲時間和心率輔助麻醉狀態判定標準進行麻醉過程狀態劃分。然后進行不同麻醉深度下各通道的相關性比較，確定合適的麻醉監控通道，并利用統計分析方法優化得出表示麻醉深度的復雜度閾值。結果表明LFP的復雜度很好地表征麻醉狀態變化趨勢，優化得到的復雜度閾值作為判定麻醉深度的指標可靠性和準確率較高，并且能夠滿足實時麻醉深度監測的要求，也為視覺刺激最佳時段和麻醉藥物補充時間的確定提供了有益的探索。
1 基于LFP的復雜度麻醉狀態分析
1.1 通道的選擇
為了選取合適的通道進行麻醉狀態監測，必須考察不同的麻醉狀態對多通道自發LFP信號的獨立性影響，采用互相關系數分析不同通道之間的相關性。Pearson互相關系數定義為
| $r=\frac{\sum\limits_{i=1}^{n}{\left( {{x}_{i}}-\bar{x} \right)\left( {{y}_{i}}-\bar{y} \right)}}{\sqrt{\sum\limits_{i=1}^{n}{{{\left( {{x}_{i}}-\bar{x} \right)}^{2}}\sum\limits_{i=1}^{n}{{{\left( {{y}_{i}}-\bar{y} \right)}^{2}}}}}}$ |
其中
1.2 LFP的復雜度分析
復雜度是一種非線性動力學分析方法，可以有效反映地EGT變化過程中的特征信息，揭示大腦在不同麻醉狀態下的活動變化規律。LZC分析[16]是基于粗粒化的方法，因其計算速度快非常適合麻醉深度評估等臨床實際應用。
首先將LFP信號按照一定的采樣率進行粗粒化，得到其二值化的時間序列P={s1，s2，…,sn}。分別定義S和Q為時間序列P的子串，SQ為S和Q的級聯，SQπ表示從SQ序列中刪掉最后一個字母，v(SQπ)表示SQπ的所有不同子串的集合，C(n)為序列P的復雜度，計算步驟如下：
(1) 數值初始化：C(n)=1，S=(s1)，Q=(s2),則SQπ=(s1)；
(2) 如果Q∈v(SQπ)，表示Q是SQπ的子串，S保持不變，待求序列的下一個字母級聯至Q，則Q=(s2,s3)；如果Q?v(SQπ)，那么Q不是SQπ的子串，表示產生一個新模式，S重新賦予S和Q的級聯，即S=SQ=(s1,s2)，將Q清空后賦予待求序列的下一個字母，Q=(s3)。同時，C(n)=C(n)+1；
(3) 重復過程(2)，判斷Q是否屬于v(SQπ)，直到Q取到待求序列P的最后一個字母；
C(n)表示將序列分成C(n)個不同的子串，對于任意(0,1)隨機序列，當n→∞，復雜度C(n)的最大邊界量為：
| $\underset{n\to \infty }{\mathop{\lim }}\,C\left( n \right)=b\left( n \right)=\frac{n}{{{\log }_{2}}n}$ |
為了獲得與序列長度無關的復雜度，對C(n)進行歸一化，得到標準的復雜測度LZC：
| $\text{LZC=}\frac{C\left( n \right)}{b\left( n \right)}$ |
該復雜度作為一種模型獨立的非線性測度，反映了任意序列隨時間產生新模式的速率。同時，LFP的復雜測度隨著信號的長度、采樣頻率和時間會發生變化[17]，當采樣數據達到足夠多時，復雜度趨于穩定值，為了提高計算速度，本文選取10 s的LFP信號作為一個片段計算LZC。
1.3 判定麻醉深度的LZC閾值優化
按照上述預處理方法記錄并計算麻醉全程LFP的復雜度LZC，為了能夠得到量化的判定麻醉深度的LZC閾值，首先隨機選取18只大鼠的重復實驗過程中的所有不同狀態的70%的LZC片段作為訓練樣本，針對不同麻醉狀態LZC分布，本文選取閾值r∈(0,1)，間隔Δr=0.2循環求解不同狀態的LZC統計學分布，優化選取最佳閾值ro，當LZC＞ro時，認為該時段動物處于淺麻狀態，否則處于深麻狀態。其余的30%LZC片段作為測試樣本，檢驗判定結果的準確性。
2 材料和方法
2.1 手術及準備
