引用本文： 郭喬茜, 王清, 謝婷玉, 李琴, 李常棟, 陳雪藝. 臭氧對糖尿病大鼠視網膜結構及缺氧誘導因子-1α表達的影響. 中華眼底病雜志, 2014, 30(2): 198-200. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.02.020 復制
高血糖可以通過激酶和轉錄因子活化上調生長因子的表達，破壞內皮細胞、周細胞功能及血視網膜屏障促進新生血管生成[1]。臭氧作為一種強氧化劑，可以通過激活抗氧化酶和自由基清除系統，刺激各種抗氧化酶活性，清除自由基，促進新陳代謝[2]。有研究表明，臭氧可以改善糖尿病(DM)大鼠腎臟組織缺氧狀態，減少氧化應激反應，組織中過氧化氫酶、過氧化歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等有顯著改變[3]。臭氧治療能否預防DM視網膜病變(DR)發展報道尚少。我們通過觀察臭氧治療的DM大鼠視網膜組織病理改變，同時檢測臭氧治療與未治療的DM大鼠視網膜中缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)表達的差異，以探討臭氧對DM大鼠視網膜結構及HIF-1α表達的影響。
1 材料和方法
3月齡無特定病原體級Spraque-Dawley(SD)雄性大鼠70只，體重300~320g。大鼠由新疆醫科大學動物實驗中心提供[許可證號為SCXK(新)2003-0001]。參照文獻[4]的方法建立DM模型。大鼠適應性喂養4周，隨機抽取10只大鼠作為空白對照組，普通喂養。余下60只大鼠接受高脂高糖飲食喂養45d，禁食不禁水12 h后腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，誘導建立DM模型。STZ用新鮮配制的無菌、pH4.3~4.5的0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液稀釋，終溶液中STZ濃度為10 g/L，根據體重按30 mg/kg一次性腹腔注射。注射后72 h和1周割尾取血檢測血糖，兩次血糖值均≥16.7 mmol/L者即為DM大鼠造模成功。共造模成功55只，造模成功率為92%。將其隨機分為模型對照、臭氧灌腸、氧氣灌腸組。各組分別為18、19、18只大鼠。繼續高脂高糖飲食喂養1個月，后改為普通喂養。造模成功1個月后，參照文獻[5]的方法，臭氧灌腸、氧氣灌腸組大鼠根據體重按50 μg/kg分別緩慢直腸灌入臭氧、氧氣，灌入后均按住肛門保持5 min，2次/周，連續灌腸治療4周。空白對照組、模型對照組不行任何處理。末次灌腸后1周，腹腔內注射適量氯胺酮麻醉大鼠，迅速摘取眼球。觀察視網膜超微結構及組織病理改變。將摘取的左側眼球置于2.5%戊二醛中固定1 h，去掉眼前節，剪取2 mm×3 mm的視網膜組織塊再次放入新鮮的2.5%戊二醛中繼續固定24 h，經過脫水、包埋、固化、切片，經醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后采用日立h-600透射電子顯微鏡觀察并拍照。將左眼剩余視網膜及右眼視網膜放入4%甲醛中固定48 h以上，經過組織脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色后采用Olympus CH20光學顯微鏡觀察并拍照。
逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測視網膜的HIF-1α mRNA的表達。將眼球沿鋸齒緣剪開，分離出視網膜組織，稱濕重后立即放入液氮中3 min，最后置于-80 ℃保存。應用Trizol提取試劑盒(美國Invitrogen公司)提取視網膜總RNA，測定總RNA濃度、純度。采用Primer 5．0引物設計軟件設計引物序列，由上海生工生物工程公司合成引物。其中，HIF-1α上游引物5′-TCGGCGAAGTAAAGAATCTGAA-3′，下游引物5′-CAAATCACCAGCATCCAGAAGT-3′；內參照β-肌動蛋白(β-actin)上游引物：5′-ACTGCCCTG GCTCCTAGCA-3′，下游引物5′-GCCAGGATAGAGCCACCA ATC-3′。應用反轉錄試劑盒(寶生物大連有限公司)和Cycler聚合酶鏈式反應儀(美國Bio-Rad公司)進行逆轉錄、擴增。應用Leica DM 3000采圖系統檢測HIF-1α與β-actin吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值，兩者比值為HIF-1α mRNA的表達量。
所得實驗結果均采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。計量資料的描述用均數±標準差(
2 結果
光學顯微鏡觀察，空白對照組大鼠視網膜組織學形態基本正常。模型對照組大鼠視網膜各層結構基本規則，內外核層細胞減少、分布不均勻、層次模糊，內核層細胞間隙增大，并伴有空泡化，神經節細胞水腫，染色淡，內叢狀層疏松，視椎、視桿細胞外節可見空泡化改變，視網膜小血管淤血(圖 1)。臭氧灌腸組大鼠視網膜各層結構規則，內外核層細胞分布均勻、層次清楚，內核層細胞排列較疏松，神經節細胞染色稍淡(圖 2)。氧氣灌腸組大鼠視網膜組織各層細胞排列紊亂、間隙增大，并伴有空泡化，神經節細胞淡染。
圖1
模型對照組大鼠視網膜光學顯微鏡像。神經節細胞水腫，內網狀層疏松，內外核層細胞減少，排列不規則，細胞間隙增大并有空泡化，視椎、視桿細胞外節可見空泡化改變，小血管淤血HE ×400??圖 2??臭氧灌腸組大鼠視網膜光學顯微鏡像。視網膜各層結構分明、內核層細胞排列輕度疏松、神經節細胞淡染HE ×400
透射電子顯微鏡觀察，空白對照組大鼠視網膜超微結構未見異常。模型對照組大鼠視網膜神經節細胞層及神經纖維層細胞線粒體數量減少，部分空泡化，嵴水腫、斷裂或缺失，細胞核核膜不連續，核周間隙增大，染色質出現邊集(圖 3A)；Müller細胞核周胞質及突起內線粒體水腫明顯，出現空泡，嵴斷裂、缺失；內外核層細胞排列疏松、紊亂，間隙擴大，可見細胞核固縮(圖 3B)；外節膜盤排列紊亂，間隙增大(圖 3C)；視網膜血管基底膜明顯增厚并且出現多處分叉及融合現象(圖 3D)。臭氧灌腸組大鼠視網膜神經節細胞層及神經纖維層未見明顯異常；Müller細胞線粒體嵴輕度水腫、變短或消失(圖 4A)；內外核層細胞排列規則，細胞核大(圖 4B)；視錐視桿細胞層膜盤靠近視網膜色素上皮層區可見輕度排列紊亂(圖 4C)；其余結構未見明顯異常，血管基底膜未見明顯增厚(圖 4D)。氧氣灌腸組大鼠視網膜神經節細胞層、神經纖維層細胞核固縮，線粒體水腫并減少，Müller細胞出現空泡化，外節膜盤排列疏松，血管基底膜較臭氧灌腸組增厚。
圖3
