Stargardt病(STGD)是一種原發于視網膜色素上皮的遺傳性眼病。目前普遍認同的有3個基因突變與其發病有關，分別是三磷酸腺苷結合轉運子(Abca4)、超長鏈脂肪酸延伸酶4(Elovl4)及細胞表面標志物Prominin-1(Prom1)。通過人為基因敲除的方法已經獲得了Abca4-/-、Elovl4-/-及Prom1-/-3種小鼠作為研究STGD的動物模型。基因治療所用的轉基因載體有慢病毒、腺相關病毒(AAV)和納米顆粒等，小鼠動物模型經治療后視網膜功能恢復明顯。在動物實驗的基礎上，目前STGD基因治療已經進入Ⅰ/Ⅱa期臨床試驗，所用的馬傳染性貧血慢病毒載體對人體的安全性和療效的研究正在進行中。同時，重組AAV2/5、雙鏈或雜交AAV等更加安全的新型大容量AAV載體的研究也已取得了一些進展。STGD基因治療展現出繼Leber先天性黑矇基因治療取得成功之后遺傳性視網膜疾病基因治療領域又一縷令人期許的曙光。
引用本文： 何穎, 戴旭鋒, 張華, 龐繼景. Stargardt病基因治療研究現狀與進展. 中華眼底病雜志, 2016, 32(2): 224-227. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.02.029 復制
Stargardt病(STGD)又稱Stargardt黃斑營養不良，基因檢測發現其絕大多數存在三磷酸腺苷(ATP)結合轉運子(Abca4)基因突變[1]。典型的STGD為雙眼黃斑部出現對稱的牛眼或靶心狀外觀的萎縮性改變，常伴有眼底黃色斑點，目前尚無特殊藥物和手術措施干預其病理改變及進程[2]。基因治療通過替代或糾正自身基因結構或功能上的錯亂，從而改善造成疾病的病理基礎，延緩細胞凋亡，并維持一定程度的生理功能[3]。眼球局部因其獨特的解剖結構和免疫赦免優勢，是最適合進行基因治療的器官。現就STGD基因治療研究現狀與進展綜述如下。
1 STGD相關的致病基因及其功能
目前認為Abca4、超長鏈脂肪酸延伸酶4(Elovl4)和細胞表面標志物Prominin-1(Prom1) 這3個基因突變與STGD相關，其中Abca4基因是最主要的致病基因，所占比例超過95%[1, 4-7]。視網膜ABCA4蛋白在視循環中負責將維生素A的中間產物N-亞視黃基-磷脂酰乙醇胺從錐體細胞外節盤膜轉運到外節胞質中，Abca4基因突變將導致編碼ATP結合轉運蛋白異常，上述中間產物堆積并轉化成具有細胞毒性的脂褐素成分，從而引起視網膜色素上皮(RPE)細胞的死亡和錐體細胞的功能喪失[8]。
Elovl4基因負責編碼一種酶，協助食物中的脂肪酸轉化為能融入細胞膜的形式。突變使該酶從內質網異位到細胞質，阻斷了光感受器細胞中極長鏈脂肪酸的合成[9]。Rotstein等[10]研究發現，超長鏈脂肪酸對氧化應激損傷有保護作用，推測由Elovl4基因突變造成的STGD可能與超長鏈脂肪酸的合成減少有關。
Prom1基因參與細胞的增生、分化和凋亡等過程，通過與膽固醇結合，主要在細胞的頂端質膜組織中發揮作用；在錐體細胞中，該基因表達的蛋白產物，可能通過與光感受器特異性的原鈣粘蛋白21以及肌動蛋白纖維相互作用，參與光感受器外節盤膜的形成[5]。Prom1由于基因的R373C發生錯義突變，從而使多肽鏈的氨基酸種類和序列發生改變，這種新發現的致病基因可引起3種不同類型顯性遺傳的STGD [5]。
2 STGD基因治療的動物實驗研究
2.1 STGD相關致病基因的動物模型
Abca4-/-、Elovl4-/-及Prom1-/-小鼠等STGD動物模型均是通過人為基因敲除方法獲得，這些敲除小鼠經檢測被證實存在上述特定的基因缺陷[2, 5, 11-15]。