實驗動物選用視力較好的非白化Long Evans(LE)大鼠18只，體重(260±20) g，雌雄不拘，由河南省動物中心提供(許可證號SCXK(豫)2010-0002)，動物的實驗符合動物管理和使用委員會的各項規定。手術時首次按照4.0 mL/kg 腹腔注射10%的水合氯醛誘導麻醉[18]，縫制測試眼的眼線圈。將動物固定在立體定位儀上(ST-5ND-C，成都儀器)，用耳桿固定頭部，應用小動物監測系統(MouseSTAT-CO2，KENT)將大鼠體溫控制在37~38℃，連續監視心率(heart rate，HR)、血氧飽和度(oxyhemoglobin saturation，SpO2)和血流灌注指數(perfusion index，PI)等生理參數。根據LE大鼠腦定位圖譜(George Paxinos and Charles Watson，Compact sixth edition 2009)，確定V1區的中心位置(前囟Bregma向后7.08 mm，中心旁開2.5 mm)，用顱鉆開顱，利用體視顯微鏡(SZX7，Olympus)剝除硬腦膜，最后采用微型操作器(MX7600，Siskiyou)植入鉑銥合金材質的16通道Microprobe微電極陣列(MEA)，植入深度為350~600 μm。
2.2 LFP數據采集和視覺刺激
LFP信號采集采用美國Blackrock Microsystems公司生產的128通道Cerebus多通道神經信號采集系統，各通道電極阻抗為0.50~1.0 MΩ，放大器的頻率通帶為0.3~250 Hz，采樣頻率為2 kHz。為了去除工頻噪聲的干擾，采用了50 Hz工頻陷波濾波。
按照文獻[10]對麻醉過程的分段，結合尾部熱刺激甩尾時間(間隔5 min檢測一次，最長刺激時間10 s以防止大鼠組織受傷)和心率(間隔10 s)輔助標準[19-20]，將麻醉過程分成實驗前階段、誘導階段、麻醉持續階段和恢復階段。實驗前階段是指從完成電極植入手術后，大鼠甩尾延遲時間Ts＜5 s和心率HR＞380 beats/min時的大鼠接近清醒狀態的時間段；誘導階段為從加入微量泵注射麻醉藥(0.4 mL/kg/h)開始持續約持續10 min；麻醉持續階段為大鼠甩尾延遲時間Ts＞5 s和心率HR＜360 beats/min時的平穩麻醉階段；恢復階段為從停止微量泵注射麻藥到接近清醒的記錄時間段。LFP記錄和分析只包含誘導、持續和恢復三個階段，為了便于分析不同麻醉深度對視覺實驗的影響，本文將誘導和恢復階段合并記為淺麻階段；將麻醉持續階段定義為深麻階段。
為了研究不同麻醉深度對于視覺刺激響應的影響，LFP信號的采集包括自發EEG信號和視覺刺激誘發EEG信號。視覺刺激為單眼刺激，即暴露測試眼，遮蓋另一只眼進行視覺刺激實驗。視覺刺激圖像在LED顯示器(HM903DT，Eizo，亮度50 cd/m2，分辨率1 024×768，刷新率60 Hz)進行顯示。該顯示器置于大鼠測試眼正前方15 cm處，刺激范圍為60°×60°視角，視覺刺激的平均亮度為20 cd/m2，對比度為100 %。視覺刺激圖像采用運動的正弦光柵，時間頻率為4 Hz，包含12個方向(間隔30°，空間頻率為0.1 cpd)隨機出現，刺激1 s，灰屏間隔1 s，每組重復實驗20次。
2.3 統計分析
由于LFP信號不服從正態分布，本文用Kruskal-Wallis非參數檢驗方法分析不同麻醉階段組間復雜度LZC差異是否具有統計學差異。在顯著性水平條件下，如果不同麻醉階段組間復雜度LZC差異具有統計學差異，利用Mann-Whitney秩和檢驗進行多重比較，檢驗不同麻醉階段視覺刺激響應和自發響應組間復雜度LZC差異性，即P＜0.05為差異有統計學意義 。
3 實驗結果和討論
3.1 不同麻醉深度各通道LFP的相關性
為了實現麻醉狀態的有效實時監測必須選取合理的通道采集和分析LFP數據，首先進行各通道LFP預處理，挑選LFP基線在30 μV以內，波形正常的通道，再研究各通道LFP信號之間相關性，為優選分析通道提供依據。以第7通道為例，圖 1(a)和(b)分別為微量泵注射麻醉藥物后120~130 s(淺麻狀態)和1 600~1 610 s(深麻狀態)的自發LFP數據，當大鼠處于深麻狀態，大腦活動受到嚴重抑制，LFP呈現出低頻高幅的慢波；反之大鼠處在接近清醒或淺麻狀態時，大腦活躍性增強，低頻波被阻斷，呈現出高頻低幅的快波。圖 1(c)為兩種不同的麻醉狀態下各通道LFP的相關性，結果表明隨著麻醉深度的加深，各通道LFP之間的相關性增加，表明麻醉會抑制大腦的活動狀態，使得各神經元的活動趨于一致。在淺麻狀態下各通道LFP之間的相關性降低，表明大腦神經元活躍程度高。
圖1
V1區LFP數據的特性
(a)補充注射麻醉藥物后記錄的120~130 s原始LFP數據(淺麻狀態)；(b)記錄的1 600~1 610 s原始LFP數據(深麻狀態)；(c)在不同的麻醉狀態記錄的16個通道LFP之間的互相關性，灰度圖中只顯示不重復的兩通道之間的互相關特性
