內源性色素上皮衍生因子（PEDF）因其所具有的抗血管生成作用、抗炎作用和神經保護、神經營養作用展示出作為治療糖尿病視網膜病變（DR）藥物靶點的巨大潛力。PEDF通過與細胞膜表面的受體蛋白結合，調控多種信號通路從而發揮其生物學作用。低密度脂蛋白受體相關蛋白6發揮抑制DR氧化應激反應、炎癥反應和新生血管的作用，脂肪三酰甘油脂肪酶、層粘連蛋白受體、叢狀蛋白結構域（PLXDC）1、PLXDC2和F1-腺嘌呤核苷三磷酸合酶均具有促進內皮細胞凋亡的作用，其中PLXDC1還具有神經保護作用。通過明確PEDF所作用的受體，探究受體與PEDF的親和能力、疾病過程中各受體表達水平的差異，以及PEDF與特定受體結合后所發揮的特定功能，能針對受體高親和性的活性結構域開發融合蛋白類藥物，對DR的發病機制進行更清晰的理解，以PEDF或PEDF受體為靶點，夯實DR新治療藥物與治療方法研發的理論依據。
引用本文： 徐嫚鴻, 陳欣, 李筱榮. 色素上皮衍生因子受體在糖尿病視網膜病變發生發展中的作用和機制研究進展. 中華眼底病雜志, 2023, 39(3): 265-270. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210803-00417 復制
探究抗炎、抗新生血管的藥物是目前糖尿病視網膜病變（DR）的基礎研究熱點。色素上皮衍生因子（PEDF）是內源性多功能蛋白，由絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員1編碼，具有神經保護、抗血管生成和抗炎作用[1-4]。PEDF作用于不同受體后，通過信號轉導調節wnt蛋白/胞內β-連鎖蛋白（Wnt/β-catenin）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、過氧化物酶體增生物激活受體（PPAR）和核因子κB（NF-κB）等不同的信號通路，影響發育、炎癥、代謝和血管新生等病理生理過程。針對PEDF作為抗新生血管藥物已經有了大量研究，但仍存在分子活性差、專一性差和作用機制不明確等問題。現就PEDF受體的種類、分布及其與PEDF的親和能力、疾病過程中的表達差異，以及結合PEDF后分子信號轉導途徑、發揮的功能、在DR病理機制中的作用作一綜述，以期更清晰地闡明DR的發病機制，以PEDF為靶點，為DR新的治療藥物與治療方法的研究提供理論依據。
1 低密度脂蛋白受體相關蛋白（LRP）6
1998年Brown等[5]首先報告了位于人類12號染色體（12p13.2）上的LRP6基因，其是唯一一個通過序列比較所確認的低密度脂蛋白受體家族成員[6]，與同家族的LRP5基因關系十分密切。LRP6和LRP5基因結構上具有相關性，兩者在核苷酸水平上約有71%的同源性，在人海馬體、腎小管細胞、肝細胞、腸上皮細胞、成骨細胞、破骨細胞和視網膜色素上皮（RPE）細胞中廣泛表達[7]。
LRP6和LRP5作為Wnt的共同受體，與Frizzled（Fzd）蛋白組成共受體復合物，調控經典的Wnt/β-catenin信號通路。Fzd-LRP5/6共受體復合物通過感受細胞外信號刺激，調控胞內β-catenin信號轉導，在調節細胞分化、增生、遷移、促進成骨細胞形成、維持細胞干性等方面都發揮重要作用[8-9]。
早在2011年，馬建興教授團隊率先證實了PEDF與LRP6相互結合[10]。LRP6是PEDF較為廣泛研究的受體之一，在DR發生與進展中發揮重要作用。首先，與無糖尿病的對照組相比，非增生型DR患者視網膜Fzd-LRP5/6共受體復合物激活程度明顯增高[11]；在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠模型及氧誘導視網膜病變（OIR）的視網膜新生血管模型中，視網膜Fzd-LRP5/6共受體復合物的表達水平也上調[11]。其次，Fzd-LRP5/6共受體復合物可能既參與氧化應激又被氧化應激誘導，Wnt3a條件培養基或腺病毒激活Fzd-LRP5/6共受體，可以通過上調血管內皮生長因子（VEGF）、白細胞介素（IL）-1β和腫瘤壞死因子（TNF）-α等β-catenin促進因子的表達，增加視網膜細胞培養模型中活性氧（ROS）的生成[12-13]；Wnt信號抑制劑Dickkopf相關蛋白-1與LRP6相結合可減少TNF-α和高血糖誘導的ROS生成[11]；而LRP6結合負性Wnt信號調節因子Serpin家族A成員3K能顯著降低缺氧視網膜細胞中ROS的生成，并上調錳超氧化物的表達和活性[14]。