對這3種基因敲除小鼠視網膜的研究有助于了解疾病的病理機制，為制定合理的治療方案提供基礎。Abca4-/-小鼠是Abca4基因敲除后，視網膜ABCA4蛋白缺失的動物模型。小鼠出生后早期視網膜電圖(ERG)顯示異常的明視錐體反應，該反應隨年齡增長呈進行性下降。缺陷小鼠視網膜組織接受光刺激后全反式視黃醛增加,錐體細胞外節中N-亞視黃基-磷脂酰乙醇胺水平提高，進而RPE中脂褐素堆積，老年的Abca4-/-小鼠眼底也有黃色斑點和萎縮的表現[11, 12]。盡管小鼠沒有與人一樣的黃斑，但上述改變與臨床STGD表型較為相似。研究發現，如果Abca4-/-小鼠在黑暗環境中生長時幾乎不發生脂褐素的堆積[16]。提示避免過多的光照對Abca4基因相關的STGD患者可能是有益的。
Elovl4-/-小鼠是Elovl4基因純合敲除的模型。Karan等[17]發現，隨著年齡增長，小鼠眼底出現視網膜下脫色素斑點和地圖樣萎縮；小鼠15日齡光學顯微鏡顯示視網膜外核層和內外節開始發生變性，至12月齡光感受器結構完全消失；電子顯微鏡顯示視細胞外節盤膜亞細胞結構排列紊亂，ERG的a、b波均呈進行性下降。隨后Karan等[18]通過組織培養發現，Elovl4基因突變后內質網和高爾基體之間的蛋白轉運異常，最終引起細胞凋亡。
Prom1-/-小鼠14日齡時，光學顯微鏡檢查顯示視網膜各層結構基本正常；20日齡時，視網膜外核層、內外節和外叢狀層厚度均變薄；30日齡時，光感受器細胞核的數目減少至野生型正常鼠的1/5；4月齡時，視網膜外核層和內外節結構完全消失[2]。電子顯微鏡檢查顯示，隨著鼠齡增長，光感受器細胞外節盤膜亞細胞結構排列紊亂，錐體細胞外節視蛋白明顯減少[2]。提示Prom1-/-小鼠視網膜對光照非常敏感，避光可以明顯延緩光感受器細胞變性的發生發展。
2.2 STGD小鼠模型的基因治療
Abca4基因在STGD致病基因中占絕大多數，是基因治療研究的重點[7]。Abca4基因突變呈常染色體隱性遺傳，而隱性遺傳病的基因治療比較簡單；通過替代或糾正自身基因結構或功能上的錯亂，從而改善造成疾病的病理基礎，延緩細胞凋亡，并維持一定程度的生理功能[3]。而Elovl4和Prom1基因引起的STGD比較罕見，且呈常染色體顯性遺傳[5, 19]。與隱性突變不同，顯性突變比較復雜，可以表現為功能缺失突變、功能獲得突變和顯性負突變等。因此，顯性遺傳病的基因治療要根據不同的突變類型而異，如基因替代療法用于功能缺失性突變，而基因抑制療法用于功能獲得性突變[20]。目前STGD基因治療的研究僅限于Abca4基因引起的隱性遺傳型。隨著以病毒載體為代表的轉基因治療在Abca4-/-小鼠模型上獲得成功，STGD基因治療將來可能有較好的應用前景[11, 21-25]。
ABCA4蛋白的互補脫氧核糖核酸(cDNA)含6.8×103個堿基對，而傳統的腺相關病毒(AAV)載體2型最大裝載容量僅為4.7×103個堿基對，所以不能勝任Abca4基因的轉運。與AAV相比，慢病毒有一個顯著的優點，即裝載量高達9.0×103個堿基對，并且能穩定、持久的表達基因[26]。Kong等[21]制備了一種基于馬感染性貧血病毒(EIAV)的慢病毒載體，可攜帶Abca4基因并由牛光感受器蛋白啟動子(CMV)驅動，載體被注入Abca4-/-小鼠視網膜下腔；治療后1年結果顯示，實驗眼脂褐素堆積較未治療眼有一定程度的緩解，視網膜萎縮區域相應減少，治療區附近的視網膜功能也隨之改善。
