黃斑區是形成空間視力和色覺的關鍵解剖結構，黃斑區疾病嚴重威脅患者的視覺功能及生活質量。非人靈長類動物（NHP）是唯一擁有類似人類黃斑結構的哺乳動物，因此在研究黃斑區疾病方面具有重要價值。目前，多種方法包括自發性、基因編輯、藥物誘導、光誘導及機械性損傷等，可用于篩選和構建NHP模型，用于研究眼皮膚白化病、全色盲、視網膜色素變性、老年性黃斑變性及一些罕見的眼部綜合征。在構建NHP模型時，應充分考慮其他動物模型，以實現模型之間的互補研究。此外，應充分發揮非人靈長類的資源優勢，創建具有可控遺傳背景的靈長類品系，有助于早日實現可持續利用的目標
黃斑是靈長類動物特有視網膜區域，其在空間視力和色覺形成的過程中有重要作用，該區域具有特殊的解剖結構，包括中心凹、旁中心凹和中心凹周圍區，中心凹部由對強光和色覺刺激極為敏感的視錐細胞組成，特殊的細胞走形結構，使光線可直達視錐細胞[1]。視覺是靈長類信息感知的關鍵，而黃斑區為視覺形成最敏銳的區域，因此該區域發生病變將嚴重影響患者的視覺功能。黃斑變性性疾病及黃斑營養不良性疾病發展至中晚期形成黃斑萎縮性病變，主要表現為視網膜外層、視網膜色素上皮（RPE）層、Bruch膜以及脈絡膜毛細血管等逐漸萎縮。針對黃斑萎縮性疾病，目前尚無明確有效的治療方法。
非人靈長類動物（NHP）具有與人類相似的黃斑結構。其視網膜病變的組織病理學也與人類相近[2]。研究表明，舊世界猴獼屬中的恒河猴與人類存在極高的基因同源性[3]，且與人類老年性黃斑變性（AMD）存在相同基因型-表型關聯[4]。NHP模型成為探索黃斑疾病發病機制的重要模型。現就NHP黃斑疾病模型的研究進展作一綜述。
1 自發性疾病動物模型
自發性疾病動物模型常為未經任何有意識的人工處理，自然條件下發生或基因突變獲得的動物模型。
1.1 自發性眼皮膚白化病模型
筆者團隊[5]研究報道，6只（1～10歲齡）自發性眼皮膚白化病的恒河猴模型主要表現為毛發和皮膚呈粉紅色，同時伴有水平眼球震動、虹膜色素脫失。眼底彩照及光相干斷層掃描（OCT）檢查可見黃斑周圍色素脫失、缺少黃斑結構。基因組測序檢查表明酪氨酸酶基因中存在一對等位基因突變，眼皮膚白化病2型基因中存在純合突變，兩者均可影響黑色素的合成。該動物模型也可成為眼皮膚白化病臨床研究和治療的臨床前模型。
1.2 全色盲及視網膜色素變性模型。
Moshiri等[6]研究報道，自發性全色盲的恒河猴模型定向異常，需要通過觸覺對新環境進行感知和探索。眼底彩照，OCT及眼底自身熒光檢查可見黃斑區反光異常，黃斑薄變，黃斑周圍強熒光與弱熒光交錯。視網膜電圖（ERG）檢查可見視桿細胞正常，視錐細胞反應缺失。全外顯子測序顯示編碼視錐細胞磷酸二酯酶6C的基因出現純合的錯義突變（R565Q），導致光轉導過程酶受損，該基因突變可導致全色盲。該模型可作為全色盲后續基因替代、基因編輯治療及感光細胞移植治療的理想模型[7]。Ikeda等[8]對日本某地區1 443只食蟹猴行眼底篩查，發現1組視網膜色素變性的家系，1只14歲齡的雌猴出現雙眼視網膜變性合并黃斑囊樣水腫，全視野ERG檢查未見可記錄的波形，OCT檢查可見旁中心凹區域外節消失。此外，上述雌猴3歲的外甥雙眼眼底后部血管弓旁色素缺失，暗適應ERG檢查未記錄到波形，光適應ERG檢查可見波形顯著降低。OCT檢查可見周邊視網膜外節變薄。Peterson等[9]研究報道，3只BBS7基因3號外顯子移碼突變（c.160delG）的恒河猴。BBS基因突變表現為巴德畢氏綜合征（BBS），其為一組以視網膜色素變性，腎臟功能異常，多指/趾，肥胖和/或性腺機能減退的疾病。3只恒河猴出現嚴重的光感受器損害及進行性腎臟疾病，OCT檢查可見光感受器的缺失，RPE變性及視網膜血管的萎縮，電生理檢查可見不同波形的減弱或消失。該模型不僅可以加深對該BBS疾病進展的了解，同時也可成為基因及細胞治療的動物模型。
1.3 玻璃膜疣樣模型