Figure1. Signal characteristics of neocortical local field potentials in V1 area(a) original LFP signals recorded 120-130 s data after injection chloral hydrate (in slight DOA)； (b) original LFP recorded 1 600-1 610 s data after injection chloral hydrate (in deepen DOA)； (c) Cross correlation of LFP recorded from 16 channels,each colorscale-coded matrix contains values obtained from non-redundant pairwise combinations of recording sites
進一步研究各通道隨時間演化的LFP復雜度變化曲線(見圖 2)之間的相關性，結果表明各通道隨時間演化的LFP復雜度變化趨勢的相關性明顯高于LFP自身的相關性，說明各通道LFP復雜度的變化趨勢相似，只要選取經過預處理LFP波形正常的一個通道進行麻醉狀態監控即可，各通道效果相似。
圖2
大鼠麻醉過程16個通道自發LFP的復雜度LZC變化曲線
Figure2.
The curve of complexity measure LZC of spontaneous LFPs for 16 channels during the process of anesthesia
3.2 麻醉全程自發LFP的復雜度隨時間演化過程
從完成電極植入手術后再次補充麻藥開始到大鼠接近清醒(甩尾延遲時間Ts＜5 s和心率HR＞380 beats/min)的麻醉全程，記錄16通道自發LFP信號，分析LZC隨時間的變化趨勢對于確定麻醉的狀態具有重要意義。圖 2為麻醉全程16通道LZC的時間演化過程，中間黑色粗線為16個通道的復雜度平均值，灰色區域為均方差。由圖可知當大鼠清醒或者處在淺麻狀態下，大腦神經元活躍，其復雜度LZC較大；反之大鼠處在深麻狀態，大腦神經元活動受到嚴重抑制，各通道神經元活動趨于一致，其復雜度LZC相應減小，這與文獻中利用EEG信號的復雜度監測麻醉狀態變化相似[10-11]。
實驗選取18只大鼠麻醉全程三種不同麻醉階段下共4 950個片段進行組間自發LFP的LZC的差異性統計分析，麻醉誘導、維持和恢復階段自發LFP的LZC平均值分別為0.52、0.24和0.64，Kruskal-Wallis方差檢驗P=0.021＜0.05，說明不同的麻醉階段對復雜度LZC具有顯著影響。進一步利用Mann-Whitney秩和檢驗不同麻醉階段組間復雜度LZC是否具有統計意義的差異，統計結果表明誘導和維持階段、恢復和維持階段組間復雜度LZC檢驗P＜0.05，而誘導和恢復階段組間復雜度LZC檢驗P＞0.05，說明深麻和淺麻狀態組間自發LFP的復雜度LZC具有顯著性差異，而淺麻狀態的不同階段組間自發LFP的復雜度LZC不具有顯著性差異。
3.3 麻醉深度對于視覺刺激實驗的影響
為了驗證復雜度分析在不同麻醉狀態下的檢測效果，我們設計視覺刺激實驗模式，分別在大鼠處于深麻(自發LFP的LZC的均值為0.24)和淺麻(自發LFP的LZC的均值為0.61)兩種狀態下進行視覺刺激實驗，實驗條件在2.2節詳述。針對18只大鼠分別在相同麻醉狀態下記錄自發和視覺刺激誘發的LFP信號，分別選取淺麻自發、淺麻刺激、深麻自發和深麻刺激4種條件下的LFP片段各180個，進行多重方差比較檢驗，如圖 3所示。大鼠在深麻狀態下，自發和視覺刺激響應的復雜度LZC沒有顯著性差異，且組均值差很小，為0.056；大鼠在淺麻狀態下自發和視覺刺激誘發的LFP信號復雜度沒有顯著性差異，組均值差達到0.23；但是深麻與淺麻狀態之間具有顯著性差異。上述分析說明深麻抑制視覺信息響應，阻礙皮層之間的信息交流，與神經生理學研究得到的麻醉損傷大腦大規模的信息集成的功能，破壞意識知覺的觀點一致[21-22]。雖然大鼠在淺麻狀態下自發和視覺刺激誘發LFP信號之間的復雜度沒有顯著性差異，但是組均差較大，說明在淺麻狀態下大鼠V1區神經元對視覺刺激的響應比較活躍，有利于提取視覺刺激的神經元特征，為視覺刺激實驗的數據采集和分析提供了可靠的依據。
圖3
不同麻醉深度下自發和刺激實驗LFP的復雜度LZC的方差統計
Figure3.