Fzd-LRP5/6共受體復合物在生理性血管生成和病理性新生血管中均發揮重要作用。在生理性血管生成中，Fzd-LRP5/6共受體復合物調節的β-catenin信號通過調控類配體4/Notch信號在調節內皮細胞增生和維持血管穩定性方面至關重要，成年LRP5基因敲除小鼠的視網膜血管稀疏且紆曲，內皮細胞異常聚集[15]。激活Fzd-LRP5/6共受體復合物可增加糖尿病動物模型視網膜中的VEGF水平，而抑制Fzd-LRP5/6共受體復合物可下調VEGF的表達，表明LRP6受體可介導糖尿病動物模型視網膜中的VEGF表達[11]。最后，LRP6所介導的Wnt信號過度激活還與視網膜細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、TNF-α和VEGF的增加有關，Wnt信號的抑制降低ICAM-1、TNF-α和VEGF的表達，提示LRP6參與DR的炎癥反應過程[16]。
Park等[10]發現，PEDF能以較高親和力與Fzd-LRP5/6共受體復合物結合，競爭性阻斷Wnt配體誘導的Wnt信號轉導。在轉基因小鼠中過度表達PEDF或給予PEDF蛋白均能減弱視網膜缺血所誘導的Wnt信號激活，而在肝纖維化和肝星狀細胞活化的研究結果表明，PEDF衍生肽（PEDF 34mer）通過抑制Wnt3a誘導的LRP6磷酸化和激活β-catenin的形成抑制Wnt信號通路的轉導，進而上調PPARγ的表達[16]。這些結果提示PEDF是LRP6的內源性拮抗劑，一方面，PEDF與Wnt共受體LRP6結合而阻斷Wnt配體與之結合。另一方面，PEDF抑制LRP6的磷酸化，從而發揮抑制Wnt信號通路激活和下游信號轉導的作用。在OIR小鼠視網膜中，Wnt信號通路被激活，其中入核的β-catenin與視網膜PEDF水平呈負相關[11]。玻璃體腔注射PEDF抑制OIR模型中Wnt通路的激活，可能通過抑制Wnt信號通路靶基因（VEGF、PPAR、基質金屬蛋白酶家族、TNF、成纖維細胞生長因子和骨形態發生蛋白家族等）的轉錄[11]，對抗DR發病過程中的氧化應激反應增加、炎癥反應水平升高和視網膜新生血管的形成，從而對DR起到治療性作用（圖1）。雖然已有文獻報道PEDF與LRP6相互結合后在缺血性視網膜病變動物模型中所發揮的作用，但進一步詳實的闡述兩者結合后的一系列分子調控機制，對DR這一類發病機制復雜的疾病病理機制研究以及抗新生血管藥物的研發，均具有重要意義。
圖1
PEDE結合LRP6而抑制Wnt信號通路并在DR中發揮的作用 DR：糖尿病視網膜病變；PEDF：色素上皮衍生因子；FZD：卷曲蛋白；LRP：低密度脂蛋白受體相關蛋白；Axin：軸蛋白；CK1α：酪蛋白激酶1α1；GSK3β：糖原合成酶激酶-3β；β-catenin：胞內β-連鎖蛋白；APC：腫瘤抑制基因；Dvl：Dishevelled蛋白；TCF：基因編碼轉錄因子；VEGF：血管內皮生長因子；Cyclin D：細胞周期蛋白D；PPAR：過氧化物酶體增生物激活受體；MMP：基質金屬蛋白酶；TNF：腫瘤壞死因子；FGF：成纖維細胞生長因子；BMP：骨形態發生蛋白
2 脂肪三酰甘油脂肪酶（ATGL）
2004年有3個獨立的研究機構同時發現了負責三酰甘油降解起始步驟的全新三酰甘油脂酶，并分別將其命名為ATGL[17]、鈣非依賴性磷脂酶A2ζ[18]和Desnutrin[19]。ATGL作為脂質分解代謝的關鍵參與者，在棕色脂肪組織和白色脂肪組織中高表達。然而，在非脂肪組織如骨骼肌、心臟、肝臟、肺和眼組織，尤其是在神經視網膜和RPE中，ATGL信使RNA也有明顯表達[20-21]。此外，研究還發現，ATGL在人Y-79細胞、小鼠光感受器細胞（661W）、大鼠光感受器前體細胞系（R28）和牛視網膜RPE細胞中也均有表達[21-24]。
