視網膜色素上皮(RPE)細胞替代治療是治療老年性黃斑變性的發展趨勢。已完成臨床試驗或即將進入臨床試驗的細胞種類包括自體RPE細胞、虹膜色素上皮細胞(IPE)、人胎兒RPE細胞(fRPE)、人類胚胎干細胞來源的RPE細胞(hESC-RPE)、誘導多潛能干細胞來源的RPE細胞(iPSC-RPE)。自體RPE細胞和IPE由于其固有的缺陷相關臨床試驗已逐漸停止;iPSC-RPE和hESC-RPE在致腫瘤性和基因突變的風險難以規避,臨床應用前應對細胞進行基因水平的篩選;fRPE具有免疫原性低、易于同宿主視網膜整合、完全的RPE功能等特點,是優于hESC-RPE的最佳選擇。移植方式主要有RPE單層或RPE-脈絡膜復合物移植、RPE細胞懸液移植、支架上形成的RPE片層移植。其中首選的和較為成熟的移植方式仍為細胞懸液的注射治療。注射所導致的細胞逆流,以及細胞逆流所帶來的一系列并發癥亟待得到解決。
引用本文： 沈涵, 劉慶淮, 袁松濤. 老年性黃斑變性視網膜色素上皮細胞替代治療研究進展. 中華眼底病雜志, 2016, 32(1): 92-96. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.01.026 復制
老年性黃斑變性(AMD)臨床上分為滲出型和萎縮型兩種類型。前者主要是光動力療法和玻璃體腔注射抗血管內皮生長因子藥物治療；后者無有效治療方法[1]。在AMD發展過程中，首先損傷視網膜色素上皮(RPE)細胞，導致RPE細胞形態及功能改變和缺失，并最終致使Bruchs膜(BM)、RPE層、光感受器細胞層(視錐、視桿細胞)、其他神經元細胞層(水平狀細胞、雙極細胞等)逐步受到損害[2]。根據AMD特殊的病理生理特點，自1991年研究者們開始嘗試RPE細胞移植替代治療方法。移植過的細胞種類包括自體RPE細胞、自體RPE-脈絡膜全層復合物、虹膜色素上皮(IPE)細胞、人胎兒RPE(fRPE)細胞、人胚胎干細胞(hESC)來源的RPE細胞(hESC-RPE細胞)、誘導多潛能干細胞(iPSC)來源的RPE細胞(iPSC-RPE細胞)等。而所采用的移植方式主要有RPE單層或RPE-脈絡膜復合物移植、RPE細胞懸液移植、支架上形成的RPE片層移植。現就各種RPE替代細胞類型、移植方法、臨床及細胞活體移植試驗研究現狀、進展及存在的問題綜述如下。
1 細胞類型
1.1 自體RPE細胞
使用自體視網膜邊緣健康的RPE細胞取材方便，可避免免疫排斥且細胞功能和性質穩定。因此自體RPE細胞以及自體RPE-脈絡膜復合物移植是研究者們最早嘗試的治療方式。1991年Peyman等[3]首次將自體視網膜邊緣帶蒂的RPE-脈絡膜復合物移植于晚期萎縮型AMD患者視網膜下腔，手術后患者視力明顯提高。此后，不同研究者將自體全層RPE-脈絡膜復合物或自體RPE懸液，移植于超過349例萎縮型和滲出型AMD患者視網膜下腔并取一定療效。Ma等[4]研究結果顯示，接受自體RPE-BM復合體移植的17例滲出型AMD患者手術后1年平均視力增加19.11個字母。為了避免脈絡膜損傷所導致的出血和增生性玻璃體視網膜病變(PVR)，2013年Han等[5]將10例滲出型AMD患者視網膜邊緣的自體RPE細胞單層移植于黃斑視網膜下腔，移植18周后9例患者視力提高3行及以上。但自體RPE細胞替代治療尚存在不少問題難以解決：(1)手術過程復雜，并發癥發生率較高。如因手術切口鄰近血管弓或因移植物切除較大而破壞血視網膜屏障引起的PVR、息肉樣脈絡膜血管病變、視網膜下纖維組織增生、視網膜下出血、脈絡膜新生血管復發等。(2)機械性剝離邊緣視網膜所導致的眼內炎，快速清除移植的RPE細胞，導致治療效果下降，甚至移植失敗。(3)取材大小和部位受限受限。(4)對于晚期AMD患者，移植物中RPE細胞長期的脂褐素沉積，影響替代治療效果。因此，近年來用自體RPE細胞移植的研究逐漸減少。