作為轉基因載體，慢病毒本身存在一定的缺陷，其在整個導入過程中可能會發生基因組的隨機組合而使準確性降低；從基因治療的安全性方面考慮，使用慢病毒的潛在風險顯然要大于已經成熟地應用于臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗的AAV[27]。因此人們開始探索能有效裝載和運輸Abca4基因的AAV載體。Allocca等[22]通過測試8種不同血清型AAV載體來裝載Abca4基因，對比后發現重組AAV(rAAV)2/5比其他6種亞型更有效。將rAAV2/5-CMV-Abca4經視網膜下腔注射入1月齡的變性小鼠，治療后Abca4-/-小鼠表現為視網膜脂褐素顆粒沉積的減少和RPE變薄的延緩。表明rAAV2/5介導的Abca4基因治療可以緩解RPE的變性和死亡。同時，該研究還發現視網膜錐體細胞的功能也有一定程度提高，提示基因治療確實有效[22]。另有研究發現，通過對AAV衣殼蛋白的修飾或改建以及構建雙鏈或雜交AAV載體，Abca4基因也能被成功導入基因缺陷小鼠并部分恢復其相應功能[23, 24]。
多聚賴氨酸-納米顆粒是一種新型的非病毒納米DNA傳遞載體，其裝載量高達20.0×103個堿基對[11]。利用此技術，Han等[11]構建了用來運送人類Abca4基因的納米顆粒載體，經視網膜下腔注入Abca4-/-小鼠；注射后可觀察到治療眼持久的基因表達，最長可在注射后8個月仍能檢測到。有證據表明，納米顆粒載體產生的全身毒性微乎其微，受試動物耐受性良好[28, 29]。但納米顆粒的缺點在于其轉染效率遠不及病毒載體，視網膜僅在注射區域觀察到結構和功能的少量改善。
3 STGD基因治療的臨床試驗
3.1 轉基因載體的安全性驗證
由于ABCA4蛋白的cDNA較大，傳統的AAV載體因容量有限而無法裝載。為了解決這個難題，研究人員以EIAV為基礎設計制備慢病毒載體，用來包裝含有6.8×103個堿基對的Abca4基因，這個新型的轉基因載體已經在Abca4-/-小鼠基因治療的運用中獲得成功[21]。野生型EIAV以往被認為對人體并無致病性，為了進一步驗證新設計的慢病毒載體對人體的安全性，研究人員進一步針對兔和獼猴進行了實驗[30]。EIAV載體在上述2種動物視網膜下腔注射后半年期間，除了輕微的一過性炎癥反應外，并無明顯的毒性反應出現，眼內壓和ERG未出現異常波動，眼球組織學檢查基本正常[30]。免疫學方面，獼猴的血清中始終未檢測到EIAV抗體；而兔的血清中雖然檢測到了EIAV抗體，但免疫反應也沒有造成長期的毒性損害[30]。另外EIAV載體在體內的分布僅限于注射眼，而在全身其他組織器官中均未檢測到[30]。說明該慢病毒載體用于臨床基因治療是可行的。
3.2 STGD基因治療的初步臨床試驗
ABCA4蛋白的cDNA含 6.8×103個堿基對，超出了常規AAV的裝載范圍[21]；所以臨床試驗暫時選用慢病毒作為轉基因載體。從2011年開始，美國和法國的幾個科研小組先后開始實施Abca4基因相關的STGD基因治療的臨床試驗，目前正在進行中；他們應用已經在動物體內經過嚴格安全性試驗的EIAV慢病毒載體，通過視網膜下腔途徑將載體注射到STGD志愿者眼內[25]。這些Ⅰ/Ⅱa期的臨床試驗研究計劃在28位受試者上進行，觀察3種劑量EIAV慢病毒載體的安全性、人體耐受性和臨床療效；目前已有8位受試者接受了第1種給藥劑量的安全性試驗，短期內沒有發生嚴重的不良反應，可以進行下一給藥劑量的治療試驗[25]。在臨床試驗進行的同時，由于擔心慢病毒載體在人體內長期存在的潛在風險，新型大容量AAV載體的研究也有報道，如對AAV衣殼蛋白進行修飾或 改建以及構建雙鏈或雜交AAV載體等。最近一項依靠rAAV2/5 轉運Abca4基因的臨床前期試驗發現，視網膜經過治療后結構和功能有所改善[22, 31]。提示新型大容量的AAV將來有可能取代慢病毒成為更安全的轉基因載體。