ATGL是脂肪細胞中的主要脂肪酶，脂肪細胞中的ATGL根據營養狀況控制全身的脂肪酸和能量供應。ATGL缺陷的小鼠優先利用食物進行能量供應，在禁食、寒冷或運動狀態下，ATGL所介導的白色脂肪分解受限[25]。相比之下，高脂飲食能夠導致脂肪細胞特異性ATGL基因敲除的小鼠肥胖程度降低，提示ATGL缺失導致飲食誘導的肥胖抵抗[26]。脂肪酸釋放增加是肥胖相關代謝紊亂的主要原因，可能與促炎細胞因子IL-6高水平表達相關，而一方面ATGL可阻斷IL-6介導的脂肪組織脂解增加，另一方面ATGL介導脂解產生了免疫細胞募集信號[27]。
2006年研究者采用蛋白免疫印跡實驗鑒定到ARPE-19細胞和R28細胞膜上與熒光素標記的人重組PEDF相結合的蛋白具有與ATGL相似的結構，首次證明了ATGL作為PEDF的細胞膜表面受體與之相結合[21]。PEDF與ATGL的結合是介導其脂質代謝功能等生物學效應的第一步，PEDF與ATGL結合定位于干細胞的脂肪體，可能參與調節脂肪肝的發生和發展[28]。PEDF通過促進ATGL依賴的脂肪分解和減少脂肪酸氧化作用影響全身脂肪酸代謝，PEDF對胰島素的負性調控作用也依賴于與ATGL的結合[29]。PEDF增強了以胞漿ATGL蛋白為主的核轉入，使其隨后在細胞核內的蛋白酶體降解，并以E3連接酶COP1依賴的方式降低ATGL蛋白的穩定性[30]。在炎癥相關肝脂肪變性的發展過程中，內源性PEDF直接與ATGL相互作用并介導PEDF誘導的脂解，重組PEDF和PPAR-α激動劑降低TNF-α誘導肝脂肪變性[31]。此外，PEDF和PEDF衍生肽（PEDF 44mer）都能通過與ATGL結合促進心臟三酰甘油變性[32]。
關于PEDF和ATGL在眼科的作用也有廣泛的報道，PEDF可能通過與內皮細胞中的ATGL相互作用發揮抑制新生血管生成的作用，因為PEDF通過上調PPARγ的表達水平，抑制NF-κB轉錄激活，減少IL-8的生成，一方面可介導內皮細胞的凋亡，另一方面抑制內皮細胞的炎癥反應[33]。此外，也有研究表明，藥物抑制NF-κB信號通路的激活以及上調人凋亡相關因子配體（FasL）的表達能夠顯著抑制PEDF的促血管生成作用[34]。
3 層粘連蛋白受體（LR）
LR是層粘連蛋白的結合蛋白之一，相對分子質量約為67×103，是細胞外基質的非整合素細胞表面受體[35]。LR與層粘連蛋白的結合有助于核糖體的生物合成、細胞骨架組織和核功能，并且控制關鍵的細胞過程，包括介導細胞粘附、遷移、增生和存活、蛋白質合成、發育和分化[36]。對LR的研究主要集中于腫瘤領域，主要促進腫瘤細胞與基底膜的粘附，這是腫瘤侵襲轉移級聯反應的第一步。因此，與正常細胞相比，LR在腫瘤細胞中過度表達，其過度表達被認為是許多組織癌癥轉移侵襲性的分子標記，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、甲狀腺癌以及白血病和淋巴瘤[27, 36]。
最近的研究表明，在DR新生血管形成的動物模型中，PEDF 34mer和PEDF多肽336（PEDF 336）均被鑒定與LR具有較高的親和力。在脈絡膜新生血管（CNV）模型中，PEDF 34mer點眼治療可通過與LR的相互作用顯著抑制CNV形成[37]。在OIR模型中，PEDF 336可與LR高親和力結合，抑制視網膜新生血管的形成，同時VEGF的高表達水平可顯著抑制LR的表達[38]。體外酵母雙雜交篩選實驗證實LR是PEDF的細胞膜表面受體之一，研究者還確定了與LR相互作用的PEDF來源于34肽，在表面等離子體共振分析中與LR相互作用，并與內皮細胞膜結合，誘導內皮細胞凋亡，抑制內皮細胞在體外遷移和體外血管網的形成[39]。PEDF 34mer與LR結合可能通過LR-應激活化蛋白激酶（JNK）-PPARγ-FasL-半胱氨酸蛋白酶8途徑介導內皮細胞凋亡，從而發揮抗視網膜新生血管形成的作用。在凋亡細胞中，PEDF 34mer與LR結合磷酸化JNK/MAPK，隨后通過核異位激活轉錄因子PPARγ配體結合PPARγ。在細胞核中，PPARγ與維甲酸X受體以異二聚體的形式結合并招募特異性核輔激活子，以配體依賴的方式激活靶基因FasL的轉錄，這兩種方式都促進FasL基因啟動子上轉錄機制的組裝，最終誘導FasL蛋白的表達[40]。
4 叢狀蛋白結構域（PLXDC）1和PLXDC2
