目前關于糖尿病視網膜病變（DR）發病機制有多種觀點，主要包括高糖所致視網膜微環境改變、糖基化終末產物形成、氧化應激損傷、炎癥反應、促血管新生因子產生等。這些機制產生的共同通路是導致視網膜出現神經退行性病變及微血管損傷。近年來，細胞再生療法在疾病的修復作用過程中起到越來越重要的作用。不同種類的干細胞對于視網膜均有神經及血管保護作用，但是作用的靶點側重點不同。干細胞既可以通過旁分泌產生營養因子起到調節視網膜微環境及保護視網膜神經細胞的作用，又可以通過潛在的免疫調節來減少免疫損傷，還可以通過再生功能向受損傷的細胞定向分化。結合以上特點，干細胞顯示了對DR的修復潛能，這種基于干細胞的再生療法對于臨床的應用提供了前期依據。但是在干細胞移植過程中，關于干細胞的異質性、細胞傳送、向受損傷組織有效的歸巢及移植仍是細胞療法的難題。
引用本文： 曹博雯, 孟旭霞. 不同類型的干細胞在糖尿病視網膜病變中的作用研究進展. 中華眼底病雜志, 2018, 34(4): 415-421. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.04.026 復制
目前對于糖尿病視網膜病變（DR）的治療手段主要有激光光凝、玻璃體腔注射抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物和玻璃體切割手術，均以延緩或阻止持續的退行性病變為治療目的，而不是針對該疾病的發病機制展開治療。近年來，包括細胞特異性內生干細胞、內皮祖細胞（EPCs）、胚胎干細胞（ESC）、誘導多功能干細胞（iPSC）及間充質干細胞（MSCs）在內的細胞再生療法在臨床前期的疾病治療研究中占據著越來越重要的地位。不同種類的干細胞對于視網膜均有神經及血管保護作用，但是作用的靶點側重點不同。了解不同種類干細胞在DR中的作用，有利于干細胞再生療法在DR臨床治療研究中的應用開展。現針對不同類別的干細胞在DR中的作用作一綜述。
1 DR的發病機制
視網膜是體內代謝活動最活躍的組織，它的這種高代謝率需要一個結構和功能完整的血管系統及血管周圍起到支撐和營養作用的神經系統支撐。眼動脈20%的血液供應到視網膜，視網膜中央動脈又分支成密集的毛細血管網組成血視網膜屏障（BRB）。這種高度選擇性的屏障由相互接壤的內皮細胞連接及內皮細胞外包繞的周細胞和膠質細胞組成，周細胞和膠質細胞可以根據視網膜內層的代謝負荷來調節血流。高度敏感的神經視網膜依賴這種控制氧化和小血管多余產能，所以一旦視網膜產生缺血而致組織灌注受損，受影響區域的神經元就會立即死亡[1]。DR作為一種視網膜缺血性病變，亦將產生上述病變過程，最終導致無細胞毛細血管區域形成、視網膜神經元的死亡、繼發性炎癥反應以及代償性新生血管所致的視網膜損傷[2-8]。
DR歷來被視為血管性疾病，或者更具體的來說，是一種視網膜內層微血管性的血管內皮細胞疾病。然而近年來，越來越多的研究認為，糖尿病相關的神經退行性病變的出現要明顯早于內皮細胞的改變[9-14]。這就揭示了DR其實是一種神經血管退行性疾病。
1.1 糖尿病誘導視網膜神經退行性病變
DR不僅僅是一種單獨的血管病變，視網膜神經元和神經膠質細胞也在整個疾病的進展過程中扮演著極其重要的地位。神經膠質細胞功能異常與視網膜病變是相關的。在視網膜出現血管病變之前，已經有可見的視網膜神經退行性病變出現，即神經細胞凋亡和膠質細胞活化，目前二者被認為是DR的重要組織學特征。神經元細胞位于視網膜的最內層，是糖尿病相關凋亡過程發生最早的部位。最近的研究證明，DR早期的神經視網膜即存在促凋亡和促生長信號的不平衡[9]。視網膜星形膠質細胞和Müller細胞參與膠質細胞活化。糖尿病同樣與小膠質細胞活化有關，小膠質細胞是位于視網膜內層的自身監控免疫細胞，可以釋放化學因子促進神經細胞死亡[10]。此外由于新陳代謝的加劇惡化而導致的高糖血癥和活性氧（ROS）產物的增加會影響視網膜神經細胞的功能和活性[11-13]。過量的ROS產物會導致一些生物分子，如脂質、蛋白質、DNA的氧化性損傷。視網膜神經節細胞和膠質細胞對氧化應激誘導的損傷尤為敏感，從而導致這些細胞較早產生凋亡[14]。視網膜神經保護因子水平也明顯減少，進一步加速神經元死亡[11-13]。
神經退行性病變的確在DR發生發展中起重要作用，值得注意的是Müller細胞在此過程中產生的一些因子可以調節血流、血管通透性及細胞存活，且該細胞圍繞在視網膜的整個血管外周，因此對于BRB也起到保護作用[15]。除了Müller細胞外，與血管相鄰的小膠質細胞的活化同樣對血管退行性病變起到重要作用，血管退行性病變是動物模型或糖尿病患者的早期糖尿病視網膜血管病變的一個標志性特征[16, 17]。由此可見，DR中神經退行性病變與血管病變存在一定的關聯。