1.2 IPE細胞
為了避免自體RPE移植的上述缺陷，同時避免免疫排斥，研究者們開始使用與RPE具有相同胚胎學起源且形態和功能相似的IPE細胞。自1999年至2007年，經過或未經過體外培養的自體IPE懸液移植到135例滲出型AMD患者視網膜下腔，但手術后僅有42例患者視力增加3行左右[6-10]。導致此結果原因主要是與IPE細胞的生理功能并不能完全替代RPE細胞密切相關。研究者們發現，IPE細胞不能分泌Ⅳ型膠原，移植后難以黏附在BM上[11]，且IPE細胞吞噬降解光感受器細胞外節功能、旁分泌功能、表達色素功能均低于RPE細胞[12]。2006年Cai等[13]比較了IPE和RPE的基因表達譜，發現了68個對RPE細胞功能起關鍵作用的基因不在IPE細胞中表達，其中包含了視紫紅質循環中的某些關鍵基因。于是，此種移植治療方式的相關臨床試驗逐漸停止。
1.3 iPSC-RPE細胞
同樣為了避免免疫排斥，研究者們提出利用自體iPSC分化出RPE細胞用于移植替代治療。誘導得到的RPE細胞具有與人RPE細胞幾乎相同的形態和功能。Kamao等[14]模擬BM將iPSC-RPE在膠原上做成片層用于移植，并在皇家外科學院(RCS)大鼠和猴的臨床前實驗中獲得安全性和有效性的驗證。但這種iPSC-RPE細胞的移植排斥反應較hESC-RPE細胞更快[15, 16]。于是2012年Zimmermann等[17]提出建立iPSC細胞庫，利用人類白細胞抗原(HLA)配對避免移植免疫排斥。但由于iPSC構建過程中導入原癌基因，逆轉錄病毒的基因重組過程，使得iPSC具有比hESC更高的畸胎瘤形成傾向和基因異常[18]。雖然有研究報道，減少或完全去除外源性轉錄因子，或者通過小分子化合物以及通過導入后再去除的辦法進行解決，但iPSC進入臨床前都需要基因的篩查和安全性的驗證[19]。iPSC-RPE治療AMD的第一例臨床試驗已于2014年9月在日本的RIKEN實驗室開展，即因受到與安全性相關的影響而中止[20]。
1.4 hESC-RPE細胞
2006年有研究者首次將hESC-RPE細胞懸液移植于RCS大鼠視網膜下腔。2011年5月加利福尼亞大學洛杉磯分校開始進行Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗。Ⅰ期臨床試驗中，1例萎縮型AMD患者手術后盡管沒有形成RPE細胞單層，但視力提高了7個字母，且沒有發生免疫排斥、眼內炎和腫瘤形成等并發癥[21]。Ⅱ期臨床試驗中，研究者跨過地圖樣萎縮的黃斑中心組織，選取周邊相對正常視網膜作為移植點，以提高移植物存活率和生物活性。手術后6個月9例萎縮型AMD患者視力提高了11～15個字母，其中8例患者視網膜下色素增加，且沒有發現腫瘤形成[22]。目前為止受試者最嚴重的并發癥為眼內炎、白內障和免疫抑制劑使用帶來的免疫系統紊亂，其結果證明了該移植方式的安全性和有效性[23]。2015年Song等[24]將hESC-RPE細胞懸液移植到2例萎縮型AMD亞洲患者的視網膜下腔，1年后2例患者視力分別增加了1、9個字母。國內的臨床試驗也于2015年7月在第三軍醫大學西南醫院開展，受試的1例滲出型AMD患者在移植后1個月視力提高到標準視力表的0.15。然而hESC-RPE的基因變異[19]和潛在的致腫瘤性難以忽視，有報道稱hESC-RPE細胞移植后形成包含神經前體細胞的玫瑰花環樣結構[25]。為了避免畸胎瘤的形成，只能通過提高細胞純度和減少細胞用量。