PLXDC1也稱為腫瘤血管內皮標志物（TEM）7，是腫瘤血管內皮標志物家族成員之一，編碼PLXDC1的基因在腫瘤血管生成過程中呈高表達[41]。Lee等[42]使用熒光探針手段鑒定到人胚胎腎細胞（293T細胞）表面巢蛋白和細胞表面全長PLXDC1相互作用，增強了轉染后細胞的擴散能力。Nanda等[43]使用親和純化策略尋找PLXDC1結合蛋白，并證實了Cortactin是一種能夠結合PLXDC1及其同源物的胞外區域的蛋白。以上研究結果表明，PLXDC1蛋白在腫瘤內皮細胞中的過度表達，為向實體瘤血管輸送治療和顯像劑提供了新的可能性。目前也有越來越多的證據支持PLXDC1作為腫瘤相關血管生成中潛在重要蛋白，如多形性膠質母細胞瘤（GBM）是以內皮細胞增生為特征的血管性腫瘤，PLXDC1是GBM-內皮細胞最特異的轉錄物之一，在GBM脈管系統中高表達，并且支持腫瘤內皮細胞分離過程的特異性[44]。2014年Cheng等[45]在293T細胞表面鑒定到PEDF分別與PLXDC1和PLXDC2相結合。PEDF與PLXDC1相互作用以促進巨噬細胞分泌IL-10，發揮對鼠視網膜神經節細胞的神經保護作用；而PEDF所介導的促內皮細胞凋亡作用則是通過與PLXDC2結合而發揮。雖然在DR或新生血管性眼底疾病中，關于PEDF和PLXDC的作用及作用機制的報道較少，但考慮到PLXDC1在腫瘤細胞中所發揮的抑制細胞擴散侵襲、促進內皮細胞分離，以及對小鼠視網膜神經節細胞的保護作用，PLXDC1很有可能是PEDF在眼底疾病發揮作用的重要受體，值得研究者進一步探究。
5 F-腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）合酶
F-ATP合酶，是一種存在于細菌質膜、線粒體內膜和葉綠體類囊體膜中的ATP合酶。F-ATP酶利用質子梯度來驅動ATP合成，通過使質子的被動通量沿著其電化學梯度穿過膜，并利用運輸反應釋放的能量從F-ATP合酶的活性位點釋放新形成的ATP[46]。F-ATP合酶由F0-ATP合酶和F1-ATP合酶兩個結構域構成，在以往的血管生成、脂蛋白代謝、先天免疫、高血壓或食物攝入調節等方面的研究中，F1-ATP合酶僅表達于細胞線粒體中，用于合成細胞所需ATP[47]。Notari等[48]首次證明PEDF結合內皮細胞表面F1-ATP合酶b亞單位并抑制內皮細胞外ATP合成活性。此外，F1-ATP合酶還可抑制細胞生長、增生、遷移能力，并可直接誘導多種細胞死亡[49]。PEDF與ATP合酶之間的相互作用可能是PEDF對新生血管產生血管抑制作用的關鍵生化步驟。
6 小結與展望
DR是一種可防不可治的眼病，目前玻璃體腔注射抗VEGF藥物是有效控制DR患者視網膜新生血管的治療方法之一，但反復多次注射仍可能無法維持最初視力獲益，以及部分患者治療無應答都使抗VEGF藥物存在局限性。PEDF因其所具有的抗新生血管、抗腫瘤生長、抗炎和神經保護作用，成為防治DR的重要靶點。PEDF的受體在眼部組織廣泛表達，具有重要的生理病理意義，對進一步研究PEDF對DR的診斷、發病機制和藥物開發等均具有重要的基礎研究和臨床應用意義（表1）。
表1
PEDF受體在DR中的作用和機制
自1989年PEDF被發現以來，內源性PEDF就因其所具有的抗血管生成作用、抗炎作用和神經保護、神經營養作用展示出作為治療DR藥物靶點的巨大潛力，而明確PEDF與PEDF受體的相互作用，具有多重意義：（1）PEDF受體（如LRP6、ATGL和LR）與DR疾病嚴重程度相關，因此可以作為DR疾病進展的預測性生物標志物，輔助疾病診斷。（2）PEDF特定生物學效應肽段的機制研究、藥物開發以及臨床轉化是目前的研究熱點，明確與PEDF受體高親和力結合并發揮作用的特定氨基酸序列，有利于開發治療作用更為明確的PEDF多肽，以最大程度地發揮其治療效果。（3）鑒于目前僅有一項一期臨床研究顯示出腺病毒攜帶PEDF治療新生血管性老年性黃斑變性的安全性和有效性[69]，因此，PEDF的藥物開發和臨床轉化仍有待眼科工作者的進一步研究。傳統意義上，藥物開發的重點是通過直接靶向受體蛋白來促進或阻止受體活化，而在全新的維度上，由于許多受體蛋白存在于受體相關聯的復合物中（如Fzd-LRP5/6共受體復合物），受體復合物的功能特征、信號途徑和定位通常與獨立存在的受體蛋白有所不同，因此也通過傳統的單獨靶向受體蛋白的方式來靶向受體復合物，進而調節相應信號通路。此外，由于受體相關蛋白的差異表達，多蛋白受體復合物常常局限于特定的組織或細胞類型，這為調節特定的受體功能提供了機會，同時使得疾病機制的調節更加精確，有可能產生更有效、副作用更少的藥物。