玻璃膜疣為干性AMD的病理改變。Yiu等[10]對65只老年恒河猴行眼底篩查發現，30.7%恒河猴出現玻璃膜疣樣改變，OCT檢查可見帶有玻璃膜疣的眼RPE較對照組稍厚。Zeng等[11]對156只老年食蟹猴行眼底篩查，其中15只發現眼部異常，11只視網膜出現玻璃膜疣改變，不合并“地圖樣”萎縮以及漿液性或血液性視網膜脫離。11只猴子的雙眼出現“豹紋狀”眼底改變，不伴漆裂紋等，此外3只猴子眼底出現近視性脈絡膜新生血管。Gouras等[12]對121只高齡的恒河猴（10～39歲）進行眼底篩查，探究飲食對玻璃膜疣樣結構產生的影響。其中61%的猴子出現玻璃膜疣樣黃斑病變，且隨著年齡患病率及病變嚴重程度升高，但未發現“地圖樣”萎縮及新生血管形成。Francis等[4]研究發現，與人類AMD存在相關性的基因LOC387715/ARMS2和HTRA1在恒河猴中同樣存在致病關系。上述基因同樣在玻璃膜疣產生方面發揮重要作用，且HTRA1基因的多態性以雙倍效果增加后續基因的表達。大規模動物篩選還可為某些指標制定提供參考依據，Maloca等[13]對203例374只眼食蟹猴行OCT檢查，并采用深度學習定量測量中心凹脈絡膜厚度，得出其平均值為192.83 μm，其變異系數為7.8%。進一步分析發現中心凹脈絡膜厚度與性別及地域無關。
可通過篩查發現自發性眼皮膚白化病、全色盲、視網膜色素變性、黃斑區玻璃膜疣樣改變的NHP模型，但篩選過程中均未發現嚴重“地圖樣”萎縮，提示此類病變處在疾病發展過程中的中晚期，且NHP和人類在該疾病上存在差異。大規模篩選常需耗費大量的人力、物力，且并不一定能完全篩選出符合預期的動物模型，因此常不作為首選的造模方式。
2 基因編輯模型
基因編輯技術不僅可以定向編輯突變的基因用于治療疾病，還可以通過敲入或敲除基因構建臨床表型。Winkler等[14]研究報道，遺傳性視網膜病變的基因突變位點主要分為光傳導相關基因突變（RHO、PDE6A、PDE6B、PDE6C等基因），視循環相關基因突變（ABCA4、RPE65等基因），離子通道相關基因突變（CNGA3，CNGB3等基因），纖毛病變相關基因突變（BBS4、BBS7、RPGR等基因），光感受器發育相關基因突變（CRX、STK38L等基因），光感受器向雙極細胞發育相關基因突變（LRIT3、TRPM1等基因），結構及其他基因突變（ADAM9、SLC4A3等基因）。
筆者團隊[15]通過視網膜下注射腺相關病毒（AAV）介導的成簇的規律間隔的短回文重復序列（CRISPR）及其相關核酸酶9系統（CRISPR/Cas9）的基因編輯技術敲除CNGB3基因構建模型。CNGA3和CNGB3基因編碼視錐細胞光感受器中環鳥苷單磷酸門控陽離子通道的兩個亞基，其突變后常可導致全色盲。該研究共納入3只恒河猴，其中2只在注射后150 d處死后取樣行單細胞測序，另1只用于長期觀察。免疫組織化學染色和單細胞測序提示CRISPR/Cas9的體內靶向效率為12%～14%。ERG檢查可見中央視網膜波幅降低。此外，心臟、肝臟和腎臟中未檢測到CRISPR/Cas9的殘留。Li等[16]采用視網膜下注射AAV介導的CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除NHP視桿細胞RHO基因，建立非人靈長類視網膜色素變性模型。在AAV注射19周后，可見感光細胞層被高效轉染，并觀察到在視桿細胞發生明顯退化后，視錐細胞出現顯著退化。而在注射8個月后，感光細胞幾乎全部死亡，膠質細胞活化。OCT檢查可見獼猴視網膜外核層變薄且呈進行性退化。離體ERG檢查可見視網膜感光細胞光反應明顯受損。Ryu等[17]通過CRISPR/Cas9基因編輯技術在恒河猴胚胎中敲除MYO7A基因構建Usher綜合征1B型。恒河猴模型在出生后2、4、6、9、12個月行彩色眼底照相、OCT、眼底自發熒光以及超廣角眼底成像檢查，僅可見內層及外層視網膜的輕度薄變。其可能與未對周邊視網膜進行OCT檢查、模型尚未到NHP出現眼部表型的時間、MYO7A的基因型表型關系尚存在爭議等有關。