1.5 fRPE細胞
1994年至1997年Algvere等[26, 27]將fRPE細胞單層碎片和fRPE細胞懸液分別移植于8例萎縮型和10例滲出型AMD患者視網膜下腔。在4例接受fRPE細胞懸液移植的萎縮型AMD患者中，移植細胞存活超過12個月并覆蓋黃斑，形成血視網膜屏障，沒有出現免疫排斥，視力在8～12個月內維持穩定，且部分玻璃膜疣消失。1999年，Weisz等[28]將fRPE細胞懸液移植到1例萎縮型AMD患者視網膜下腔，但患者移植后血視網膜屏障破壞，視力下降。2004年和2008年，Radtke等[29, 30]進行了Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗，在4.5～7.5 h內，將胎兒視網膜神經上皮層和RPE層一同移植至4例萎縮型AMD患者視網膜下腔，未使用免疫抑制劑。移植后3例患者視力不同程度提高，最明顯者從移植前20／800提到移植后20/160；且無針對移植物的HLA抗體出現。fRPE細胞具有：(1)細胞體外培養過程中不涉及誘導分化和基因重組步驟，基因突變的可能性極低，在致腫瘤性風險上明顯優于干細胞來源的RPE細胞，更安全。(2)免疫原性小，不引起T細胞顯著的特異性免疫反應，還可以抑制T細胞激活，避免了免疫抑制劑的使用[31]。(3)具有極大的體外增生能力，一個胎兒眼球可以用于治療數百例AMD患者，且培養過程簡單、成本低廉，較ESC來源的RPE細胞更適合大規模生產和臨床應用[32]。目前江蘇省人民醫院眼科已獲得fRPE細胞移植替代治療萎縮型AMD的倫理批件，并于2015年6月開始招募患者參與臨床試驗。
2 移植方式
2.1 包含RPE細胞的單層或復合物的移植
該移植方式主要為自體RPE-脈絡膜全層移植、自體RPE-BM復合物移植、自體RPE細胞單層移植和胎兒視網膜全層移植。2010年，Cereda等[33]提出用180°邊緣視網膜造孔手術，將帶蒂的自體RPE-脈絡膜全層復合物移植于滲出型AMD患者中心凹下，移植后息肉樣脈絡膜血管病變發生率下降，1周后即在移植復合物中見到灌注。2008年，Radtke等[30]首次將新鮮胎兒視網膜神經上皮層和RPE層一同移植于萎縮型AMD患者的視網膜下腔，并在移植后對視網膜造孔行激光光凝閉合，移植后RPE細胞建立了新的血視網膜屏障。2009年，Ma等[4]將自體RPE-BM復合物移植于17例滲出型AMD患者的視網膜下腔，移植后未出現熒光素滲漏，且在14只眼中觀察到移植物成功黏附沒有出現褶皺。2013年又成功進行了自體RPE細胞單層移植[5]。雖然包含RPE的多層移植保留了RPE細胞的極性和原本的層間結構，但目前該移植方式存在的問題包括：(1)移植過程中引起視網膜層間結構紊亂，移植后形成無突觸連接的雙層視網膜，并最終導致移植物局部缺血、萎縮[22, 34]。(2)包含RPE的單層或多層移植無法人工合成也無法體外擴增，使移植物量受限。
2.2 RPE細胞懸液移植
細胞懸液移植由于制備和移植方法簡便，具有廣泛的應用。早在1997年就有研究者嘗試fRPE細胞懸液視網膜下腔注射[27]。2014年,Schwartz等[35]將hESC-RPE細胞懸液注射到9例萎縮型AMD與9例Stargardts病患者的視網膜下腔。移植后72%的患者視網膜下腔色素增加,僅1只眼出現視網膜下注射點的持續性氣泡。雖然離散的細胞較容易融入宿主視網膜形成突觸連接，易于在體外進行擴增培養，手術感染風險低，然而這種移植方式也有很多問題需要解決：(1)由于注射引起的視網膜下注射點的持續性氣泡[35]，不能自行吸收而影響患者手術后視力。(2)注射時細胞逆流至玻璃體腔，是引起手術后PVR的主要原因之一[22]。(3)逆流至玻璃體腔的細胞可導致炎癥反應，造成其他移植細胞的快速清除[4]。(4)注射后RPE細胞成團，不能形成單層參與血視網膜屏障的建立，也不能恢復其極性。(5)很難對分離的細胞進行定位和效果分析[23]。