1.2 糖尿病誘導視網膜微血管病變
視網膜功能的正常維持，需要完整的血管壁及BRB。BRB由內皮細胞之間的連接、基底膜及血管外的周細胞組成。在糖尿病中，長期的高糖環境會導致內皮細胞、周細胞及血管平滑肌細胞的功能紊亂及死亡，內皮細胞及周細胞自我更新能力受損，它們的再生能力也被耗盡，BRB最終遭到破壞。在糖尿病患者及大鼠模型中可以觀察到內皮細胞死亡出現在沒有任何視網膜組織病理學改變之前，最終導致毛細血管幻影的出現[18]。糖尿病中高糖和缺氧的環境使得內皮細胞的增生率要比在正常環境下高，最終導致復制性衰老（一種不可逆的細胞周期阻滯）[19]。
除內皮細胞受損外，周細胞丟失也是DR的一個早期特征。視網膜血管處周細胞的缺失是先于其他血管病變的一個引發因素。動物實驗表明，在糖尿病2個月時可出現周細胞的缺失，而在6個月時才可觀察到無細胞毛細血管的形成[20]。周細胞的缺失會削弱BRB的功能且會導致毛細血管的不穩定和血管的滲透性增加。
此外，細胞旁路的微血管成分受損對于BRB的破壞同樣是不可或缺的原因之一。BRB之間的緊密連接也參與維持血管通透性，它可以有效阻止細胞與細胞之間的物質轉運等細胞旁路的血管通透性增加。一些緊密連接蛋白參與維持BRB的形成[21]。體內外研究發現，緊密連接蛋白的磷酸化作用及血管通透性受到一些激酶和磷酸酶調節，血管通透性的增加與閉合蛋白的磷酸化活化增加、閉合蛋白數量的減少有關[22]。表明閉合蛋白的磷酸化可造成其在緊密連接蛋白復合體中的缺失，造成細胞旁通透性增加[23]。最終導致血管中的大分子物質從視網膜血管滲漏到視網膜細胞間隙，形成脂質滲出，造成視力下降。
2 DR治療
目前針對DR尚無有效的治療，所以預防顯得尤為重要。嚴格的血糖、膽固醇控制及戒煙對于疾病的進展提供了保護性作用[24, 25]。非增生期DR以微動脈瘤、硬性滲出、棉絨斑、毛細血管無灌注區形成以及視網膜內微血管異常為特征。當這些病變進展到威脅視力的黃斑水腫及增生期DR時，可以采用激光光凝，破壞周圍視網膜，從而減少供氧需求。但是激光治療會出現一定的并發癥，如視敏度下降、中央視網膜增厚、視野縮小等。抗VEGF藥物及玻璃體切割手術也是臨床應用較為成熟的方法，但都不以提高視力為治療目的，且都存在眼內炎、牽拉性視網膜脫離等相應并發癥。目前尚無促進受損視網膜血管再生的療法。然而，最近對MSCs、EPCs和脂肪基質干細胞（ASCs）的研究表明，細胞療法可能是預防神經血管損傷并促進損傷的視網膜再生的可行性選擇[26-28]。
3 不同類型的干細胞及其在DR中的作用
3.1 MSCs
MSCs是多功能基質細胞，最初來源于骨髓，后來從脂肪組織、胎盤、臍帶血、華通氏膠、牙髓、心肌和肝臟中也可分離得到。MSCs在體外培養時，表達表面標志物CD105、CD73、基質抗原1、CD44、CD90、CD166、CD54和CD49，但是缺乏造血干細胞（CD14、CD45、CD11a）的標志物、紅細胞標志物（血型糖蛋白A）和血小板標志物（CD31）。MSCs具有自我更新和分化的功能，主要分化為中胚層來源的組織，但也可分化為內胚層和外胚層的組織[29, 30]。近年來研究發現，MSCs可能成為疾病治療和組織替代方面的最佳療法，已經提出至少三種潛在的作用機制。
首先，體內外研究均表明，MSCs最重要的作用就是具有旁分泌營養的作用。這些細胞可以分泌神經營養因子和血管生成因子，比如睫狀生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、VEGF、轉化生長因子（TGF）-β，DR所造成的缺氧環境可能具有加速旁分泌因子生成的作用。一項動物實驗研究發現，玻璃體腔注射胎盤源性MSCs可明顯抑制鏈脲佐菌素誘導的糖尿病鼠的視網膜神經細胞凋亡，這可能是由于玻璃體腔局部注射所導致的視網膜內的神經保護因子密度增加[31]。
其次，這些細胞具有向受損組織分化的能力，但是其分化的能力是有限的，因為細胞具有多向分化能力而不是特異性向某種類型的細胞分化。已有報道指出，MSCs可以分化為肌源性成分及內皮細胞[32]。在糖尿病神經病變的動物模型中，骨髓來源的MSCs可以直接調節血管再生和周圍神經髓鞘的形成[33]。這些干細胞首先移位到周圍神經系統但是沒有分化為神經元。因此，直接的組織替代可能不是這些細胞在退行性病變中的主要修復機制。MSCs在老年性黃斑變性及視網膜色素變性等退行性病變中具有支撐和替代受損的神經視網膜的作用。通過局部或全身注射骨髓或脂肪來源的MSCs于糖尿病動物模型體內，MSCs可以分化為光感受器細胞及神經色素上皮細胞[34-36]。但目前尚不清楚所觀察到的這種現象是干細胞直接分化為受損的細胞還是干細胞與已經存在的光感受器細胞的融合。雖有很多機制尚未闡明，但MSCs的確延緩了糖尿病視網膜神經退行性病變且具有視力保護的作用。