為使AAV介導的基因編輯技術更方便的應用于NHP模型的構建，常需進行玻璃體腔或視網膜下注射的操作。Teo等[18]研究報道，其對6只食蟹猴眼行玻璃體切割手術（PPV）制造玻璃體后脫離，之后進行黃斑區內界膜剝除手術，氣液交換治療，將AAV2-綠色熒光蛋白覆蓋黃斑區，對照組為2只行PPV后未行內界膜剝除手術的食蟹猴。16周后經熒光顯微鏡檢查可見實驗組熒光區域較對照組大，且強度更高。免疫組織化學染色實驗組可見Müller細胞層，神經節細胞層及感光細胞層熒光標記，而對照組僅在神經纖維層可見熒光標記。PPV聯合內界膜剝除手術可提高玻璃體腔注射AAV對視網膜細胞的轉染效率，更有利于模型的構建。
3 藥物誘導模型
研究表明，某些藥物聯合特定的注射部位可以造成視網膜細胞的損傷，進一步構建黃斑萎縮性疾病的動物模型。Gao等[19]通過對14只28只眼1～4歲健康食蟹猴行視網膜下注射硝普鈉構建視網膜變性模型。其中6只眼注射0.05 mM硝普鈉，14只眼注射0.1 mM硝普鈉，5只眼注射0.2 mM硝普鈉，剩余3只眼作為正常對照組。研究結果表明，0.1 mM的硝普鈉進行視網膜下注射可有效構建外核層以及RPE的缺失，且較為穩定，但硝普鈉用于構建模型的機制尚不明確。Shirai等[20]曾采用視網膜下注射40 μL濃度為0.4 mg/ml的氯化鈷構建視網膜變性模型用于干細胞移植治療，該濃度和劑量會導致視網膜內/外核層均出現損害，采用0.2 mg/ml的濃度不會導致外核層改變。而采用0.25 mg/ml及0.3 mg/ml劑量的氯化鈷注射后，可出現外核層厚度降低，直至7個月后仍未改善。Lingam等[21]研究報道，黃斑區行PPV后視網膜下注射0.3 mg/ml的氯化鈷。OCT檢查可見輕到中度的外核層缺失，注射后4個月仍可見到外層視網膜持續的損傷以及橢圓體帶的紊亂。眼底自身熒光可見注射區域呈現強自發熒光，提示視網膜下注射氯化鈷可導致光感受器及RPE的損傷。
除采用視網膜下注射硝普鈉及氯化鈷構建視網膜損傷模型，Ou等[22]采用玻璃體腔注射氧化劑碘酸鈉構建視網膜變性模型。對比靜脈注射與玻璃體腔注射的效果差異，證實經靜脈注射可造成致命性的副作用，且對視覺功能造成的損傷可自行修復，無法制造有效的模型。玻璃體腔注射高濃度（75 mg/kg）的碘酸鈉可有效構造急性、嚴重的視網膜損傷模型，聯合抗氧化劑谷胱甘肽這類可有效緩解碘酸鈉造成的急性損傷，用于亞急性視網膜變性模型的構建，但該方法對視網膜內層結構同樣造成嚴重損害。硝普鈉、氯化鈷及碘酸鈉等藥物聯合特殊部位的注射可以造成視網膜感光細胞的損傷，用于黃斑萎縮性疾病，如AMD動物模型的構建。
4 光誘導模型
4.1 激光誘導構建動物模型
采用不同的激光類型、波長、光斑直徑、能量和曝光時間等參數可造成視網膜不同位置和程度的視網膜損傷，用于構建NHP黃斑變性模型。Shirai[20]等采用577 nm的光泵浦半導體激光照射后行眼底檢查可見到視網膜局灶性的光感受器損傷，造模4 d行眼底檢查可見局灶性白色激光斑，眼底自身熒光檢查可見呈強熒光，造模2個月眼底檢查可見激光斑變淡，眼底自身熒光檢查可見弱熒光。Tu等[23]采用OPSL PASCAL激光對1只8歲的食蟹猴和1只6歲的恒河猴眼底行直徑為100 μm的光斑、16點位的照射，中間為0 μm的間隔，時間為15 ms。分別在62 d、53 d行細胞移植，證實此時已達到視網膜變性模型的標準。Liu等[24]采用532nm 晶體倍頻激光構建AMD的“地圖樣”萎縮模型，將激光照射后15分鐘、1個月、2個月、3.5個月和4.5個月。OCT檢查可見該激光照射后視網膜內層未出現損傷，但光感受器層出現變性，RPE損傷同時伴有新生血管的出現，病灶處的脈絡膜出現退行性改變。多焦ERG檢查可見相較于對照組，激光照射部位的波幅在1個月后即呈現一致性下降。Strazzeri等[25]采用局灶性激光照射獼猴視網膜構建光感受器損傷模型，共照射12點位，其中6點位距離黃斑中心凹小于7°（波長647 nm，時間0.02～0.2 s，強度為100～260 mW）。激光照射24 h后可見部分病灶熒光素滲漏，OCT檢查可見外核層高反射伴隨著黃斑周圍Henle纖維移位。