通過明確PEDF所作用的受體，探究受體與PEDF的親和能力、疾病過程中的表達差異，以及PEDF與特定受體結合后所發揮的特定功能，能針對受體高親和性的活性結構域開發融合蛋白類藥物，對DR的發病機制進行更清晰的理解，以PEDF或PEDF受體為靶點，夯實DR新治療藥物與治療方法研發的理論依據。
探究抗炎、抗新生血管的藥物是目前糖尿病視網膜病變（DR）的基礎研究熱點。色素上皮衍生因子（PEDF）是內源性多功能蛋白，由絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員1編碼，具有神經保護、抗血管生成和抗炎作用[1-4]。PEDF作用于不同受體后，通過信號轉導調節wnt蛋白/胞內β-連鎖蛋白（Wnt/β-catenin）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、過氧化物酶體增生物激活受體（PPAR）和核因子κB（NF-κB）等不同的信號通路，影響發育、炎癥、代謝和血管新生等病理生理過程。針對PEDF作為抗新生血管藥物已經有了大量研究，但仍存在分子活性差、專一性差和作用機制不明確等問題。現就PEDF受體的種類、分布及其與PEDF的親和能力、疾病過程中的表達差異，以及結合PEDF后分子信號轉導途徑、發揮的功能、在DR病理機制中的作用作一綜述，以期更清晰地闡明DR的發病機制，以PEDF為靶點，為DR新的治療藥物與治療方法的研究提供理論依據。
1 低密度脂蛋白受體相關蛋白（LRP）6
1998年Brown等[5]首先報告了位于人類12號染色體（12p13.2）上的LRP6基因，其是唯一一個通過序列比較所確認的低密度脂蛋白受體家族成員[6]，與同家族的LRP5基因關系十分密切。LRP6和LRP5基因結構上具有相關性，兩者在核苷酸水平上約有71%的同源性，在人海馬體、腎小管細胞、肝細胞、腸上皮細胞、成骨細胞、破骨細胞和視網膜色素上皮（RPE）細胞中廣泛表達[7]。
LRP6和LRP5作為Wnt的共同受體，與Frizzled（Fzd）蛋白組成共受體復合物，調控經典的Wnt/β-catenin信號通路。Fzd-LRP5/6共受體復合物通過感受細胞外信號刺激，調控胞內β-catenin信號轉導，在調節細胞分化、增生、遷移、促進成骨細胞形成、維持細胞干性等方面都發揮重要作用[8-9]。
早在2011年，馬建興教授團隊率先證實了PEDF與LRP6相互結合[10]。LRP6是PEDF較為廣泛研究的受體之一，在DR發生與進展中發揮重要作用。首先，與無糖尿病的對照組相比，非增生型DR患者視網膜Fzd-LRP5/6共受體復合物激活程度明顯增高[11]；在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠模型及氧誘導視網膜病變（OIR）的視網膜新生血管模型中，視網膜Fzd-LRP5/6共受體復合物的表達水平也上調[11]。其次，Fzd-LRP5/6共受體復合物可能既參與氧化應激又被氧化應激誘導，Wnt3a條件培養基或腺病毒激活Fzd-LRP5/6共受體，可以通過上調血管內皮生長因子（VEGF）、白細胞介素（IL）-1β和腫瘤壞死因子（TNF）-α等β-catenin促進因子的表達，增加視網膜細胞培養模型中活性氧（ROS）的生成[12-13]；Wnt信號抑制劑Dickkopf相關蛋白-1與LRP6相結合可減少TNF-α和高血糖誘導的ROS生成[11]；而LRP6結合負性Wnt信號調節因子Serpin家族A成員3K能顯著降低缺氧視網膜細胞中ROS的生成，并上調錳超氧化物的表達和活性[14]。Fzd-LRP5/6共受體復合物在生理性血管生成和病理性新生血管中均發揮重要作用。在生理性血管生成中，Fzd-LRP5/6共受體復合物調節的β-catenin信號通過調控類配體4/Notch信號在調節內皮細胞增生和維持血管穩定性方面至關重要，成年LRP5基因敲除小鼠的視網膜血管稀疏且紆曲，內皮細胞異常聚集[15]。激活Fzd-LRP5/6共受體復合物可增加糖尿病動物模型視網膜中的VEGF水平，而抑制Fzd-LRP5/6共受體復合物可下調VEGF的表達，表明LRP6受體可介導糖尿病動物模型視網膜中的VEGF表達[11]。最后，LRP6所介導的Wnt信號過度激活還與視網膜細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、TNF-α和VEGF的增加有關，Wnt信號的抑制降低ICAM-1、TNF-α和VEGF的表達，提示LRP6參與DR的炎癥反應過程[16]。