最后，MSCs是免疫調節細胞，具有免疫調節功能。它可以抑制在體的單核細胞向巨噬細胞分化；增加抗炎因子白細胞介素（IL）-10的水平，降低促炎因子IL-12和干擾素-γ的水平，抑制殺傷性T細胞的增生，增加調節性T細胞（T-reg）的數量，從而形成一個免疫耐受的環境[26, 29, 30]。MSCs對于糖尿病進展的易感性可能與T-reg的免疫調節活性有關，因此MSCs治療糖尿病的潛在機制主要是通過釋放營養和免疫調節因子來保護血管細胞[26, 37]。然而這個假想是否合理還有待進一步觀察研究。但是，MSCs的確可以暫時性逆轉非肥胖性糖尿病（NOD）小鼠的高血糖水平，而NOD骨髓來源的MSCs則不具有這種功能，可能是因為NOD小鼠的長期高血糖已經導致骨髓微環境發生了變化，其產生的干細胞存在功能受損的情況[38]。
盡管MSCs對視網膜神經血管具體保護機制尚不清楚，但其好處是顯而易見的。目前正在進行Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗觀察它們對DR等缺血性視網膜病變的視力影響[39]。
3.2 EPCs
EPCs代表一種細胞異質性群體，它的來源較為廣泛，大部分來源于促血管生成的造血細胞，也可以來源于造血干細胞和祖細胞[40, 41]。EPCs于1997年被首次闡明，該研究表明從人外周血中分離得到的CD34+細胞，在體外實驗中可以分化為內皮細胞，而體內實驗中可參與新生血管的形成[42]。通常把人類外周血中具有陽性干細胞表面標志[CD34、VEGF受體2和（或）CD133]的單核細胞定義為EPCs。從外周血中分離出的EPCs有兩種主要亞型，它們具有一些共同的表面標志物，如CD34、CD131和激酶結構域受體[43, 44]。第一種亞型是內皮集落形成細胞，它可以直接整合到成熟的血管，形成內皮細胞層來參與損傷血管的修復[45, 46]，也可以分泌血管修復所需的旁分泌因子[47]。另外一種亞型是內皮細胞集落形成單位，它只能以旁分泌的方式發揮作用，比如釋放生長因子刺激受損區域的血管EPCs形成血管壁[41, 48]。外周血中循環的EPCs數量和血管再生能力在疾病的不同階段是不同的，如在伴有糖尿病、高血脂、高血壓或吸煙等這些危險因素的心臟病患者中，外周血EPCs數量減少，功能特性也發生變化[49]。
目前，EPCs已經作為一種潛在療法應用于臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期非眼部缺血性疾病的臨床試驗研究，包括缺血性心肌病、周圍缺血病變、腦血管意外等[50]。EPCs與其他分化成熟的內皮細胞相比，具有更強的抗氧化應激能力[51]。這也就提示直接將血管祖細胞移植到受損的血管內皮部位可以導致組織再生。此外，EPCs還具有旁分泌營養的功能，它可以分泌促血管生成因子（VEGF、干細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1、成纖維細胞生長因子-2、肝細胞生長因子）和神經營養因子，已經發現在糖尿病神經病變中具有治療意義[52]。它還可通過旁分泌作用阻止氧化應激所導致的成熟內皮細胞凋亡[53]。大量有說服力的研究表明，EPCs可以改善周邊缺血部位的血液灌注[42, 54-56]。體內研究發現，人iPSC可以分化為血管EPCs，進而整合到受損的內皮細胞[54]；成體干細胞及人類ESC來源的成血管細胞被證明具有內皮細胞功能[55]。骨髓來源的EPCs移植導致供體來源的內皮細胞參與血管壁的形成，說明循環血細胞可以參與內皮細胞損傷的修復[56]。這些存在于循環血中的少量細胞，也就是EPCs，能夠遷移到缺血部位并整合至活躍的血管生成區域[42]。
在糖尿病中，視網膜內微血管異常包含很多內皮細胞，這種現象可能是由缺血性視網膜為促進血管新生所導致。盡管糖尿病視網膜血管的再生是減少的，但這種疾病的慢性進展性的特點為代償性血管的再生提供了條件。如果有成功針對視網膜血管再生的靶向療法，就有可能消除DR引起的視網膜缺血。
CD34+細胞已經作為一種潛在療法在DR及缺血再灌注等缺血性視網膜病變的小鼠模型中應用[57]。全身或玻璃體腔局部注射外周血或骨髓來源的CD34+ EPCs可以導致這些細胞快速歸巢到受損的視網膜血管處。盡管移植率低，但是觀察發現，通過單次靜脈注射，這些細胞可以整合到視網膜血管長達6個月之久[58]。EPCs對于受損視網膜血管的修復作用是很明顯的，這就揭示EPCs具有治療作用，且尚未發現不良反應。