蘇木精-伊紅染色可見視網膜外核層損傷。自適應光學OCT檢查可見損傷部位的神經節細胞、內層視網膜結構完整，未受到深層視網膜損傷的影響。該模型可用于輔助驗證對于外層視網膜損傷的患者通過刺激內層視網膜恢復視覺功能的可行性，并為后續視覺假體的應用提供有效的動物模型。Dhakal等[26]對8只獼猴行近紅外激光檢查，激光定位在視網膜外核層，共照射187個點位，照射視野范圍為0.79°×0.87°～1.19°×1.39°，激光能量為50 mW～210 mW。研究結果顯示，該激光模型可有效損傷視網膜外核層，對視網膜神經節細胞層及內層視網膜的血流供應無損傷。
4.2 藍光誘導構建動物模型
藍光的光毒性可誘導光感受器和RPE損傷，構建“地圖樣”萎縮模型。Rajagopalan等[27]采用470 nm藍光（300 W）分別對3例6只眼食蟹猴分別照射5、10、15、20、25、30 min。第1 d可見6只眼均呈弱熒光。2周及4周后，25 min及30 min照射組呈更明顯的弱熒光，視網膜外核層呈進行性變薄，多焦點ERG可見b波幅度降低。蘇木精-伊紅染色及免疫熒光染色提示感光細胞進行性變性，RPE細胞呈不同程度的纖維化，且伴隨著RPE細胞擴大、變圓、色素異常分布及缺失。此研究證實過量的藍光照射可以損害RPE及光感受器細胞。
4.3 光動力療法對脈絡膜的改變
Cheong等[28]通過靜脈注射及肌肉注射腎上腺素模擬中心性漿液性脈絡膜視網膜病變模型，大隱靜脈靜脈注射3mg/m2光敏劑維替泊芬。6只食蟹猴分為單純光動力療法組（1只2眼）、靜脈用腎上腺素8周組（1只2眼）、靜脈用腎上腺素8周聯合第4周光動力療法組（2只4眼）以及靜脈用腎上腺素12周聯合第8周光動力療法組（2只4眼）。OCT檢查及甲苯胺藍染色可見脈絡膜血管擴張，脈絡膜厚度增加。光動力療法可通過減少脈絡膜基質的成分降低脈絡膜厚度。但是否可通過增加光敏劑注射劑量聯合激光照射強度的方法對脈絡膜基質進行損害仍有待于后續研究。
既往研究均采用激光誘導方式構建非人靈長類脈絡膜新生血管模型[29]，且相應的模型可被用于驗證玻璃體腔注射表達抗血管內皮生長因子的AAV是否可達到治療作用的目的[30]。激光、藍光照射可誘導光感受器、RPE及脈絡膜的損害，用于構建AMD模型。而光動力療法可否用于脈絡膜損傷模型的構建仍需進一步探討。
5 機械性構建動物模型
采用機械性損傷的方式對視網膜外核層、RPE等進行破壞，同樣可用于構建黃斑損傷模型。采用機械性損傷RPE的方法構建可用于視網膜下RPE植片移植的模型。主要步驟為PPV后行視網膜下注射平衡鹽溶液，黃斑區視網膜脫離后采用視網膜剪擴大視網膜進針口，將特殊的設備延伸至視網膜下機械性破壞RPE，為后續植片的移植創造條件。必要時可在PPV前行玻璃體腔注射0.25 μg/μL組織型纖溶酶原激活物，有利于松解RPE和神經上皮的連接，便于后續構建視網膜脫離[31-32]。
Thieltges等[33]研究報道，20G管徑的器械，器械頭部與手柄部呈15°彎曲，尖端帶有3.5 mm可伸縮的環形設備用于對組織的機械性損傷。Teo等[18]探討行視網膜下注射這一操作過程對視網膜組織的損傷。注射過程中可見全層及近全層的神經視網膜脫離，黃斑撕裂以及輕至重度的黃斑囊樣水腫。如視網膜下注射200～300 μL平衡鹽溶液，眼內壓升高，在PPV后2～4周便可見視網膜外界膜連續，外核層出現薄變，黃斑區結構破壞。因此，可采用機械性損傷的方式對視網膜外核層、RPE和脈絡膜層進行破壞，以此構建黃斑區萎縮性模型。
6 小結與展望
自發性、基因編輯、藥物誘導、光誘導及機械性損傷等方式可構建眼皮膚白化病、全色盲、視網膜色素變性、AMD及罕見的眼部綜合征等NHP模型。與傳統的小鼠等實驗動物模型相比，NHP的視網膜結構與人類高度相似，且大小幾乎與人類相當，因此在構建黃斑疾病模型時，NHP具有顯著的研究優勢。然而NHP模型的使用也面臨一些限制。首先，NHP研究受到倫理嚴格的限制。其次，維護和繁殖NHP的成本相對較高，通常需要特殊的繁育設施和專業知識，這些因素都可能會增加了NHP模型的復雜性和成本。因此，在構建NHP模型時，研究人員應充分考慮這些局限性，積極結合其他動物模型的優勢，實現模型之間的互補研究。此外，應該最大程度地發揮非人靈長類動物資源的優勢，積極努力創建具有可控遺傳背景的靈長類品系，以爭取早日實現這些寶貴資源的可持續利用。