STGD是繼Leber先天性黑矇之后又一個進入Ⅰ/Ⅱa期臨床試驗的視網膜隱性遺傳病，目前治療所用的EIAV慢病毒載體對人體的安全性和療效尚在觀察中。除了EIAV慢病毒載體外，rAAV2/5、雙鏈或雜交AAV等新型大容量AAV載體的研究也取得一些進展，有可能作為備選載體之一將來運用到STGD的基因治療中。隨著研究的逐步深入，基因治療技術必將更加成熟和安全有效，廣大眼科遺傳病患者有望在臨床上得到真正的治療。
Stargardt病(STGD)又稱Stargardt黃斑營養不良，基因檢測發現其絕大多數存在三磷酸腺苷(ATP)結合轉運子(Abca4)基因突變[1]。典型的STGD為雙眼黃斑部出現對稱的牛眼或靶心狀外觀的萎縮性改變，常伴有眼底黃色斑點，目前尚無特殊藥物和手術措施干預其病理改變及進程[2]。基因治療通過替代或糾正自身基因結構或功能上的錯亂，從而改善造成疾病的病理基礎，延緩細胞凋亡，并維持一定程度的生理功能[3]。眼球局部因其獨特的解剖結構和免疫赦免優勢，是最適合進行基因治療的器官。現就STGD基因治療研究現狀與進展綜述如下。
1 STGD相關的致病基因及其功能
目前認為Abca4、超長鏈脂肪酸延伸酶4(Elovl4)和細胞表面標志物Prominin-1(Prom1) 這3個基因突變與STGD相關，其中Abca4基因是最主要的致病基因，所占比例超過95%[1, 4-7]。視網膜ABCA4蛋白在視循環中負責將維生素A的中間產物N-亞視黃基-磷脂酰乙醇胺從錐體細胞外節盤膜轉運到外節胞質中，Abca4基因突變將導致編碼ATP結合轉運蛋白異常，上述中間產物堆積并轉化成具有細胞毒性的脂褐素成分，從而引起視網膜色素上皮(RPE)細胞的死亡和錐體細胞的功能喪失[8]。
Elovl4基因負責編碼一種酶，協助食物中的脂肪酸轉化為能融入細胞膜的形式。突變使該酶從內質網異位到細胞質，阻斷了光感受器細胞中極長鏈脂肪酸的合成[9]。Rotstein等[10]研究發現，超長鏈脂肪酸對氧化應激損傷有保護作用，推測由Elovl4基因突變造成的STGD可能與超長鏈脂肪酸的合成減少有關。
Prom1基因參與細胞的增生、分化和凋亡等過程，通過與膽固醇結合，主要在細胞的頂端質膜組織中發揮作用；在錐體細胞中，該基因表達的蛋白產物，可能通過與光感受器特異性的原鈣粘蛋白21以及肌動蛋白纖維相互作用，參與光感受器外節盤膜的形成[5]。Prom1由于基因的R373C發生錯義突變，從而使多肽鏈的氨基酸種類和序列發生改變，這種新發現的致病基因可引起3種不同類型顯性遺傳的STGD [5]。
2 STGD基因治療的動物實驗研究
2.1 STGD相關致病基因的動物模型
Abca4-/-、Elovl4-/-及Prom1-/-小鼠等STGD動物模型均是通過人為基因敲除方法獲得，這些敲除小鼠經檢測被證實存在上述特定的基因缺陷[2, 5, 11-15]。
對這3種基因敲除小鼠視網膜的研究有助于了解疾病的病理機制，為制定合理的治療方案提供基礎。Abca4-/-小鼠是Abca4基因敲除后，視網膜ABCA4蛋白缺失的動物模型。小鼠出生后早期視網膜電圖(ERG)顯示異常的明視錐體反應，該反應隨年齡增長呈進行性下降。缺陷小鼠視網膜組織接受光刺激后全反式視黃醛增加,錐體細胞外節中N-亞視黃基-磷脂酰乙醇胺水平提高，進而RPE中脂褐素堆積，老年的Abca4-/-小鼠眼底也有黃色斑點和萎縮的表現[11, 12]。盡管小鼠沒有與人一樣的黃斑，但上述改變與臨床STGD表型較為相似。研究發現，如果Abca4-/-小鼠在黑暗環境中生長時幾乎不發生脂褐素的堆積[16]。提示避免過多的光照對Abca4基因相關的STGD患者可能是有益的。