Park等[10]發現，PEDF能以較高親和力與Fzd-LRP5/6共受體復合物結合，競爭性阻斷Wnt配體誘導的Wnt信號轉導。在轉基因小鼠中過度表達PEDF或給予PEDF蛋白均能減弱視網膜缺血所誘導的Wnt信號激活，而在肝纖維化和肝星狀細胞活化的研究結果表明，PEDF衍生肽（PEDF 34mer）通過抑制Wnt3a誘導的LRP6磷酸化和激活β-catenin的形成抑制Wnt信號通路的轉導，進而上調PPARγ的表達[16]。這些結果提示PEDF是LRP6的內源性拮抗劑，一方面，PEDF與Wnt共受體LRP6結合而阻斷Wnt配體與之結合。另一方面，PEDF抑制LRP6的磷酸化，從而發揮抑制Wnt信號通路激活和下游信號轉導的作用。在OIR小鼠視網膜中，Wnt信號通路被激活，其中入核的β-catenin與視網膜PEDF水平呈負相關[11]。玻璃體腔注射PEDF抑制OIR模型中Wnt通路的激活，可能通過抑制Wnt信號通路靶基因（VEGF、PPAR、基質金屬蛋白酶家族、TNF、成纖維細胞生長因子和骨形態發生蛋白家族等）的轉錄[11]，對抗DR發病過程中的氧化應激反應增加、炎癥反應水平升高和視網膜新生血管的形成，從而對DR起到治療性作用（圖1）。雖然已有文獻報道PEDF與LRP6相互結合后在缺血性視網膜病變動物模型中所發揮的作用，但進一步詳實的闡述兩者結合后的一系列分子調控機制，對DR這一類發病機制復雜的疾病病理機制研究以及抗新生血管藥物的研發，均具有重要意義。
圖1
PEDE結合LRP6而抑制Wnt信號通路并在DR中發揮的作用 DR：糖尿病視網膜病變；PEDF：色素上皮衍生因子；FZD：卷曲蛋白；LRP：低密度脂蛋白受體相關蛋白；Axin：軸蛋白；CK1α：酪蛋白激酶1α1；GSK3β：糖原合成酶激酶-3β；β-catenin：胞內β-連鎖蛋白；APC：腫瘤抑制基因；Dvl：Dishevelled蛋白；TCF：基因編碼轉錄因子；VEGF：血管內皮生長因子；Cyclin D：細胞周期蛋白D；PPAR：過氧化物酶體增生物激活受體；MMP：基質金屬蛋白酶；TNF：腫瘤壞死因子；FGF：成纖維細胞生長因子；BMP：骨形態發生蛋白
2 脂肪三酰甘油脂肪酶（ATGL）
2004年有3個獨立的研究機構同時發現了負責三酰甘油降解起始步驟的全新三酰甘油脂酶，并分別將其命名為ATGL[17]、鈣非依賴性磷脂酶A2ζ[18]和Desnutrin[19]。ATGL作為脂質分解代謝的關鍵參與者，在棕色脂肪組織和白色脂肪組織中高表達。然而，在非脂肪組織如骨骼肌、心臟、肝臟、肺和眼組織，尤其是在神經視網膜和RPE中，ATGL信使RNA也有明顯表達[20-21]。此外，研究還發現，ATGL在人Y-79細胞、小鼠光感受器細胞（661W）、大鼠光感受器前體細胞系（R28）和牛視網膜RPE細胞中也均有表達[21-24]。
ATGL是脂肪細胞中的主要脂肪酶，脂肪細胞中的ATGL根據營養狀況控制全身的脂肪酸和能量供應。ATGL缺陷的小鼠優先利用食物進行能量供應，在禁食、寒冷或運動狀態下，ATGL所介導的白色脂肪分解受限[25]。相比之下，高脂飲食能夠導致脂肪細胞特異性ATGL基因敲除的小鼠肥胖程度降低，提示ATGL缺失導致飲食誘導的肥胖抵抗[26]。脂肪酸釋放增加是肥胖相關代謝紊亂的主要原因，可能與促炎細胞因子IL-6高水平表達相關，而一方面ATGL可阻斷IL-6介導的脂肪組織脂解增加，另一方面ATGL介導脂解產生了免疫細胞募集信號[27]。