黃斑是靈長類動物特有視網膜區域，其在空間視力和色覺形成的過程中有重要作用，該區域具有特殊的解剖結構，包括中心凹、旁中心凹和中心凹周圍區，中心凹部由對強光和色覺刺激極為敏感的視錐細胞組成，特殊的細胞走形結構，使光線可直達視錐細胞[1]。視覺是靈長類信息感知的關鍵，而黃斑區為視覺形成最敏銳的區域，因此該區域發生病變將嚴重影響患者的視覺功能。黃斑變性性疾病及黃斑營養不良性疾病發展至中晚期形成黃斑萎縮性病變，主要表現為視網膜外層、視網膜色素上皮（RPE）層、Bruch膜以及脈絡膜毛細血管等逐漸萎縮。針對黃斑萎縮性疾病，目前尚無明確有效的治療方法。
非人靈長類動物（NHP）具有與人類相似的黃斑結構。其視網膜病變的組織病理學也與人類相近[2]。研究表明，舊世界猴獼屬中的恒河猴與人類存在極高的基因同源性[3]，且與人類老年性黃斑變性（AMD）存在相同基因型-表型關聯[4]。NHP模型成為探索黃斑疾病發病機制的重要模型。現就NHP黃斑疾病模型的研究進展作一綜述。
1 自發性疾病動物模型
自發性疾病動物模型常為未經任何有意識的人工處理，自然條件下發生或基因突變獲得的動物模型。
1.1 自發性眼皮膚白化病模型
筆者團隊[5]研究報道，6只（1～10歲齡）自發性眼皮膚白化病的恒河猴模型主要表現為毛發和皮膚呈粉紅色，同時伴有水平眼球震動、虹膜色素脫失。眼底彩照及光相干斷層掃描（OCT）檢查可見黃斑周圍色素脫失、缺少黃斑結構。基因組測序檢查表明酪氨酸酶基因中存在一對等位基因突變，眼皮膚白化病2型基因中存在純合突變，兩者均可影響黑色素的合成。該動物模型也可成為眼皮膚白化病臨床研究和治療的臨床前模型。
1.2 全色盲及視網膜色素變性模型。
Moshiri等[6]研究報道，自發性全色盲的恒河猴模型定向異常，需要通過觸覺對新環境進行感知和探索。眼底彩照，OCT及眼底自身熒光檢查可見黃斑區反光異常，黃斑薄變，黃斑周圍強熒光與弱熒光交錯。視網膜電圖（ERG）檢查可見視桿細胞正常，視錐細胞反應缺失。全外顯子測序顯示編碼視錐細胞磷酸二酯酶6C的基因出現純合的錯義突變（R565Q），導致光轉導過程酶受損，該基因突變可導致全色盲。該模型可作為全色盲后續基因替代、基因編輯治療及感光細胞移植治療的理想模型[7]。Ikeda等[8]對日本某地區1 443只食蟹猴行眼底篩查，發現1組視網膜色素變性的家系，1只14歲齡的雌猴出現雙眼視網膜變性合并黃斑囊樣水腫，全視野ERG檢查未見可記錄的波形，OCT檢查可見旁中心凹區域外節消失。此外，上述雌猴3歲的外甥雙眼眼底后部血管弓旁色素缺失，暗適應ERG檢查未記錄到波形，光適應ERG檢查可見波形顯著降低。OCT檢查可見周邊視網膜外節變薄。Peterson等[9]研究報道，3只BBS7基因3號外顯子移碼突變（c.160delG）的恒河猴。BBS基因突變表現為巴德畢氏綜合征（BBS），其為一組以視網膜色素變性，腎臟功能異常，多指/趾，肥胖和/或性腺機能減退的疾病。3只恒河猴出現嚴重的光感受器損害及進行性腎臟疾病，OCT檢查可見光感受器的缺失，RPE變性及視網膜血管的萎縮，電生理檢查可見不同波形的減弱或消失。該模型不僅可以加深對該BBS疾病進展的了解，同時也可成為基因及細胞治療的動物模型。
1.3 玻璃膜疣樣模型