Elovl4-/-小鼠是Elovl4基因純合敲除的模型。Karan等[17]發現，隨著年齡增長，小鼠眼底出現視網膜下脫色素斑點和地圖樣萎縮；小鼠15日齡光學顯微鏡顯示視網膜外核層和內外節開始發生變性，至12月齡光感受器結構完全消失；電子顯微鏡顯示視細胞外節盤膜亞細胞結構排列紊亂，ERG的a、b波均呈進行性下降。隨后Karan等[18]通過組織培養發現，Elovl4基因突變后內質網和高爾基體之間的蛋白轉運異常，最終引起細胞凋亡。
Prom1-/-小鼠14日齡時，光學顯微鏡檢查顯示視網膜各層結構基本正常；20日齡時，視網膜外核層、內外節和外叢狀層厚度均變薄；30日齡時，光感受器細胞核的數目減少至野生型正常鼠的1/5；4月齡時，視網膜外核層和內外節結構完全消失[2]。電子顯微鏡檢查顯示，隨著鼠齡增長，光感受器細胞外節盤膜亞細胞結構排列紊亂，錐體細胞外節視蛋白明顯減少[2]。提示Prom1-/-小鼠視網膜對光照非常敏感，避光可以明顯延緩光感受器細胞變性的發生發展。
2.2 STGD小鼠模型的基因治療
Abca4基因在STGD致病基因中占絕大多數，是基因治療研究的重點[7]。Abca4基因突變呈常染色體隱性遺傳，而隱性遺傳病的基因治療比較簡單；通過替代或糾正自身基因結構或功能上的錯亂，從而改善造成疾病的病理基礎，延緩細胞凋亡，并維持一定程度的生理功能[3]。而Elovl4和Prom1基因引起的STGD比較罕見，且呈常染色體顯性遺傳[5, 19]。與隱性突變不同，顯性突變比較復雜，可以表現為功能缺失突變、功能獲得突變和顯性負突變等。因此，顯性遺傳病的基因治療要根據不同的突變類型而異，如基因替代療法用于功能缺失性突變，而基因抑制療法用于功能獲得性突變[20]。目前STGD基因治療的研究僅限于Abca4基因引起的隱性遺傳型。隨著以病毒載體為代表的轉基因治療在Abca4-/-小鼠模型上獲得成功，STGD基因治療將來可能有較好的應用前景[11, 21-25]。
ABCA4蛋白的互補脫氧核糖核酸(cDNA)含6.8×103個堿基對，而傳統的腺相關病毒(AAV)載體2型最大裝載容量僅為4.7×103個堿基對，所以不能勝任Abca4基因的轉運。與AAV相比，慢病毒有一個顯著的優點，即裝載量高達9.0×103個堿基對，并且能穩定、持久的表達基因[26]。Kong等[21]制備了一種基于馬感染性貧血病毒(EIAV)的慢病毒載體，可攜帶Abca4基因并由牛光感受器蛋白啟動子(CMV)驅動，載體被注入Abca4-/-小鼠視網膜下腔；治療后1年結果顯示，實驗眼脂褐素堆積較未治療眼有一定程度的緩解，視網膜萎縮區域相應減少，治療區附近的視網膜功能也隨之改善。
作為轉基因載體，慢病毒本身存在一定的缺陷，其在整個導入過程中可能會發生基因組的隨機組合而使準確性降低；從基因治療的安全性方面考慮，使用慢病毒的潛在風險顯然要大于已經成熟地應用于臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗的AAV[27]。因此人們開始探索能有效裝載和運輸Abca4基因的AAV載體。Allocca等[22]通過測試8種不同血清型AAV載體來裝載Abca4基因，對比后發現重組AAV(rAAV)2/5比其他6種亞型更有效。將rAAV2/5-CMV-Abca4經視網膜下腔注射入1月齡的變性小鼠，治療后Abca4-/-小鼠表現為視網膜脂褐素顆粒沉積的減少和RPE變薄的延緩。表明rAAV2/5介導的Abca4基因治療可以緩解RPE的變性和死亡。同時，該研究還發現視網膜錐體細胞的功能也有一定程度提高，提示基因治療確實有效[22]。另有研究發現，通過對AAV衣殼蛋白的修飾或改建以及構建雙鏈或雜交AAV載體，Abca4基因也能被成功導入基因缺陷小鼠并部分恢復其相應功能[23, 24]。