Variance analysis results of LZC between spontaneous LFP and evoked responses by visual stimulation under two different anesthesia states
3.4 表征不同麻醉深度的LZC閾值優化
從統計學分析可知，兩種麻醉狀態之間的復雜度具有顯著性差異，說明LZC的大小能較好地反映麻醉狀態的變化，雖然視覺刺激對LFP信號的復雜度有一定的影響，但是并不影響麻醉狀態的判定，關鍵的問題是確定表征不同麻醉深度的LZC準確的閾值，為麻醉在線監測提供可靠的判斷標準。
除去檢測的壞道和超出范圍的無效數據，共檢測記錄到4 950個片段信號。隨機選取18只大鼠在水合氯醛麻醉全程中約70%不同麻醉狀態下響應(共3 600個片段)作為訓練樣本，結合心率和熱刺激甩尾延時體征指標進行統計分析，圖 4為復雜度LZC訓練樣本在不同麻醉深度的分布統計，統計優化處理方法，選擇LZC的優化閾值。利用其余的數據作為測試樣本得到的統計結果如表 1所示，當分類LZC閾值時ro=0.32，兩種不同麻醉狀態分類效果均衡，達到最優麻醉狀態分類效果，淺麻和深麻狀態的識別正確率分別為92.5%和92.3%。
圖4
兩種麻醉狀態LFP訓練樣本復雜度的統計結果
Figure4.
Statistical results of LZC in two different anesthesia states
表1
18只大鼠麻醉過程中不同麻醉狀態下的性能指標的統計結果
Table1.
The statistical analysis of characteristic criterions in different anesthesia depths for 18 Long Evans rats
4 結論
綜合上述分析，復雜度是表征麻醉深度的一種直觀有效的方法。通過對18只LE實驗大鼠補充麻醉藥物后麻醉全程LFP的復雜度特征提取和統計分析，結果表明隨著麻醉深度的加深，各通道LFP的相似性增加，并且各通道麻醉狀態的轉變過程中隨時間演化的LZC呈現出相似的變化趨勢，表明LFP的復雜度LZC能夠有效地表征麻醉狀態。進一步通過設計全屏運動的正弦光柵視覺刺激實驗分析不同麻醉狀態對視覺刺激響應產生的影響，不同麻醉階段組間復雜度LZC具有統計學差異，但是相同麻醉狀態下視覺刺激與否組間復雜度LZC不具有統計學差異，表明視覺刺激并不影響麻醉狀態的分類。最后通過統計優化處理方法，找到合適的LZC閾值進行高效的麻醉深度監測，識別的正確率和有效性較好。
另外，V1區大部分神經元在視覺刺激下誘發的LFP的復雜度高于相同麻醉條件下自發LFP的復雜度，并且淺麻狀態下引起的LFP復雜度變化的差異性較大。上述分析說明深麻抑制視覺信息響應，阻礙皮層之間的信息交流，在淺麻狀態下大鼠V1區神經元對視覺刺激的響應比較活躍，有利于提取視覺刺激的神經元特征，為視覺刺激實驗的數據采集和分析時段的選取、麻醉藥物的補充時間提供了有效的依據，對保證研究視覺通路工作機理的電生理實驗條件的一致性具有重要意義。
本文使用的復雜度分析方法只對微電極陣列植入手術中水合氯醛麻醉藥物的應用做了檢驗，沒有比較和分析不同的麻醉藥物的狀態預測效果。該方法更適合進行腹腔注射全麻方式長期監測，對于臨床廣泛應用還需要進一步分析和研究。