早期DR以血管退行性病變為其主要標志，糖尿病環境可以產生大量的ROS產物，血管祖細胞就會產生病理性因子（腫瘤壞死因子-α、IL-8），增加病理性的誘導型NO合酶而非內皮型NO合酶的表達[27]。內皮型NO合酶活性的下降或者通過上調還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶導致的ROS水平增加都可導致糖尿病環境下EPCs的NO生物活性下降[59]。NO介導的信號通路對于骨髓來源的EPCs動員及向受損血管的歸巢具有重要作用；同樣，在晚期DR患者中發現，盡管其循環血中的CD34+ EPCs要比對照組多，這些細胞在遷移、整合及形成血管方面的能力是有缺陷的[60]。盡管有這些缺點，細胞療法對晚期DR及其他缺血性視網膜病變仍然是一種有效的選擇。細胞療法主要是針對早中期DR進行治療，它可以促進血管修復、逆轉缺血、減少缺氧或炎癥信號，進而阻止向晚期和不可逆轉的視力損害期進展[27]。因此，EPCs在DR治療中是有前景的，但仍需克服上述存在的問題。
3.3 ASCs
具有MSCs和EPCs共同特性的祖細胞是從一類成體組織類型中分離出來的，其中ASCs就是一類這樣的祖細胞，從脂肪組織中分離而來。目前，ASCs在DR中的作用研究受到越來越多的關注。在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病鼠模型中，靜脈注射ASCs，血糖水平可在1周后顯著降低，BRB完整性得以改善。從脂肪組織中分離出的CD34+細胞可以抑制內皮細胞凋亡、穩定血管，且認為其來源于周細胞[61, 62]。在Akimba糖尿病小鼠中，靜脈注射的ASCs可以整合到視網膜血管中，抑制內皮細胞凋亡及減少約80%的毛細血管丟失，且可以通過TGF-b1的治療加速ASCs來源的周細胞表型（與視網膜本身的周細胞相似）形成，獲得周細胞定位，使得ASCs治療更加有效[63]。
有研究發現，ACSs在視網膜上表達視紫紅質和膠質原纖維酸性蛋白質，暗示了供體細胞向光感受器細胞和膠質樣細胞分化[64]。將ASCs靜脈注射到Ⅰ型免疫缺陷的糖尿病鼠體內可以改善視網膜電圖，從而提供一個神經保護作用[28]。綜上，ASCs不僅可以降低血糖還可以起到神經血管保護作用，但是其對神經及血管病變的修復作用到底是由于血糖降低引起視網膜微環境改善還是ASCs直接替代受損組織尚不清楚。進一步研究表明，糖尿病模型鼠玻璃體腔注射ASCs來源的營養因子在穩定血管及保護視網膜細胞免受糖尿病環境影響起著關鍵作用。以上臨床前期研究為下一步ASCs作為DR中毛細血管缺失及神經退行性病變的一種臨床治療提供有力的依據。
3.4 多功能干細胞
多能干細胞具有分化成熟為任何一種細胞的能力。iPSC主要來源于ESC。ESC來源的視網膜祖細胞具有向光感受器細胞整合及分化的能力[65]。研究表明，視網膜退行性病變小鼠模型在注射ESC以后，視力得到提高[65, 66]。在糖尿病中，視網膜色素上皮（RPE）層的緊密連接受損導致RPE屏障破壞，這表明RPE細胞替代療法在DR的治療中同樣很重要[67, 68]。
近年來研究發現，CD34+臍帶血細胞來源的iPSC可以產生血管祖細胞[69]。這些iPSC是通過高水平的VEGF干預后被刺激分化為CD34+/CD146+的血管祖細胞[70]。然而通過不同的移植途徑，血管祖細胞存在的位置是不同的。NOD/非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷小鼠模型中，示蹤發現血管祖細胞移位至無細胞毛細血管外的周細胞部位；當經過靜脈注射后，它們整合到血管管腔的內皮細胞部位，證明它們具有分化為內皮細胞的潛能[58]。
iPSC的應用為臍帶血中CD34+細胞治療無細胞毛細血管的再生提供了一種可行的療法。在分化過程中，iPSC可能會表現出一些表觀遺傳學改變，這些改變是基于糖尿病代謝記憶產生的，因此尋找一種不受糖尿病環境影響的自體iPSC對于DR的輔助治療十分重要。
4 總結與展望
干細胞在延緩DR的進程、減輕DR的癥狀方面具有潛在的治療意義。目前，對于干細胞治療DR的研究主要側重于視網膜早期病變，即在增生期DR出現之前。一些類型的干細胞分泌特殊的生長因子，進而對糖尿病的視網膜產生神經保護作用；另外一些類型的干細胞，可以減少及修復毛細血管閉塞、減少周細胞的缺失，可以向周細胞及內皮細胞分化，從而對DR中受損的血管產生保護作用。ESC和iPSC同樣可以產生具有再生能力的干細胞，加速向糖尿病中受損的視網膜細胞分化。但上述研究中的干細胞都是異體來源，若取自糖尿病本身骨髓、脂肪等組織來源的干細胞，由于這些細胞長期受糖尿病環境的影響，所處的微環境已經發生變化，在修復視網膜損傷時，功能較正常環境來源的干細胞明顯削弱。目前一些研究傾向于誘導糖尿病來源的祖細胞恢復正常功能，為實現自體療法提供可能。