2.3 支架上形成的RPE細胞片層移植
支架可以支持RPE細胞，促進其黏附、增生、吞噬等功能，形成具有極性的細胞單層，并替代損傷的BM[36]。研究者們嘗試過的天然基底膜主要包括角膜后彈力層、晶狀體囊膜、羊膜、內界膜、老化的BM。雖然這些材料具有生物相容性，但具有來源受限、厚度和硬度以及卷曲度難以控制、降解吸收時間不可控、易引起炎癥反應的缺點[37]。因此目前聚合物支架更受歡迎。人工合成的聚合物支架分為可降解和不可降解合成聚合物，其主要難點是缺乏生物信號轉導所需要的分子和表位，以及移植后影響光感受器細胞、RPE和脈絡膜之間的的信號傳遞和物質轉運。可降解的人工支架中，以聚乳酸-羥基乙酸聚合物為支架的iPSC-RPE片層已在美國國立衛生研究院進行臨床前研究，并有望于2017年進入臨床試驗[20]。不可降解的人工支架主要有英國羅敦大學的聚酯支架和美國南加利福尼亞大學的聚對二甲苯-C支架。目前這兩種人工不可降解支架的hESC-RPE片層已通過新藥研究申請，即將開啟Ⅰ期臨床試驗[38]。
為了避免支架本身所造成的影響視網膜各層間信號傳遞和物質轉運、易引起過敏反應等缺陷，2014年Kamao等[14]使用天然膠原薄層作為人工基底膜，將hiPSC-RPE培養成片層后，再用酶將膠原膜降解分離，移植于高度免疫缺陷模型NOG小鼠、RCS大鼠、猴的視網膜下腔，結果證明了該移植方式的安全性和較懸液移植的優越性。2015年9月日本RIKEN實驗室進行的第一例臨床試驗正是采用的此種移植方式[20]。然而，不論是移植包含支架在內的RPE片層還是將支架降解后再移植RPE片層，移植方式在移植手術中對手術者操作的要求都較高。首先，RPE片層如何植入視網膜下腔后徹底展平，如果只簡單的限制片層的尺寸以避免皺褶的形成，那么移植的RPE細胞量將受到極大的限制。其次，手術時如何幫助手術者判斷片層的極性。最后，支架上的細胞片層移植是否較細胞懸液移植后移植物存活更久或療效更持久，仍需要大量體內實驗證實。 在支架的基礎上，為了進一步促進細胞的黏附和存活，研究者們還嘗試了氨氣等離子體處理對細胞進行表面修飾[39]，3D組織支架[40]，以及層粘連蛋白包埋等方法。
3 展望
可以用于替代RPE的細胞種類較多，各有其優缺點。首先，自體RPE細胞和IPE細胞，由于前述的缺陷，與hESC-RPE相比已經失去優越性，目前相關的臨床試驗逐漸停止。而iPSC-RPE由于其顯著的免疫排斥和致腫瘤性，也不應作為細胞移植替代治療的首選。其次，目前研究較為成熟的hESC-RPE，由于移植的成本昂貴，難以在臨床上普及。且包括iPSC-RPE和hESC-RPE干細胞來源的RPE細胞在致腫瘤性和基因突變的風險不是簡單的降低細胞用量就可以規避的，臨床應用前對細胞進行基因水平的篩選必不可少。最后，fRPE具有免疫原性低、易于同宿主視網膜整合、完全的RPE功能等特點，培養成本低廉，安全性高，是優于hESC-RPE的目前的最佳選擇。目前GMP(good manufaturing practice)級別的fRPE細胞的臨床試驗即將開展，其安全性和有效性將得到驗證。對于GMP級別的fRPE細胞，如何在培養過程中增強其體外增生能力，進一步降低取材限制和倫理弊端，將是其進入大規模生產和臨床廣泛應用時需要解決的又一個問題。