模型對照組大鼠視網膜電子顯微鏡像。3A.神經節細胞內線粒體水腫，核仁偏向一側醋酸鈾、檸檬酸鉛×4000；3B.外核層細胞排列疏松、紊亂，間隙擴大，細胞核固縮醋酸鈾、檸檬酸鉛×4000；3C.視桿視錐細胞層內外節膜盤排列紊亂，間隙增大醋酸鈾、檸檬酸鉛×4000；3D.血管基底膜明顯增厚并且出現多處分叉及融合現象醋酸鈾、檸檬酸鉛×12000??圖 4??臭氧灌腸組大鼠視網膜電子顯微鏡像。4A.Müller細胞線粒體嵴輕度水腫、變短或消失醋酸鈾、檸檬酸鉛×4000；4B.外核層細胞排列規則，細胞核大醋酸鈾、檸檬酸鉛×4000；4C.視桿錐桿細胞層膜盤靠近視網膜色素上皮層區可見輕度排列紊亂醋酸鈾、檸檬酸鉛×4000；4D.血管基底膜未見明顯增厚醋酸鈾、檸檬酸鉛×12000
空白對照、臭氧灌腸、模型對照、氧氣灌腸組大鼠視網膜的HIF-1α mRNA表達值分別為2.3±0.3、1.8±0.4、2.8±0.3、2.8±0.5。4組間大鼠視網膜的HIF-1α mRNA表達值比較，差異有統計學意義(F=1 178.625，P＜0.05)。空白對照組與臭氧灌腸組、模型組、氧氣灌腸組組間大鼠視網膜的HIF-1α mRNA表達值比較，差異有統計學意義(t=20.83、20.67、19.29，P＜0.05)。臭氧灌腸組與模型對照、氧氣灌腸組組間大鼠視網膜的HIF-1α mRNA表達值比較，差異有統計學意義(t=51.65、49.91，P＜0.05)。模型對照組與氧氣灌腸組間大鼠視網膜的HIF-1α mRNA表達值比較，差異無統計學意義(t=1.78，P＞0.05)。
3 討論
高脂高糖飲食加STZ注射誘導DM動物模型穩定性好，有較好的實用性，成模率可達80%以上，甚至100%[3, 6]。因此，我們選用SD大鼠作為研究對象，成模率達92%。臭氧作為強氧化劑之一，可減少組織中氧化應激反應，減少組織需氧量，改善組織及細胞的缺血缺氧狀況[3, 7]。由于灌腸操作簡單易行，我們選擇灌腸方式對大鼠進行臭氧干預。臭氧干預劑量則參照成人臭氧治療劑量按比例換算而來。臭氧干預后，用RT-PCR檢測視網膜HIF-1α mRNA表達。HIF-1α是細胞中主要的缺氧反應信號蛋白。在常氧條件下，HIF-1α mRNA在細胞和組織中表達低于檢測水平[8]。但在低氧條件處理30 min后，HIF-1α mRNA會被誘導出來，1 h后達到高峰[9]。因此，HIF-1α能準確反映機體的氧代謝狀態。
光學顯微鏡觀察，DM大鼠視網膜內外核層細胞減少、分布不均勻、層次模糊，內核層細胞間隙增大，并伴有空泡化，神經節細胞水腫，染色淡，內叢狀層疏松，視椎、視桿細胞外節可見空泡化改變，視網膜小血管淤血。電子顯微鏡觀察也證實了DM大鼠視網膜超微結構變化。表明視網膜在高糖環境下因缺氧已發生應激反應，并出現相應的病理性改變。相對于模型對照、氧氣灌腸組，臭氧灌腸組大鼠視網膜出現的病理性改變較輕微，神經節細胞淡染，Müller細胞線粒體嵴輕度水腫、變短或消失，膜盤輕度排列紊亂。表明臭氧干預可以改善DM大鼠視網膜結構改變。RT-PCR檢測結果顯示，臭氧灌腸組大鼠視網膜HIF-1α mRNA表達明顯下調，而模型對照組、氧氣灌腸組與臭氧灌腸組的HIF-1α mRNA表達比較，差異有統計學意義。進一步表明臭氧可以改善DM大鼠視網膜組織缺氧狀態，減少HIF-1α的表達。既往的研究表明，臭氧不僅可激活抗氧化系統，提高抗氧化酶活性，使得組織中氧化應激反應減少，減少組織需氧量，而且還增加血液攜氧量及組織供氧量，提高氧分壓，使得組織及細胞的缺血缺氧狀況得到改善[3, 7]。此外，臭氧可以降低毛細血管通透性，增加微血管血流量[10]。因此，我們推測，臭氧通過活化紅細胞、抗氧化作用等多種途徑來改善DM大鼠視網膜缺氧狀態。但其確切機制還有待進一步研究。