干細胞療法在DR血管和神經元損害中均具有再生和修復的潛能。接下來，對干細胞再生的分子機制進一步研究可為治療DR等缺血性視網膜病變提供新的藥理及遺傳學方法，同時還可加強現有干細胞療法的治療效果。
目前對于糖尿病視網膜病變（DR）的治療手段主要有激光光凝、玻璃體腔注射抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物和玻璃體切割手術，均以延緩或阻止持續的退行性病變為治療目的，而不是針對該疾病的發病機制展開治療。近年來，包括細胞特異性內生干細胞、內皮祖細胞（EPCs）、胚胎干細胞（ESC）、誘導多功能干細胞（iPSC）及間充質干細胞（MSCs）在內的細胞再生療法在臨床前期的疾病治療研究中占據著越來越重要的地位。不同種類的干細胞對于視網膜均有神經及血管保護作用，但是作用的靶點側重點不同。了解不同種類干細胞在DR中的作用，有利于干細胞再生療法在DR臨床治療研究中的應用開展。現針對不同類別的干細胞在DR中的作用作一綜述。
1 DR的發病機制
視網膜是體內代謝活動最活躍的組織，它的這種高代謝率需要一個結構和功能完整的血管系統及血管周圍起到支撐和營養作用的神經系統支撐。眼動脈20%的血液供應到視網膜，視網膜中央動脈又分支成密集的毛細血管網組成血視網膜屏障（BRB）。這種高度選擇性的屏障由相互接壤的內皮細胞連接及內皮細胞外包繞的周細胞和膠質細胞組成，周細胞和膠質細胞可以根據視網膜內層的代謝負荷來調節血流。高度敏感的神經視網膜依賴這種控制氧化和小血管多余產能，所以一旦視網膜產生缺血而致組織灌注受損，受影響區域的神經元就會立即死亡[1]。DR作為一種視網膜缺血性病變，亦將產生上述病變過程，最終導致無細胞毛細血管區域形成、視網膜神經元的死亡、繼發性炎癥反應以及代償性新生血管所致的視網膜損傷[2-8]。
DR歷來被視為血管性疾病，或者更具體的來說，是一種視網膜內層微血管性的血管內皮細胞疾病。然而近年來，越來越多的研究認為，糖尿病相關的神經退行性病變的出現要明顯早于內皮細胞的改變[9-14]。這就揭示了DR其實是一種神經血管退行性疾病。
1.1 糖尿病誘導視網膜神經退行性病變
DR不僅僅是一種單獨的血管病變，視網膜神經元和神經膠質細胞也在整個疾病的進展過程中扮演著極其重要的地位。神經膠質細胞功能異常與視網膜病變是相關的。在視網膜出現血管病變之前，已經有可見的視網膜神經退行性病變出現，即神經細胞凋亡和膠質細胞活化，目前二者被認為是DR的重要組織學特征。神經元細胞位于視網膜的最內層，是糖尿病相關凋亡過程發生最早的部位。最近的研究證明，DR早期的神經視網膜即存在促凋亡和促生長信號的不平衡[9]。視網膜星形膠質細胞和Müller細胞參與膠質細胞活化。糖尿病同樣與小膠質細胞活化有關，小膠質細胞是位于視網膜內層的自身監控免疫細胞，可以釋放化學因子促進神經細胞死亡[10]。此外由于新陳代謝的加劇惡化而導致的高糖血癥和活性氧（ROS）產物的增加會影響視網膜神經細胞的功能和活性[11-13]。過量的ROS產物會導致一些生物分子，如脂質、蛋白質、DNA的氧化性損傷。視網膜神經節細胞和膠質細胞對氧化應激誘導的損傷尤為敏感，從而導致這些細胞較早產生凋亡[14]。視網膜神經保護因子水平也明顯減少，進一步加速神經元死亡[11-13]。
神經退行性病變的確在DR發生發展中起重要作用，值得注意的是Müller細胞在此過程中產生的一些因子可以調節血流、血管通透性及細胞存活，且該細胞圍繞在視網膜的整個血管外周，因此對于BRB也起到保護作用[15]。除了Müller細胞外，與血管相鄰的小膠質細胞的活化同樣對血管退行性病變起到重要作用，血管退行性病變是動物模型或糖尿病患者的早期糖尿病視網膜血管病變的一個標志性特征[16, 17]。由此可見，DR中神經退行性病變與血管病變存在一定的關聯。
1.2 糖尿病誘導視網膜微血管病變
視網膜功能的正常維持，需要完整的血管壁及BRB。BRB由內皮細胞之間的連接、基底膜及血管外的周細胞組成。在糖尿病中，長期的高糖環境會導致內皮細胞、周細胞及血管平滑肌細胞的功能紊亂及死亡，內皮細胞及周細胞自我更新能力受損，它們的再生能力也被耗盡，BRB最終遭到破壞。在糖尿病患者及大鼠模型中可以觀察到內皮細胞死亡出現在沒有任何視網膜組織病理學改變之前，最終導致毛細血管幻影的出現[18]。糖尿病中高糖和缺氧的環境使得內皮細胞的增生率要比在正常環境下高，最終導致復制性衰老（一種不可逆的細胞周期阻滯）[19]。