在支架上形成細胞片層移植的方法雖然有利于增強RPE細胞在體內功能的發揮，但對手術移植技能的要求較高且缺乏大量的體內試驗研究。現階段首選的和較為成熟的移植方式仍為細胞懸液的注射治療。而由注射所導致的細胞逆流，以及細胞逆流所帶來的一系列并發癥，是否可通過降低制劑的容量，或改良溶劑的成分等問題亟待得到解決。
除了RPE細胞替代治療以外，研究者們還提出用骨髓間充質干細胞、骨髓來源的造血干細胞、神經前體細胞治療AMD。這些細胞能夠分化出除RPE細胞以外的多種視網膜細胞，并能分泌支持光感受器細胞的細胞因子。或許根據視網膜損傷的不同程度，選擇不同的細胞進行替代治療，以達到更確切、更全面的治療效果是將來AMD治療的發展方向[41, 42]。
老年性黃斑變性(AMD)臨床上分為滲出型和萎縮型兩種類型。前者主要是光動力療法和玻璃體腔注射抗血管內皮生長因子藥物治療；后者無有效治療方法[1]。在AMD發展過程中，首先損傷視網膜色素上皮(RPE)細胞，導致RPE細胞形態及功能改變和缺失，并最終致使Bruchs膜(BM)、RPE層、光感受器細胞層(視錐、視桿細胞)、其他神經元細胞層(水平狀細胞、雙極細胞等)逐步受到損害[2]。根據AMD特殊的病理生理特點，自1991年研究者們開始嘗試RPE細胞移植替代治療方法。移植過的細胞種類包括自體RPE細胞、自體RPE-脈絡膜全層復合物、虹膜色素上皮(IPE)細胞、人胎兒RPE(fRPE)細胞、人胚胎干細胞(hESC)來源的RPE細胞(hESC-RPE細胞)、誘導多潛能干細胞(iPSC)來源的RPE細胞(iPSC-RPE細胞)等。而所采用的移植方式主要有RPE單層或RPE-脈絡膜復合物移植、RPE細胞懸液移植、支架上形成的RPE片層移植。現就各種RPE替代細胞類型、移植方法、臨床及細胞活體移植試驗研究現狀、進展及存在的問題綜述如下。
1 細胞類型
1.1 自體RPE細胞
使用自體視網膜邊緣健康的RPE細胞取材方便，可避免免疫排斥且細胞功能和性質穩定。因此自體RPE細胞以及自體RPE-脈絡膜復合物移植是研究者們最早嘗試的治療方式。1991年Peyman等[3]首次將自體視網膜邊緣帶蒂的RPE-脈絡膜復合物移植于晚期萎縮型AMD患者視網膜下腔，手術后患者視力明顯提高。此后，不同研究者將自體全層RPE-脈絡膜復合物或自體RPE懸液，移植于超過349例萎縮型和滲出型AMD患者視網膜下腔并取一定療效。Ma等[4]研究結果顯示，接受自體RPE-BM復合體移植的17例滲出型AMD患者手術后1年平均視力增加19.11個字母。為了避免脈絡膜損傷所導致的出血和增生性玻璃體視網膜病變(PVR)，2013年Han等[5]將10例滲出型AMD患者視網膜邊緣的自體RPE細胞單層移植于黃斑視網膜下腔，移植18周后9例患者視力提高3行及以上。但自體RPE細胞替代治療尚存在不少問題難以解決：(1)手術過程復雜，并發癥發生率較高。如因手術切口鄰近血管弓或因移植物切除較大而破壞血視網膜屏障引起的PVR、息肉樣脈絡膜血管病變、視網膜下纖維組織增生、視網膜下出血、脈絡膜新生血管復發等。(2)機械性剝離邊緣視網膜所導致的眼內炎，快速清除移植的RPE細胞，導致治療效果下降，甚至移植失敗。(3)取材大小和部位受限受限。(4)對于晚期AMD患者，移植物中RPE細胞長期的脂褐素沉積，影響替代治療效果。因此，近年來用自體RPE細胞移植的研究逐漸減少。
1.2 IPE細胞