本研究也有不足之處。臭氧灌腸雖然簡單經濟，但劑量控制性差，更有效的應用方法及劑量還有待研究。總體樣本量小，檢測時間點及檢測指標單一，缺乏更多的抗氧化酶指標及其mRNA、蛋白表達結果。
高血糖可以通過激酶和轉錄因子活化上調生長因子的表達，破壞內皮細胞、周細胞功能及血視網膜屏障促進新生血管生成[1]。臭氧作為一種強氧化劑，可以通過激活抗氧化酶和自由基清除系統，刺激各種抗氧化酶活性，清除自由基，促進新陳代謝[2]。有研究表明，臭氧可以改善糖尿病(DM)大鼠腎臟組織缺氧狀態，減少氧化應激反應，組織中過氧化氫酶、過氧化歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等有顯著改變[3]。臭氧治療能否預防DM視網膜病變(DR)發展報道尚少。我們通過觀察臭氧治療的DM大鼠視網膜組織病理改變，同時檢測臭氧治療與未治療的DM大鼠視網膜中缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)表達的差異，以探討臭氧對DM大鼠視網膜結構及HIF-1α表達的影響。
1 材料和方法
3月齡無特定病原體級Spraque-Dawley(SD)雄性大鼠70只，體重300~320g。大鼠由新疆醫科大學動物實驗中心提供[許可證號為SCXK(新)2003-0001]。參照文獻[4]的方法建立DM模型。大鼠適應性喂養4周，隨機抽取10只大鼠作為空白對照組，普通喂養。余下60只大鼠接受高脂高糖飲食喂養45d，禁食不禁水12 h后腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，誘導建立DM模型。STZ用新鮮配制的無菌、pH4.3~4.5的0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液稀釋，終溶液中STZ濃度為10 g/L，根據體重按30 mg/kg一次性腹腔注射。注射后72 h和1周割尾取血檢測血糖，兩次血糖值均≥16.7 mmol/L者即為DM大鼠造模成功。共造模成功55只，造模成功率為92%。將其隨機分為模型對照、臭氧灌腸、氧氣灌腸組。各組分別為18、19、18只大鼠。繼續高脂高糖飲食喂養1個月，后改為普通喂養。造模成功1個月后，參照文獻[5]的方法，臭氧灌腸、氧氣灌腸組大鼠根據體重按50 μg/kg分別緩慢直腸灌入臭氧、氧氣，灌入后均按住肛門保持5 min，2次/周，連續灌腸治療4周。空白對照組、模型對照組不行任何處理。末次灌腸后1周，腹腔內注射適量氯胺酮麻醉大鼠，迅速摘取眼球。觀察視網膜超微結構及組織病理改變。將摘取的左側眼球置于2.5%戊二醛中固定1 h，去掉眼前節，剪取2 mm×3 mm的視網膜組織塊再次放入新鮮的2.5%戊二醛中繼續固定24 h，經過脫水、包埋、固化、切片，經醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后采用日立h-600透射電子顯微鏡觀察并拍照。將左眼剩余視網膜及右眼視網膜放入4%甲醛中固定48 h以上，經過組織脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色后采用Olympus CH20光學顯微鏡觀察并拍照。
逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測視網膜的HIF-1α mRNA的表達。將眼球沿鋸齒緣剪開，分離出視網膜組織，稱濕重后立即放入液氮中3 min，最后置于-80 ℃保存。應用Trizol提取試劑盒(美國Invitrogen公司)提取視網膜總RNA，測定總RNA濃度、純度。采用Primer 5．0引物設計軟件設計引物序列，由上海生工生物工程公司合成引物。其中，HIF-1α上游引物5′-TCGGCGAAGTAAAGAATCTGAA-3′，下游引物5′-CAAATCACCAGCATCCAGAAGT-3′；內參照β-肌動蛋白(β-actin)上游引物：5′-ACTGCCCTG GCTCCTAGCA-3′，下游引物5′-GCCAGGATAGAGCCACCA ATC-3′。應用反轉錄試劑盒(寶生物大連有限公司)和Cycler聚合酶鏈式反應儀(美國Bio-Rad公司)進行逆轉錄、擴增。應用Leica DM 3000采圖系統檢測HIF-1α與β-actin吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值，兩者比值為HIF-1α mRNA的表達量。
所得實驗結果均采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。計量資料的描述用均數±標準差(
2 結果
光學顯微鏡觀察，空白對照組大鼠視網膜組織學形態基本正常。模型對照組大鼠視網膜各層結構基本規則，內外核層細胞減少、分布不均勻、層次模糊，內核層細胞間隙增大，并伴有空泡化，神經節細胞水腫，染色淡，內叢狀層疏松，視椎、視桿細胞外節可見空泡化改變，視網膜小血管淤血(圖 1)。臭氧灌腸組大鼠視網膜各層結構規則，內外核層細胞分布均勻、層次清楚，內核層細胞排列較疏松，神經節細胞染色稍淡(圖 2)。氧氣灌腸組大鼠視網膜組織各層細胞排列紊亂、間隙增大，并伴有空泡化，神經節細胞淡染。
圖1
模型對照組大鼠視網膜光學顯微鏡像。神經節細胞水腫，內網狀層疏松，內外核層細胞減少，排列不規則，細胞間隙增大并有空泡化，視椎、視桿細胞外節可見空泡化改變，小血管淤血HE ×400??圖 2??臭氧灌腸組大鼠視網膜光學顯微鏡像。視網膜各層結構分明、內核層細胞排列輕度疏松、神經節細胞淡染HE ×400
透射電子顯微鏡觀察，空白對照組大鼠視網膜超微結構未見異常。模型對照組大鼠視網膜神經節細胞層及神經纖維層細胞線粒體數量減少，部分空泡化，嵴水腫、斷裂或缺失，細胞核核膜不連續，核周間隙增大，染色質出現邊集(圖 3A)；Müller細胞核周胞質及突起內線粒體水腫明顯，出現空泡，嵴斷裂、缺失；內外核層細胞排列疏松、紊亂，間隙擴大，可見細胞核固縮(圖 3B)；外節膜盤排列紊亂，間隙增大(圖 3C)；視網膜血管基底膜明顯增厚并且出現多處分叉及融合現象(圖 3D)。臭氧灌腸組大鼠視網膜神經節細胞層及神經纖維層未見明顯異常；Müller細胞線粒體嵴輕度水腫、變短或消失(圖 4A)；內外核層細胞排列規則，細胞核大(圖 4B)；視錐視桿細胞層膜盤靠近視網膜色素上皮層區可見輕度排列紊亂(圖 4C)；其余結構未見明顯異常，血管基底膜未見明顯增厚(圖 4D)。氧氣灌腸組大鼠視網膜神經節細胞層、神經纖維層細胞核固縮，線粒體水腫并減少，Müller細胞出現空泡化，外節膜盤排列疏松，血管基底膜較臭氧灌腸組增厚。
圖3
模型對照組大鼠視網膜電子顯微鏡像。3A.神經節細胞內線粒體水腫，核仁偏向一側醋酸鈾、檸檬酸鉛×4000；3B.外核層細胞排列疏松、紊亂，間隙擴大，細胞核固縮醋酸鈾、檸檬酸鉛×4000；3C.視桿視錐細胞層內外節膜盤排列紊亂，間隙增大醋酸鈾、檸檬酸鉛×4000；3D.血管基底膜明顯增厚并且出現多處分叉及融合現象醋酸鈾、檸檬酸鉛×12000??圖 4??臭氧灌腸組大鼠視網膜電子顯微鏡像。4A.Müller細胞線粒體嵴輕度水腫、變短或消失醋酸鈾、檸檬酸鉛×4000；4B.外核層細胞排列規則，細胞核大醋酸鈾、檸檬酸鉛×4000；4C.視桿錐桿細胞層膜盤靠近視網膜色素上皮層區可見輕度排列紊亂醋酸鈾、檸檬酸鉛×4000；4D.血管基底膜未見明顯增厚醋酸鈾、檸檬酸鉛×12000