除內皮細胞受損外，周細胞丟失也是DR的一個早期特征。視網膜血管處周細胞的缺失是先于其他血管病變的一個引發因素。動物實驗表明，在糖尿病2個月時可出現周細胞的缺失，而在6個月時才可觀察到無細胞毛細血管的形成[20]。周細胞的缺失會削弱BRB的功能且會導致毛細血管的不穩定和血管的滲透性增加。
此外，細胞旁路的微血管成分受損對于BRB的破壞同樣是不可或缺的原因之一。BRB之間的緊密連接也參與維持血管通透性，它可以有效阻止細胞與細胞之間的物質轉運等細胞旁路的血管通透性增加。一些緊密連接蛋白參與維持BRB的形成[21]。體內外研究發現，緊密連接蛋白的磷酸化作用及血管通透性受到一些激酶和磷酸酶調節，血管通透性的增加與閉合蛋白的磷酸化活化增加、閉合蛋白數量的減少有關[22]。表明閉合蛋白的磷酸化可造成其在緊密連接蛋白復合體中的缺失，造成細胞旁通透性增加[23]。最終導致血管中的大分子物質從視網膜血管滲漏到視網膜細胞間隙，形成脂質滲出，造成視力下降。
2 DR治療
目前針對DR尚無有效的治療，所以預防顯得尤為重要。嚴格的血糖、膽固醇控制及戒煙對于疾病的進展提供了保護性作用[24, 25]。非增生期DR以微動脈瘤、硬性滲出、棉絨斑、毛細血管無灌注區形成以及視網膜內微血管異常為特征。當這些病變進展到威脅視力的黃斑水腫及增生期DR時，可以采用激光光凝，破壞周圍視網膜，從而減少供氧需求。但是激光治療會出現一定的并發癥，如視敏度下降、中央視網膜增厚、視野縮小等。抗VEGF藥物及玻璃體切割手術也是臨床應用較為成熟的方法，但都不以提高視力為治療目的，且都存在眼內炎、牽拉性視網膜脫離等相應并發癥。目前尚無促進受損視網膜血管再生的療法。然而，最近對MSCs、EPCs和脂肪基質干細胞（ASCs）的研究表明，細胞療法可能是預防神經血管損傷并促進損傷的視網膜再生的可行性選擇[26-28]。
3 不同類型的干細胞及其在DR中的作用
3.1 MSCs
MSCs是多功能基質細胞，最初來源于骨髓，后來從脂肪組織、胎盤、臍帶血、華通氏膠、牙髓、心肌和肝臟中也可分離得到。MSCs在體外培養時，表達表面標志物CD105、CD73、基質抗原1、CD44、CD90、CD166、CD54和CD49，但是缺乏造血干細胞（CD14、CD45、CD11a）的標志物、紅細胞標志物（血型糖蛋白A）和血小板標志物（CD31）。MSCs具有自我更新和分化的功能，主要分化為中胚層來源的組織，但也可分化為內胚層和外胚層的組織[29, 30]。近年來研究發現，MSCs可能成為疾病治療和組織替代方面的最佳療法，已經提出至少三種潛在的作用機制。
首先，體內外研究均表明，MSCs最重要的作用就是具有旁分泌營養的作用。這些細胞可以分泌神經營養因子和血管生成因子，比如睫狀生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、VEGF、轉化生長因子（TGF）-β，DR所造成的缺氧環境可能具有加速旁分泌因子生成的作用。一項動物實驗研究發現，玻璃體腔注射胎盤源性MSCs可明顯抑制鏈脲佐菌素誘導的糖尿病鼠的視網膜神經細胞凋亡，這可能是由于玻璃體腔局部注射所導致的視網膜內的神經保護因子密度增加[31]。
其次，這些細胞具有向受損組織分化的能力，但是其分化的能力是有限的，因為細胞具有多向分化能力而不是特異性向某種類型的細胞分化。已有報道指出，MSCs可以分化為肌源性成分及內皮細胞[32]。在糖尿病神經病變的動物模型中，骨髓來源的MSCs可以直接調節血管再生和周圍神經髓鞘的形成[33]。這些干細胞首先移位到周圍神經系統但是沒有分化為神經元。因此，直接的組織替代可能不是這些細胞在退行性病變中的主要修復機制。MSCs在老年性黃斑變性及視網膜色素變性等退行性病變中具有支撐和替代受損的神經視網膜的作用。通過局部或全身注射骨髓或脂肪來源的MSCs于糖尿病動物模型體內，MSCs可以分化為光感受器細胞及神經色素上皮細胞[34-36]。但目前尚不清楚所觀察到的這種現象是干細胞直接分化為受損的細胞還是干細胞與已經存在的光感受器細胞的融合。雖有很多機制尚未闡明，但MSCs的確延緩了糖尿病視網膜神經退行性病變且具有視力保護的作用。