為了避免自體RPE移植的上述缺陷，同時避免免疫排斥，研究者們開始使用與RPE具有相同胚胎學起源且形態和功能相似的IPE細胞。自1999年至2007年，經過或未經過體外培養的自體IPE懸液移植到135例滲出型AMD患者視網膜下腔，但手術后僅有42例患者視力增加3行左右[6-10]。導致此結果原因主要是與IPE細胞的生理功能并不能完全替代RPE細胞密切相關。研究者們發現，IPE細胞不能分泌Ⅳ型膠原，移植后難以黏附在BM上[11]，且IPE細胞吞噬降解光感受器細胞外節功能、旁分泌功能、表達色素功能均低于RPE細胞[12]。2006年Cai等[13]比較了IPE和RPE的基因表達譜，發現了68個對RPE細胞功能起關鍵作用的基因不在IPE細胞中表達，其中包含了視紫紅質循環中的某些關鍵基因。于是，此種移植治療方式的相關臨床試驗逐漸停止。
1.3 iPSC-RPE細胞
同樣為了避免免疫排斥，研究者們提出利用自體iPSC分化出RPE細胞用于移植替代治療。誘導得到的RPE細胞具有與人RPE細胞幾乎相同的形態和功能。Kamao等[14]模擬BM將iPSC-RPE在膠原上做成片層用于移植，并在皇家外科學院(RCS)大鼠和猴的臨床前實驗中獲得安全性和有效性的驗證。但這種iPSC-RPE細胞的移植排斥反應較hESC-RPE細胞更快[15, 16]。于是2012年Zimmermann等[17]提出建立iPSC細胞庫，利用人類白細胞抗原(HLA)配對避免移植免疫排斥。但由于iPSC構建過程中導入原癌基因，逆轉錄病毒的基因重組過程，使得iPSC具有比hESC更高的畸胎瘤形成傾向和基因異常[18]。雖然有研究報道，減少或完全去除外源性轉錄因子，或者通過小分子化合物以及通過導入后再去除的辦法進行解決，但iPSC進入臨床前都需要基因的篩查和安全性的驗證[19]。iPSC-RPE治療AMD的第一例臨床試驗已于2014年9月在日本的RIKEN實驗室開展，即因受到與安全性相關的影響而中止[20]。
1.4 hESC-RPE細胞
2006年有研究者首次將hESC-RPE細胞懸液移植于RCS大鼠視網膜下腔。2011年5月加利福尼亞大學洛杉磯分校開始進行Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗。Ⅰ期臨床試驗中，1例萎縮型AMD患者手術后盡管沒有形成RPE細胞單層，但視力提高了7個字母，且沒有發生免疫排斥、眼內炎和腫瘤形成等并發癥[21]。Ⅱ期臨床試驗中，研究者跨過地圖樣萎縮的黃斑中心組織，選取周邊相對正常視網膜作為移植點，以提高移植物存活率和生物活性。手術后6個月9例萎縮型AMD患者視力提高了11～15個字母，其中8例患者視網膜下色素增加，且沒有發現腫瘤形成[22]。目前為止受試者最嚴重的并發癥為眼內炎、白內障和免疫抑制劑使用帶來的免疫系統紊亂，其結果證明了該移植方式的安全性和有效性[23]。2015年Song等[24]將hESC-RPE細胞懸液移植到2例萎縮型AMD亞洲患者的視網膜下腔，1年后2例患者視力分別增加了1、9個字母。國內的臨床試驗也于2015年7月在第三軍醫大學西南醫院開展，受試的1例滲出型AMD患者在移植后1個月視力提高到標準視力表的0.15。然而hESC-RPE的基因變異[19]和潛在的致腫瘤性難以忽視，有報道稱hESC-RPE細胞移植后形成包含神經前體細胞的玫瑰花環樣結構[25]。為了避免畸胎瘤的形成，只能通過提高細胞純度和減少細胞用量。
1.5 fRPE細胞
1994年至1997年Algvere等[26, 27]將fRPE細胞單層碎片和fRPE細胞懸液分別移植于8例萎縮型和10例滲出型AMD患者視網膜下腔。在4例接受fRPE細胞懸液移植的萎縮型AMD患者中，移植細胞存活超過12個月并覆蓋黃斑，形成血視網膜屏障，沒有出現免疫排斥，視力在8～12個月內維持穩定，且部分玻璃膜疣消失。1999年，Weisz等[28]將fRPE細胞懸液移植到1例萎縮型AMD患者視網膜下腔，但患者移植后血視網膜屏障破壞，視力下降。