空白對照、臭氧灌腸、模型對照、氧氣灌腸組大鼠視網膜的HIF-1α mRNA表達值分別為2.3±0.3、1.8±0.4、2.8±0.3、2.8±0.5。4組間大鼠視網膜的HIF-1α mRNA表達值比較，差異有統計學意義(F=1 178.625，P＜0.05)。空白對照組與臭氧灌腸組、模型組、氧氣灌腸組組間大鼠視網膜的HIF-1α mRNA表達值比較，差異有統計學意義(t=20.83、20.67、19.29，P＜0.05)。臭氧灌腸組與模型對照、氧氣灌腸組組間大鼠視網膜的HIF-1α mRNA表達值比較，差異有統計學意義(t=51.65、49.91，P＜0.05)。模型對照組與氧氣灌腸組間大鼠視網膜的HIF-1α mRNA表達值比較，差異無統計學意義(t=1.78，P＞0.05)。
3 討論
高脂高糖飲食加STZ注射誘導DM動物模型穩定性好，有較好的實用性，成模率可達80%以上，甚至100%[3, 6]。因此，我們選用SD大鼠作為研究對象，成模率達92%。臭氧作為強氧化劑之一，可減少組織中氧化應激反應，減少組織需氧量，改善組織及細胞的缺血缺氧狀況[3, 7]。由于灌腸操作簡單易行，我們選擇灌腸方式對大鼠進行臭氧干預。臭氧干預劑量則參照成人臭氧治療劑量按比例換算而來。臭氧干預后，用RT-PCR檢測視網膜HIF-1α mRNA表達。HIF-1α是細胞中主要的缺氧反應信號蛋白。在常氧條件下，HIF-1α mRNA在細胞和組織中表達低于檢測水平[8]。但在低氧條件處理30 min后，HIF-1α mRNA會被誘導出來，1 h后達到高峰[9]。因此，HIF-1α能準確反映機體的氧代謝狀態。
光學顯微鏡觀察，DM大鼠視網膜內外核層細胞減少、分布不均勻、層次模糊，內核層細胞間隙增大，并伴有空泡化，神經節細胞水腫，染色淡，內叢狀層疏松，視椎、視桿細胞外節可見空泡化改變，視網膜小血管淤血。電子顯微鏡觀察也證實了DM大鼠視網膜超微結構變化。表明視網膜在高糖環境下因缺氧已發生應激反應，并出現相應的病理性改變。相對于模型對照、氧氣灌腸組，臭氧灌腸組大鼠視網膜出現的病理性改變較輕微，神經節細胞淡染，Müller細胞線粒體嵴輕度水腫、變短或消失，膜盤輕度排列紊亂。表明臭氧干預可以改善DM大鼠視網膜結構改變。RT-PCR檢測結果顯示，臭氧灌腸組大鼠視網膜HIF-1α mRNA表達明顯下調，而模型對照組、氧氣灌腸組與臭氧灌腸組的HIF-1α mRNA表達比較，差異有統計學意義。進一步表明臭氧可以改善DM大鼠視網膜組織缺氧狀態，減少HIF-1α的表達。既往的研究表明，臭氧不僅可激活抗氧化系統，提高抗氧化酶活性，使得組織中氧化應激反應減少，減少組織需氧量，而且還增加血液攜氧量及組織供氧量，提高氧分壓，使得組織及細胞的缺血缺氧狀況得到改善[3, 7]。此外，臭氧可以降低毛細血管通透性，增加微血管血流量[10]。因此，我們推測，臭氧通過活化紅細胞、抗氧化作用等多種途徑來改善DM大鼠視網膜缺氧狀態。但其確切機制還有待進一步研究。
本研究也有不足之處。臭氧灌腸雖然簡單經濟，但劑量控制性差，更有效的應用方法及劑量還有待研究。總體樣本量小，檢測時間點及檢測指標單一，缺乏更多的抗氧化酶指標及其mRNA、蛋白表達結果。