最后，MSCs是免疫調節細胞，具有免疫調節功能。它可以抑制在體的單核細胞向巨噬細胞分化；增加抗炎因子白細胞介素（IL）-10的水平，降低促炎因子IL-12和干擾素-γ的水平，抑制殺傷性T細胞的增生，增加調節性T細胞（T-reg）的數量，從而形成一個免疫耐受的環境[26, 29, 30]。MSCs對于糖尿病進展的易感性可能與T-reg的免疫調節活性有關，因此MSCs治療糖尿病的潛在機制主要是通過釋放營養和免疫調節因子來保護血管細胞[26, 37]。然而這個假想是否合理還有待進一步觀察研究。但是，MSCs的確可以暫時性逆轉非肥胖性糖尿病（NOD）小鼠的高血糖水平，而NOD骨髓來源的MSCs則不具有這種功能，可能是因為NOD小鼠的長期高血糖已經導致骨髓微環境發生了變化，其產生的干細胞存在功能受損的情況[38]。
盡管MSCs對視網膜神經血管具體保護機制尚不清楚，但其好處是顯而易見的。目前正在進行Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗觀察它們對DR等缺血性視網膜病變的視力影響[39]。
3.2 EPCs
EPCs代表一種細胞異質性群體，它的來源較為廣泛，大部分來源于促血管生成的造血細胞，也可以來源于造血干細胞和祖細胞[40, 41]。EPCs于1997年被首次闡明，該研究表明從人外周血中分離得到的CD34+細胞，在體外實驗中可以分化為內皮細胞，而體內實驗中可參與新生血管的形成[42]。通常把人類外周血中具有陽性干細胞表面標志[CD34、VEGF受體2和（或）CD133]的單核細胞定義為EPCs。從外周血中分離出的EPCs有兩種主要亞型，它們具有一些共同的表面標志物，如CD34、CD131和激酶結構域受體[43, 44]。第一種亞型是內皮集落形成細胞，它可以直接整合到成熟的血管，形成內皮細胞層來參與損傷血管的修復[45, 46]，也可以分泌血管修復所需的旁分泌因子[47]。另外一種亞型是內皮細胞集落形成單位，它只能以旁分泌的方式發揮作用，比如釋放生長因子刺激受損區域的血管EPCs形成血管壁[41, 48]。外周血中循環的EPCs數量和血管再生能力在疾病的不同階段是不同的，如在伴有糖尿病、高血脂、高血壓或吸煙等這些危險因素的心臟病患者中，外周血EPCs數量減少，功能特性也發生變化[49]。
目前，EPCs已經作為一種潛在療法應用于臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期非眼部缺血性疾病的臨床試驗研究，包括缺血性心肌病、周圍缺血病變、腦血管意外等[50]。EPCs與其他分化成熟的內皮細胞相比，具有更強的抗氧化應激能力[51]。這也就提示直接將血管祖細胞移植到受損的血管內皮部位可以導致組織再生。此外，EPCs還具有旁分泌營養的功能，它可以分泌促血管生成因子（VEGF、干細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1、成纖維細胞生長因子-2、肝細胞生長因子）和神經營養因子，已經發現在糖尿病神經病變中具有治療意義[52]。它還可通過旁分泌作用阻止氧化應激所導致的成熟內皮細胞凋亡[53]。大量有說服力的研究表明，EPCs可以改善周邊缺血部位的血液灌注[42, 54-56]。體內研究發現，人iPSC可以分化為血管EPCs，進而整合到受損的內皮細胞[54]；成體干細胞及人類ESC來源的成血管細胞被證明具有內皮細胞功能[55]。骨髓來源的EPCs移植導致供體來源的內皮細胞參與血管壁的形成，說明循環血細胞可以參與內皮細胞損傷的修復[56]。這些存在于循環血中的少量細胞，也就是EPCs，能夠遷移到缺血部位并整合至活躍的血管生成區域[42]。
在糖尿病中，視網膜內微血管異常包含很多內皮細胞，這種現象可能是由缺血性視網膜為促進血管新生所導致。盡管糖尿病視網膜血管的再生是減少的，但這種疾病的慢性進展性的特點為代償性血管的再生提供了條件。如果有成功針對視網膜血管再生的靶向療法，就有可能消除DR引起的視網膜缺血。
CD34+細胞已經作為一種潛在療法在DR及缺血再灌注等缺血性視網膜病變的小鼠模型中應用[57]。全身或玻璃體腔局部注射外周血或骨髓來源的CD34+ EPCs可以導致這些細胞快速歸巢到受損的視網膜血管處。盡管移植率低，但是觀察發現，通過單次靜脈注射，這些細胞可以整合到視網膜血管長達6個月之久[58]。EPCs對于受損視網膜血管的修復作用是很明顯的，這就揭示EPCs具有治療作用，且尚未發現不良反應。