2004年和2008年，Radtke等[29, 30]進行了Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗，在4.5～7.5 h內，將胎兒視網膜神經上皮層和RPE層一同移植至4例萎縮型AMD患者視網膜下腔，未使用免疫抑制劑。移植后3例患者視力不同程度提高，最明顯者從移植前20／800提到移植后20/160；且無針對移植物的HLA抗體出現。fRPE細胞具有：(1)細胞體外培養過程中不涉及誘導分化和基因重組步驟，基因突變的可能性極低，在致腫瘤性風險上明顯優于干細胞來源的RPE細胞，更安全。(2)免疫原性小，不引起T細胞顯著的特異性免疫反應，還可以抑制T細胞激活，避免了免疫抑制劑的使用[31]。(3)具有極大的體外增生能力，一個胎兒眼球可以用于治療數百例AMD患者，且培養過程簡單、成本低廉，較ESC來源的RPE細胞更適合大規模生產和臨床應用[32]。目前江蘇省人民醫院眼科已獲得fRPE細胞移植替代治療萎縮型AMD的倫理批件，并于2015年6月開始招募患者參與臨床試驗。
2 移植方式
2.1 包含RPE細胞的單層或復合物的移植
該移植方式主要為自體RPE-脈絡膜全層移植、自體RPE-BM復合物移植、自體RPE細胞單層移植和胎兒視網膜全層移植。2010年，Cereda等[33]提出用180°邊緣視網膜造孔手術，將帶蒂的自體RPE-脈絡膜全層復合物移植于滲出型AMD患者中心凹下，移植后息肉樣脈絡膜血管病變發生率下降，1周后即在移植復合物中見到灌注。2008年，Radtke等[30]首次將新鮮胎兒視網膜神經上皮層和RPE層一同移植于萎縮型AMD患者的視網膜下腔，并在移植后對視網膜造孔行激光光凝閉合，移植后RPE細胞建立了新的血視網膜屏障。2009年，Ma等[4]將自體RPE-BM復合物移植于17例滲出型AMD患者的視網膜下腔，移植后未出現熒光素滲漏，且在14只眼中觀察到移植物成功黏附沒有出現褶皺。2013年又成功進行了自體RPE細胞單層移植[5]。雖然包含RPE的多層移植保留了RPE細胞的極性和原本的層間結構，但目前該移植方式存在的問題包括：(1)移植過程中引起視網膜層間結構紊亂，移植后形成無突觸連接的雙層視網膜，并最終導致移植物局部缺血、萎縮[22, 34]。(2)包含RPE的單層或多層移植無法人工合成也無法體外擴增，使移植物量受限。
2.2 RPE細胞懸液移植
細胞懸液移植由于制備和移植方法簡便，具有廣泛的應用。早在1997年就有研究者嘗試fRPE細胞懸液視網膜下腔注射[27]。2014年,Schwartz等[35]將hESC-RPE細胞懸液注射到9例萎縮型AMD與9例Stargardts病患者的視網膜下腔。移植后72%的患者視網膜下腔色素增加,僅1只眼出現視網膜下注射點的持續性氣泡。雖然離散的細胞較容易融入宿主視網膜形成突觸連接，易于在體外進行擴增培養，手術感染風險低，然而這種移植方式也有很多問題需要解決：(1)由于注射引起的視網膜下注射點的持續性氣泡[35]，不能自行吸收而影響患者手術后視力。(2)注射時細胞逆流至玻璃體腔，是引起手術后PVR的主要原因之一[22]。(3)逆流至玻璃體腔的細胞可導致炎癥反應，造成其他移植細胞的快速清除[4]。(4)注射后RPE細胞成團，不能形成單層參與血視網膜屏障的建立，也不能恢復其極性。(5)很難對分離的細胞進行定位和效果分析[23]。
2.3 支架上形成的RPE細胞片層移植