2006年研究者采用蛋白免疫印跡實驗鑒定到ARPE-19細胞和R28細胞膜上與熒光素標記的人重組PEDF相結合的蛋白具有與ATGL相似的結構，首次證明了ATGL作為PEDF的細胞膜表面受體與之相結合[21]。PEDF與ATGL的結合是介導其脂質代謝功能等生物學效應的第一步，PEDF與ATGL結合定位于干細胞的脂肪體，可能參與調節脂肪肝的發生和發展[28]。PEDF通過促進ATGL依賴的脂肪分解和減少脂肪酸氧化作用影響全身脂肪酸代謝，PEDF對胰島素的負性調控作用也依賴于與ATGL的結合[29]。PEDF增強了以胞漿ATGL蛋白為主的核轉入，使其隨后在細胞核內的蛋白酶體降解，并以E3連接酶COP1依賴的方式降低ATGL蛋白的穩定性[30]。在炎癥相關肝脂肪變性的發展過程中，內源性PEDF直接與ATGL相互作用并介導PEDF誘導的脂解，重組PEDF和PPAR-α激動劑降低TNF-α誘導肝脂肪變性[31]。此外，PEDF和PEDF衍生肽（PEDF 44mer）都能通過與ATGL結合促進心臟三酰甘油變性[32]。
關于PEDF和ATGL在眼科的作用也有廣泛的報道，PEDF可能通過與內皮細胞中的ATGL相互作用發揮抑制新生血管生成的作用，因為PEDF通過上調PPARγ的表達水平，抑制NF-κB轉錄激活，減少IL-8的生成，一方面可介導內皮細胞的凋亡，另一方面抑制內皮細胞的炎癥反應[33]。此外，也有研究表明，藥物抑制NF-κB信號通路的激活以及上調人凋亡相關因子配體（FasL）的表達能夠顯著抑制PEDF的促血管生成作用[34]。
3 層粘連蛋白受體（LR）
LR是層粘連蛋白的結合蛋白之一，相對分子質量約為67×103，是細胞外基質的非整合素細胞表面受體[35]。LR與層粘連蛋白的結合有助于核糖體的生物合成、細胞骨架組織和核功能，并且控制關鍵的細胞過程，包括介導細胞粘附、遷移、增生和存活、蛋白質合成、發育和分化[36]。對LR的研究主要集中于腫瘤領域，主要促進腫瘤細胞與基底膜的粘附，這是腫瘤侵襲轉移級聯反應的第一步。因此，與正常細胞相比，LR在腫瘤細胞中過度表達，其過度表達被認為是許多組織癌癥轉移侵襲性的分子標記，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、甲狀腺癌以及白血病和淋巴瘤[27, 36]。
最近的研究表明，在DR新生血管形成的動物模型中，PEDF 34mer和PEDF多肽336（PEDF 336）均被鑒定與LR具有較高的親和力。在脈絡膜新生血管（CNV）模型中，PEDF 34mer點眼治療可通過與LR的相互作用顯著抑制CNV形成[37]。在OIR模型中，PEDF 336可與LR高親和力結合，抑制視網膜新生血管的形成，同時VEGF的高表達水平可顯著抑制LR的表達[38]。體外酵母雙雜交篩選實驗證實LR是PEDF的細胞膜表面受體之一，研究者還確定了與LR相互作用的PEDF來源于34肽，在表面等離子體共振分析中與LR相互作用，并與內皮細胞膜結合，誘導內皮細胞凋亡，抑制內皮細胞在體外遷移和體外血管網的形成[39]。PEDF 34mer與LR結合可能通過LR-應激活化蛋白激酶（JNK）-PPARγ-FasL-半胱氨酸蛋白酶8途徑介導內皮細胞凋亡，從而發揮抗視網膜新生血管形成的作用。在凋亡細胞中，PEDF 34mer與LR結合磷酸化JNK/MAPK，隨后通過核異位激活轉錄因子PPARγ配體結合PPARγ。在細胞核中，PPARγ與維甲酸X受體以異二聚體的形式結合并招募特異性核輔激活子，以配體依賴的方式激活靶基因FasL的轉錄，這兩種方式都促進FasL基因啟動子上轉錄機制的組裝，最終誘導FasL蛋白的表達[40]。
4 叢狀蛋白結構域（PLXDC）1和PLXDC2
PLXDC1也稱為腫瘤血管內皮標志物（TEM）7，是腫瘤血管內皮標志物家族成員之一，編碼PLXDC1的基因在腫瘤血管生成過程中呈高表達[41]。Lee等[42]使用熒光探針手段鑒定到人胚胎腎細胞（293T細胞）表面巢蛋白和細胞表面全長PLXDC1相互作用，增強了轉染后細胞的擴散能力。Nanda等[43]使用親和純化策略尋找PLXDC1結合蛋白，并證實了Cortactin是一種能夠結合PLXDC1及其同源物的胞外區域的蛋白。以上研究結果表明，PLXDC1蛋白在腫瘤內皮細胞中的過度表達，為向實體瘤血管輸送治療和顯像劑提供了新的可能性。