玻璃膜疣為干性AMD的病理改變。Yiu等[10]對65只老年恒河猴行眼底篩查發現，30.7%恒河猴出現玻璃膜疣樣改變，OCT檢查可見帶有玻璃膜疣的眼RPE較對照組稍厚。Zeng等[11]對156只老年食蟹猴行眼底篩查，其中15只發現眼部異常，11只視網膜出現玻璃膜疣改變，不合并“地圖樣”萎縮以及漿液性或血液性視網膜脫離。11只猴子的雙眼出現“豹紋狀”眼底改變，不伴漆裂紋等，此外3只猴子眼底出現近視性脈絡膜新生血管。Gouras等[12]對121只高齡的恒河猴（10～39歲）進行眼底篩查，探究飲食對玻璃膜疣樣結構產生的影響。其中61%的猴子出現玻璃膜疣樣黃斑病變，且隨著年齡患病率及病變嚴重程度升高，但未發現“地圖樣”萎縮及新生血管形成。Francis等[4]研究發現，與人類AMD存在相關性的基因LOC387715/ARMS2和HTRA1在恒河猴中同樣存在致病關系。上述基因同樣在玻璃膜疣產生方面發揮重要作用，且HTRA1基因的多態性以雙倍效果增加后續基因的表達。大規模動物篩選還可為某些指標制定提供參考依據，Maloca等[13]對203例374只眼食蟹猴行OCT檢查，并采用深度學習定量測量中心凹脈絡膜厚度，得出其平均值為192.83 μm，其變異系數為7.8%。進一步分析發現中心凹脈絡膜厚度與性別及地域無關。
可通過篩查發現自發性眼皮膚白化病、全色盲、視網膜色素變性、黃斑區玻璃膜疣樣改變的NHP模型，但篩選過程中均未發現嚴重“地圖樣”萎縮，提示此類病變處在疾病發展過程中的中晚期，且NHP和人類在該疾病上存在差異。大規模篩選常需耗費大量的人力、物力，且并不一定能完全篩選出符合預期的動物模型，因此常不作為首選的造模方式。
2 基因編輯模型
基因編輯技術不僅可以定向編輯突變的基因用于治療疾病，還可以通過敲入或敲除基因構建臨床表型。Winkler等[14]研究報道，遺傳性視網膜病變的基因突變位點主要分為光傳導相關基因突變（RHO、PDE6A、PDE6B、PDE6C等基因），視循環相關基因突變（ABCA4、RPE65等基因），離子通道相關基因突變（CNGA3，CNGB3等基因），纖毛病變相關基因突變（BBS4、BBS7、RPGR等基因），光感受器發育相關基因突變（CRX、STK38L等基因），光感受器向雙極細胞發育相關基因突變（LRIT3、TRPM1等基因），結構及其他基因突變（ADAM9、SLC4A3等基因）。
筆者團隊[15]通過視網膜下注射腺相關病毒（AAV）介導的成簇的規律間隔的短回文重復序列（CRISPR）及其相關核酸酶9系統（CRISPR/Cas9）的基因編輯技術敲除CNGB3基因構建模型。CNGA3和CNGB3基因編碼視錐細胞光感受器中環鳥苷單磷酸門控陽離子通道的兩個亞基，其突變后常可導致全色盲。該研究共納入3只恒河猴，其中2只在注射后150 d處死后取樣行單細胞測序，另1只用于長期觀察。免疫組織化學染色和單細胞測序提示CRISPR/Cas9的體內靶向效率為12%～14%。ERG檢查可見中央視網膜波幅降低。此外，心臟、肝臟和腎臟中未檢測到CRISPR/Cas9的殘留。Li等[16]采用視網膜下注射AAV介導的CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除NHP視桿細胞RHO基因，建立非人靈長類視網膜色素變性模型。在AAV注射19周后，可見感光細胞層被高效轉染，并觀察到在視桿細胞發生明顯退化后，視錐細胞出現顯著退化。而在注射8個月后，感光細胞幾乎全部死亡，膠質細胞活化。OCT檢查可見獼猴視網膜外核層變薄且呈進行性退化。離體ERG檢查可見視網膜感光細胞光反應明顯受損。Ryu等[17]通過CRISPR/Cas9基因編輯技術在恒河猴胚胎中敲除MYO7A基因構建Usher綜合征1B型。恒河猴模型在出生后2、4、6、9、12個月行彩色眼底照相、OCT、眼底自發熒光以及超廣角眼底成像檢查，僅可見內層及外層視網膜的輕度薄變。其可能與未對周邊視網膜進行OCT檢查、模型尚未到NHP出現眼部表型的時間、MYO7A的基因型表型關系尚存在爭議等有關。
為使AAV介導的基因編輯技術更方便的應用于NHP模型的構建，常需進行玻璃體腔或視網膜下注射的操作。Teo等[18]研究報道，其對6只食蟹猴眼行玻璃體切割手術（PPV）制造玻璃體后脫離，之后進行黃斑區內界膜剝除手術，氣液交換治療，將AAV2-綠色熒光蛋白覆蓋黃斑區，對照組為2只行PPV后未行內界膜剝除手術的食蟹猴。16周后經熒光顯微鏡檢查可見實驗組熒光區域較對照組大，且強度更高。免疫組織化學染色實驗組可見Müller細胞層，神經節細胞層及感光細胞層熒光標記，而對照組僅在神經纖維層可見熒光標記。PPV聯合內界膜剝除手術可提高玻璃體腔注射AAV對視網膜細胞的轉染效率，更有利于模型的構建。