支架可以支持RPE細胞，促進其黏附、增生、吞噬等功能，形成具有極性的細胞單層，并替代損傷的BM[36]。研究者們嘗試過的天然基底膜主要包括角膜后彈力層、晶狀體囊膜、羊膜、內界膜、老化的BM。雖然這些材料具有生物相容性，但具有來源受限、厚度和硬度以及卷曲度難以控制、降解吸收時間不可控、易引起炎癥反應的缺點[37]。因此目前聚合物支架更受歡迎。人工合成的聚合物支架分為可降解和不可降解合成聚合物，其主要難點是缺乏生物信號轉導所需要的分子和表位，以及移植后影響光感受器細胞、RPE和脈絡膜之間的的信號傳遞和物質轉運。可降解的人工支架中，以聚乳酸-羥基乙酸聚合物為支架的iPSC-RPE片層已在美國國立衛生研究院進行臨床前研究，并有望于2017年進入臨床試驗[20]。不可降解的人工支架主要有英國羅敦大學的聚酯支架和美國南加利福尼亞大學的聚對二甲苯-C支架。目前這兩種人工不可降解支架的hESC-RPE片層已通過新藥研究申請，即將開啟Ⅰ期臨床試驗[38]。
為了避免支架本身所造成的影響視網膜各層間信號傳遞和物質轉運、易引起過敏反應等缺陷，2014年Kamao等[14]使用天然膠原薄層作為人工基底膜，將hiPSC-RPE培養成片層后，再用酶將膠原膜降解分離，移植于高度免疫缺陷模型NOG小鼠、RCS大鼠、猴的視網膜下腔，結果證明了該移植方式的安全性和較懸液移植的優越性。2015年9月日本RIKEN實驗室進行的第一例臨床試驗正是采用的此種移植方式[20]。然而，不論是移植包含支架在內的RPE片層還是將支架降解后再移植RPE片層，移植方式在移植手術中對手術者操作的要求都較高。首先，RPE片層如何植入視網膜下腔后徹底展平，如果只簡單的限制片層的尺寸以避免皺褶的形成，那么移植的RPE細胞量將受到極大的限制。其次，手術時如何幫助手術者判斷片層的極性。最后，支架上的細胞片層移植是否較細胞懸液移植后移植物存活更久或療效更持久，仍需要大量體內實驗證實。 在支架的基礎上，為了進一步促進細胞的黏附和存活，研究者們還嘗試了氨氣等離子體處理對細胞進行表面修飾[39]，3D組織支架[40]，以及層粘連蛋白包埋等方法。
3 展望
可以用于替代RPE的細胞種類較多，各有其優缺點。首先，自體RPE細胞和IPE細胞，由于前述的缺陷，與hESC-RPE相比已經失去優越性，目前相關的臨床試驗逐漸停止。而iPSC-RPE由于其顯著的免疫排斥和致腫瘤性，也不應作為細胞移植替代治療的首選。其次，目前研究較為成熟的hESC-RPE，由于移植的成本昂貴，難以在臨床上普及。且包括iPSC-RPE和hESC-RPE干細胞來源的RPE細胞在致腫瘤性和基因突變的風險不是簡單的降低細胞用量就可以規避的，臨床應用前對細胞進行基因水平的篩選必不可少。最后，fRPE具有免疫原性低、易于同宿主視網膜整合、完全的RPE功能等特點，培養成本低廉，安全性高，是優于hESC-RPE的目前的最佳選擇。目前GMP(good manufaturing practice)級別的fRPE細胞的臨床試驗即將開展，其安全性和有效性將得到驗證。對于GMP級別的fRPE細胞，如何在培養過程中增強其體外增生能力，進一步降低取材限制和倫理弊端，將是其進入大規模生產和臨床廣泛應用時需要解決的又一個問題。
在支架上形成細胞片層移植的方法雖然有利于增強RPE細胞在體內功能的發揮，但對手術移植技能的要求較高且缺乏大量的體內試驗研究。現階段首選的和較為成熟的移植方式仍為細胞懸液的注射治療。而由注射所導致的細胞逆流，以及細胞逆流所帶來的一系列并發癥，是否可通過降低制劑的容量，或改良溶劑的成分等問題亟待得到解決。
除了RPE細胞替代治療以外，研究者們還提出用骨髓間充質干細胞、骨髓來源的造血干細胞、神經前體細胞治療AMD。這些細胞能夠分化出除RPE細胞以外的多種視網膜細胞，并能分泌支持光感受器細胞的細胞因子。或許根據視網膜損傷的不同程度，選擇不同的細胞進行替代治療，以達到更確切、更全面的治療效果是將來AMD治療的發展方向[41, 42]。