目前也有越來越多的證據支持PLXDC1作為腫瘤相關血管生成中潛在重要蛋白，如多形性膠質母細胞瘤（GBM）是以內皮細胞增生為特征的血管性腫瘤，PLXDC1是GBM-內皮細胞最特異的轉錄物之一，在GBM脈管系統中高表達，并且支持腫瘤內皮細胞分離過程的特異性[44]。2014年Cheng等[45]在293T細胞表面鑒定到PEDF分別與PLXDC1和PLXDC2相結合。PEDF與PLXDC1相互作用以促進巨噬細胞分泌IL-10，發揮對鼠視網膜神經節細胞的神經保護作用；而PEDF所介導的促內皮細胞凋亡作用則是通過與PLXDC2結合而發揮。雖然在DR或新生血管性眼底疾病中，關于PEDF和PLXDC的作用及作用機制的報道較少，但考慮到PLXDC1在腫瘤細胞中所發揮的抑制細胞擴散侵襲、促進內皮細胞分離，以及對小鼠視網膜神經節細胞的保護作用，PLXDC1很有可能是PEDF在眼底疾病發揮作用的重要受體，值得研究者進一步探究。
5 F-腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）合酶
F-ATP合酶，是一種存在于細菌質膜、線粒體內膜和葉綠體類囊體膜中的ATP合酶。F-ATP酶利用質子梯度來驅動ATP合成，通過使質子的被動通量沿著其電化學梯度穿過膜，并利用運輸反應釋放的能量從F-ATP合酶的活性位點釋放新形成的ATP[46]。F-ATP合酶由F0-ATP合酶和F1-ATP合酶兩個結構域構成，在以往的血管生成、脂蛋白代謝、先天免疫、高血壓或食物攝入調節等方面的研究中，F1-ATP合酶僅表達于細胞線粒體中，用于合成細胞所需ATP[47]。Notari等[48]首次證明PEDF結合內皮細胞表面F1-ATP合酶b亞單位并抑制內皮細胞外ATP合成活性。此外，F1-ATP合酶還可抑制細胞生長、增生、遷移能力，并可直接誘導多種細胞死亡[49]。PEDF與ATP合酶之間的相互作用可能是PEDF對新生血管產生血管抑制作用的關鍵生化步驟。
6 小結與展望
DR是一種可防不可治的眼病，目前玻璃體腔注射抗VEGF藥物是有效控制DR患者視網膜新生血管的治療方法之一，但反復多次注射仍可能無法維持最初視力獲益，以及部分患者治療無應答都使抗VEGF藥物存在局限性。PEDF因其所具有的抗新生血管、抗腫瘤生長、抗炎和神經保護作用，成為防治DR的重要靶點。PEDF的受體在眼部組織廣泛表達，具有重要的生理病理意義，對進一步研究PEDF對DR的診斷、發病機制和藥物開發等均具有重要的基礎研究和臨床應用意義（表1）。
表1
PEDF受體在DR中的作用和機制
自1989年PEDF被發現以來，內源性PEDF就因其所具有的抗血管生成作用、抗炎作用和神經保護、神經營養作用展示出作為治療DR藥物靶點的巨大潛力，而明確PEDF與PEDF受體的相互作用，具有多重意義：（1）PEDF受體（如LRP6、ATGL和LR）與DR疾病嚴重程度相關，因此可以作為DR疾病進展的預測性生物標志物，輔助疾病診斷。（2）PEDF特定生物學效應肽段的機制研究、藥物開發以及臨床轉化是目前的研究熱點，明確與PEDF受體高親和力結合并發揮作用的特定氨基酸序列，有利于開發治療作用更為明確的PEDF多肽，以最大程度地發揮其治療效果。（3）鑒于目前僅有一項一期臨床研究顯示出腺病毒攜帶PEDF治療新生血管性老年性黃斑變性的安全性和有效性[69]，因此，PEDF的藥物開發和臨床轉化仍有待眼科工作者的進一步研究。傳統意義上，藥物開發的重點是通過直接靶向受體蛋白來促進或阻止受體活化，而在全新的維度上，由于許多受體蛋白存在于受體相關聯的復合物中（如Fzd-LRP5/6共受體復合物），受體復合物的功能特征、信號途徑和定位通常與獨立存在的受體蛋白有所不同，因此也通過傳統的單獨靶向受體蛋白的方式來靶向受體復合物，進而調節相應信號通路。此外，由于受體相關蛋白的差異表達，多蛋白受體復合物常常局限于特定的組織或細胞類型，這為調節特定的受體功能提供了機會，同時使得疾病機制的調節更加精確，有可能產生更有效、副作用更少的藥物。
通過明確PEDF所作用的受體，探究受體與PEDF的親和能力、疾病過程中的表達差異，以及PEDF與特定受體結合后所發揮的特定功能，能針對受體高親和性的活性結構域開發融合蛋白類藥物，對DR的發病機制進行更清晰的理解，以PEDF或PEDF受體為靶點，夯實DR新治療藥物與治療方法研發的理論依據。