早期DR以血管退行性病變為其主要標志，糖尿病環境可以產生大量的ROS產物，血管祖細胞就會產生病理性因子（腫瘤壞死因子-α、IL-8），增加病理性的誘導型NO合酶而非內皮型NO合酶的表達[27]。內皮型NO合酶活性的下降或者通過上調還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶導致的ROS水平增加都可導致糖尿病環境下EPCs的NO生物活性下降[59]。NO介導的信號通路對于骨髓來源的EPCs動員及向受損血管的歸巢具有重要作用；同樣，在晚期DR患者中發現，盡管其循環血中的CD34+ EPCs要比對照組多，這些細胞在遷移、整合及形成血管方面的能力是有缺陷的[60]。盡管有這些缺點，細胞療法對晚期DR及其他缺血性視網膜病變仍然是一種有效的選擇。細胞療法主要是針對早中期DR進行治療，它可以促進血管修復、逆轉缺血、減少缺氧或炎癥信號，進而阻止向晚期和不可逆轉的視力損害期進展[27]。因此，EPCs在DR治療中是有前景的，但仍需克服上述存在的問題。
3.3 ASCs
具有MSCs和EPCs共同特性的祖細胞是從一類成體組織類型中分離出來的，其中ASCs就是一類這樣的祖細胞，從脂肪組織中分離而來。目前，ASCs在DR中的作用研究受到越來越多的關注。在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病鼠模型中，靜脈注射ASCs，血糖水平可在1周后顯著降低，BRB完整性得以改善。從脂肪組織中分離出的CD34+細胞可以抑制內皮細胞凋亡、穩定血管，且認為其來源于周細胞[61, 62]。在Akimba糖尿病小鼠中，靜脈注射的ASCs可以整合到視網膜血管中，抑制內皮細胞凋亡及減少約80%的毛細血管丟失，且可以通過TGF-b1的治療加速ASCs來源的周細胞表型（與視網膜本身的周細胞相似）形成，獲得周細胞定位，使得ASCs治療更加有效[63]。
有研究發現，ACSs在視網膜上表達視紫紅質和膠質原纖維酸性蛋白質，暗示了供體細胞向光感受器細胞和膠質樣細胞分化[64]。將ASCs靜脈注射到Ⅰ型免疫缺陷的糖尿病鼠體內可以改善視網膜電圖，從而提供一個神經保護作用[28]。綜上，ASCs不僅可以降低血糖還可以起到神經血管保護作用，但是其對神經及血管病變的修復作用到底是由于血糖降低引起視網膜微環境改善還是ASCs直接替代受損組織尚不清楚。進一步研究表明，糖尿病模型鼠玻璃體腔注射ASCs來源的營養因子在穩定血管及保護視網膜細胞免受糖尿病環境影響起著關鍵作用。以上臨床前期研究為下一步ASCs作為DR中毛細血管缺失及神經退行性病變的一種臨床治療提供有力的依據。
3.4 多功能干細胞
多能干細胞具有分化成熟為任何一種細胞的能力。iPSC主要來源于ESC。ESC來源的視網膜祖細胞具有向光感受器細胞整合及分化的能力[65]。研究表明，視網膜退行性病變小鼠模型在注射ESC以后，視力得到提高[65, 66]。在糖尿病中，視網膜色素上皮（RPE）層的緊密連接受損導致RPE屏障破壞，這表明RPE細胞替代療法在DR的治療中同樣很重要[67, 68]。
近年來研究發現，CD34+臍帶血細胞來源的iPSC可以產生血管祖細胞[69]。這些iPSC是通過高水平的VEGF干預后被刺激分化為CD34+/CD146+的血管祖細胞[70]。然而通過不同的移植途徑，血管祖細胞存在的位置是不同的。NOD/非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷小鼠模型中，示蹤發現血管祖細胞移位至無細胞毛細血管外的周細胞部位；當經過靜脈注射后，它們整合到血管管腔的內皮細胞部位，證明它們具有分化為內皮細胞的潛能[58]。
iPSC的應用為臍帶血中CD34+細胞治療無細胞毛細血管的再生提供了一種可行的療法。在分化過程中，iPSC可能會表現出一些表觀遺傳學改變，這些改變是基于糖尿病代謝記憶產生的，因此尋找一種不受糖尿病環境影響的自體iPSC對于DR的輔助治療十分重要。
4 總結與展望
干細胞在延緩DR的進程、減輕DR的癥狀方面具有潛在的治療意義。目前，對于干細胞治療DR的研究主要側重于視網膜早期病變，即在增生期DR出現之前。一些類型的干細胞分泌特殊的生長因子，進而對糖尿病的視網膜產生神經保護作用；另外一些類型的干細胞，可以減少及修復毛細血管閉塞、減少周細胞的缺失，可以向周細胞及內皮細胞分化，從而對DR中受損的血管產生保護作用。ESC和iPSC同樣可以產生具有再生能力的干細胞，加速向糖尿病中受損的視網膜細胞分化。但上述研究中的干細胞都是異體來源，若取自糖尿病本身骨髓、脂肪等組織來源的干細胞，由于這些細胞長期受糖尿病環境的影響，所處的微環境已經發生變化，在修復視網膜損傷時，功能較正常環境來源的干細胞明顯削弱。目前一些研究傾向于誘導糖尿病來源的祖細胞恢復正常功能，為實現自體療法提供可能。
干細胞療法在DR血管和神經元損害中均具有再生和修復的潛能。接下來，對干細胞再生的分子機制進一步研究可為治療DR等缺血性視網膜病變提供新的藥理及遺傳學方法，同時還可加強現有干細胞療法的治療效果。