3 藥物誘導模型
研究表明，某些藥物聯合特定的注射部位可以造成視網膜細胞的損傷，進一步構建黃斑萎縮性疾病的動物模型。Gao等[19]通過對14只28只眼1～4歲健康食蟹猴行視網膜下注射硝普鈉構建視網膜變性模型。其中6只眼注射0.05 mM硝普鈉，14只眼注射0.1 mM硝普鈉，5只眼注射0.2 mM硝普鈉，剩余3只眼作為正常對照組。研究結果表明，0.1 mM的硝普鈉進行視網膜下注射可有效構建外核層以及RPE的缺失，且較為穩定，但硝普鈉用于構建模型的機制尚不明確。Shirai等[20]曾采用視網膜下注射40 μL濃度為0.4 mg/ml的氯化鈷構建視網膜變性模型用于干細胞移植治療，該濃度和劑量會導致視網膜內/外核層均出現損害，采用0.2 mg/ml的濃度不會導致外核層改變。而采用0.25 mg/ml及0.3 mg/ml劑量的氯化鈷注射后，可出現外核層厚度降低，直至7個月后仍未改善。Lingam等[21]研究報道，黃斑區行PPV后視網膜下注射0.3 mg/ml的氯化鈷。OCT檢查可見輕到中度的外核層缺失，注射后4個月仍可見到外層視網膜持續的損傷以及橢圓體帶的紊亂。眼底自身熒光可見注射區域呈現強自發熒光，提示視網膜下注射氯化鈷可導致光感受器及RPE的損傷。
除采用視網膜下注射硝普鈉及氯化鈷構建視網膜損傷模型，Ou等[22]采用玻璃體腔注射氧化劑碘酸鈉構建視網膜變性模型。對比靜脈注射與玻璃體腔注射的效果差異，證實經靜脈注射可造成致命性的副作用，且對視覺功能造成的損傷可自行修復，無法制造有效的模型。玻璃體腔注射高濃度（75 mg/kg）的碘酸鈉可有效構造急性、嚴重的視網膜損傷模型，聯合抗氧化劑谷胱甘肽這類可有效緩解碘酸鈉造成的急性損傷，用于亞急性視網膜變性模型的構建，但該方法對視網膜內層結構同樣造成嚴重損害。硝普鈉、氯化鈷及碘酸鈉等藥物聯合特殊部位的注射可以造成視網膜感光細胞的損傷，用于黃斑萎縮性疾病，如AMD動物模型的構建。
4 光誘導模型
4.1 激光誘導構建動物模型
采用不同的激光類型、波長、光斑直徑、能量和曝光時間等參數可造成視網膜不同位置和程度的視網膜損傷，用于構建NHP黃斑變性模型。Shirai[20]等采用577 nm的光泵浦半導體激光照射后行眼底檢查可見到視網膜局灶性的光感受器損傷，造模4 d行眼底檢查可見局灶性白色激光斑，眼底自身熒光檢查可見呈強熒光，造模2個月眼底檢查可見激光斑變淡，眼底自身熒光檢查可見弱熒光。Tu等[23]采用OPSL PASCAL激光對1只8歲的食蟹猴和1只6歲的恒河猴眼底行直徑為100 μm的光斑、16點位的照射，中間為0 μm的間隔，時間為15 ms。分別在62 d、53 d行細胞移植，證實此時已達到視網膜變性模型的標準。Liu等[24]采用532nm 晶體倍頻激光構建AMD的“地圖樣”萎縮模型，將激光照射后15分鐘、1個月、2個月、3.5個月和4.5個月。OCT檢查可見該激光照射后視網膜內層未出現損傷，但光感受器層出現變性，RPE損傷同時伴有新生血管的出現，病灶處的脈絡膜出現退行性改變。多焦ERG檢查可見相較于對照組，激光照射部位的波幅在1個月后即呈現一致性下降。Strazzeri等[25]采用局灶性激光照射獼猴視網膜構建光感受器損傷模型，共照射12點位，其中6點位距離黃斑中心凹小于7°（波長647 nm，時間0.02～0.2 s，強度為100～260 mW）。激光照射24 h后可見部分病灶熒光素滲漏，OCT檢查可見外核層高反射伴隨著黃斑周圍Henle纖維移位。蘇木精-伊紅染色可見視網膜外核層損傷。自適應光學OCT檢查可見損傷部位的神經節細胞、內層視網膜結構完整，未受到深層視網膜損傷的影響。該模型可用于輔助驗證對于外層視網膜損傷的患者通過刺激內層視網膜恢復視覺功能的可行性，并為后續視覺假體的應用提供有效的動物模型。Dhakal等[26]對8只獼猴行近紅外激光檢查，激光定位在視網膜外核層，共照射187個點位，照射視野范圍為0.79°×0.87°～1.19°×1.39°，激光能量為50 mW～210 mW。研究結果顯示，該激光模型可有效損傷視網膜外核層，對視網膜神經節細胞層及內層視網膜的血流供應無損傷。