多聚賴氨酸-納米顆粒是一種新型的非病毒納米DNA傳遞載體，其裝載量高達20.0×103個堿基對[11]。利用此技術，Han等[11]構建了用來運送人類Abca4基因的納米顆粒載體，經視網膜下腔注入Abca4-/-小鼠；注射后可觀察到治療眼持久的基因表達，最長可在注射后8個月仍能檢測到。有證據表明，納米顆粒載體產生的全身毒性微乎其微，受試動物耐受性良好[28, 29]。但納米顆粒的缺點在于其轉染效率遠不及病毒載體，視網膜僅在注射區域觀察到結構和功能的少量改善。
3 STGD基因治療的臨床試驗
3.1 轉基因載體的安全性驗證
由于ABCA4蛋白的cDNA較大，傳統的AAV載體因容量有限而無法裝載。為了解決這個難題，研究人員以EIAV為基礎設計制備慢病毒載體，用來包裝含有6.8×103個堿基對的Abca4基因，這個新型的轉基因載體已經在Abca4-/-小鼠基因治療的運用中獲得成功[21]。野生型EIAV以往被認為對人體并無致病性，為了進一步驗證新設計的慢病毒載體對人體的安全性，研究人員進一步針對兔和獼猴進行了實驗[30]。EIAV載體在上述2種動物視網膜下腔注射后半年期間，除了輕微的一過性炎癥反應外，并無明顯的毒性反應出現，眼內壓和ERG未出現異常波動，眼球組織學檢查基本正常[30]。免疫學方面，獼猴的血清中始終未檢測到EIAV抗體；而兔的血清中雖然檢測到了EIAV抗體，但免疫反應也沒有造成長期的毒性損害[30]。另外EIAV載體在體內的分布僅限于注射眼，而在全身其他組織器官中均未檢測到[30]。說明該慢病毒載體用于臨床基因治療是可行的。
3.2 STGD基因治療的初步臨床試驗
ABCA4蛋白的cDNA含 6.8×103個堿基對，超出了常規AAV的裝載范圍[21]；所以臨床試驗暫時選用慢病毒作為轉基因載體。從2011年開始，美國和法國的幾個科研小組先后開始實施Abca4基因相關的STGD基因治療的臨床試驗，目前正在進行中；他們應用已經在動物體內經過嚴格安全性試驗的EIAV慢病毒載體，通過視網膜下腔途徑將載體注射到STGD志愿者眼內[25]。這些Ⅰ/Ⅱa期的臨床試驗研究計劃在28位受試者上進行，觀察3種劑量EIAV慢病毒載體的安全性、人體耐受性和臨床療效；目前已有8位受試者接受了第1種給藥劑量的安全性試驗，短期內沒有發生嚴重的不良反應，可以進行下一給藥劑量的治療試驗[25]。在臨床試驗進行的同時，由于擔心慢病毒載體在人體內長期存在的潛在風險，新型大容量AAV載體的研究也有報道，如對AAV衣殼蛋白進行修飾或 改建以及構建雙鏈或雜交AAV載體等。最近一項依靠rAAV2/5 轉運Abca4基因的臨床前期試驗發現，視網膜經過治療后結構和功能有所改善[22, 31]。提示新型大容量的AAV將來有可能取代慢病毒成為更安全的轉基因載體。
STGD是繼Leber先天性黑矇之后又一個進入Ⅰ/Ⅱa期臨床試驗的視網膜隱性遺傳病，目前治療所用的EIAV慢病毒載體對人體的安全性和療效尚在觀察中。除了EIAV慢病毒載體外，rAAV2/5、雙鏈或雜交AAV等新型大容量AAV載體的研究也取得一些進展，有可能作為備選載體之一將來運用到STGD的基因治療中。隨著研究的逐步深入，基因治療技術必將更加成熟和安全有效，廣大眼科遺傳病患者有望在臨床上得到真正的治療。