4.2 藍光誘導構建動物模型
藍光的光毒性可誘導光感受器和RPE損傷，構建“地圖樣”萎縮模型。Rajagopalan等[27]采用470 nm藍光（300 W）分別對3例6只眼食蟹猴分別照射5、10、15、20、25、30 min。第1 d可見6只眼均呈弱熒光。2周及4周后，25 min及30 min照射組呈更明顯的弱熒光，視網膜外核層呈進行性變薄，多焦點ERG可見b波幅度降低。蘇木精-伊紅染色及免疫熒光染色提示感光細胞進行性變性，RPE細胞呈不同程度的纖維化，且伴隨著RPE細胞擴大、變圓、色素異常分布及缺失。此研究證實過量的藍光照射可以損害RPE及光感受器細胞。
4.3 光動力療法對脈絡膜的改變
Cheong等[28]通過靜脈注射及肌肉注射腎上腺素模擬中心性漿液性脈絡膜視網膜病變模型，大隱靜脈靜脈注射3mg/m2光敏劑維替泊芬。6只食蟹猴分為單純光動力療法組（1只2眼）、靜脈用腎上腺素8周組（1只2眼）、靜脈用腎上腺素8周聯合第4周光動力療法組（2只4眼）以及靜脈用腎上腺素12周聯合第8周光動力療法組（2只4眼）。OCT檢查及甲苯胺藍染色可見脈絡膜血管擴張，脈絡膜厚度增加。光動力療法可通過減少脈絡膜基質的成分降低脈絡膜厚度。但是否可通過增加光敏劑注射劑量聯合激光照射強度的方法對脈絡膜基質進行損害仍有待于后續研究。
既往研究均采用激光誘導方式構建非人靈長類脈絡膜新生血管模型[29]，且相應的模型可被用于驗證玻璃體腔注射表達抗血管內皮生長因子的AAV是否可達到治療作用的目的[30]。激光、藍光照射可誘導光感受器、RPE及脈絡膜的損害，用于構建AMD模型。而光動力療法可否用于脈絡膜損傷模型的構建仍需進一步探討。
5 機械性構建動物模型
采用機械性損傷的方式對視網膜外核層、RPE等進行破壞，同樣可用于構建黃斑損傷模型。采用機械性損傷RPE的方法構建可用于視網膜下RPE植片移植的模型。主要步驟為PPV后行視網膜下注射平衡鹽溶液，黃斑區視網膜脫離后采用視網膜剪擴大視網膜進針口，將特殊的設備延伸至視網膜下機械性破壞RPE，為后續植片的移植創造條件。必要時可在PPV前行玻璃體腔注射0.25 μg/μL組織型纖溶酶原激活物，有利于松解RPE和神經上皮的連接，便于后續構建視網膜脫離[31-32]。
Thieltges等[33]研究報道，20G管徑的器械，器械頭部與手柄部呈15°彎曲，尖端帶有3.5 mm可伸縮的環形設備用于對組織的機械性損傷。Teo等[18]探討行視網膜下注射這一操作過程對視網膜組織的損傷。注射過程中可見全層及近全層的神經視網膜脫離，黃斑撕裂以及輕至重度的黃斑囊樣水腫。如視網膜下注射200～300 μL平衡鹽溶液，眼內壓升高，在PPV后2～4周便可見視網膜外界膜連續，外核層出現薄變，黃斑區結構破壞。因此，可采用機械性損傷的方式對視網膜外核層、RPE和脈絡膜層進行破壞，以此構建黃斑區萎縮性模型。
6 小結與展望
自發性、基因編輯、藥物誘導、光誘導及機械性損傷等方式可構建眼皮膚白化病、全色盲、視網膜色素變性、AMD及罕見的眼部綜合征等NHP模型。與傳統的小鼠等實驗動物模型相比，NHP的視網膜結構與人類高度相似，且大小幾乎與人類相當，因此在構建黃斑疾病模型時，NHP具有顯著的研究優勢。然而NHP模型的使用也面臨一些限制。首先，NHP研究受到倫理嚴格的限制。其次，維護和繁殖NHP的成本相對較高，通常需要特殊的繁育設施和專業知識，這些因素都可能會增加了NHP模型的復雜性和成本。因此，在構建NHP模型時，研究人員應充分考慮這些局限性，積極結合其他動物模型的優勢，實現模型之間的互補研究。此外，應該最大程度地發揮非人靈長類動物資源的優勢，積極努力創建具有可控遺傳背景的靈長類品系，以爭取早日實現這些寶貴資源的可持續利用。