糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病最常見和嚴重的并發癥之一，是成年人視力喪失的主要原因。生物鐘基因能產生晝夜節律并控制其運轉，若表達異常將導致多種疾病發生。越來越多的證據表明，生物鐘基因在DR發病機制及發生發展中發揮重要作用。一方面，晝夜紊亂相關行為干擾了生物鐘基因的晝夜振蕩，其表達水平的改變易致糖代謝調控失衡，最終增加2型糖尿病及DR發病風險。另一方面，DR患者表現出晝夜節律紊亂特點，生物鐘基因可能通過影響一系列視網膜病理生理過程，調控DR發生發展。因此，維持正常的晝夜節律可作為疾病預防策略，研究生物鐘基因在DR中的分子機制可為更加全面地闡述DR發病機制、尋找治療新靶點提供新思路。
引用本文： 周琦, 陸方, 葉河江. 生物鐘基因在糖尿病視網膜病變發病機制中的作用機制研究進展. 中華眼底病雜志, 2023, 39(1): 78-82. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210710-00371 復制
糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病（DM）最常見和最嚴重的并發癥之一，其發病機制尚未完全闡明。最近有研究指出，維持晝夜節律的生物鐘基因在多水平上參與DR的調控[1]。一方面，晝夜紊亂相關行為干擾了生物鐘基因的晝夜振蕩，其表達水平的改變易致糖代謝調控失衡，最終增加2型DM（T2DM）及DR發病風險[2]。另一方面，DR患者表現出晝夜節律紊亂特點，生物鐘基因可能通過影響一系列視網膜病理生理過程，調控DR發生和發展。現就生物鐘基因在DR發病機制中的作用作一綜述，以期為進一步理解和研究DR發病機制提供理論基礎。
1 生物鐘概述
機體的生理、代謝和行為活動等均遵從一定的晝夜節律變化，而這種節律變化由生物鐘系統所調控[3]。哺乳動物生物鐘系統由下丘腦視交叉上核（SCN）的中央生物鐘以及外周組織的外周生物鐘組成[2]。SCN中央生物鐘接收來自視網膜的光信號后，調節機體內部節律，使其與外環境的24 h節律同步，并通過神經和體液信號整合所有的外周生物鐘，以保證不同組織外周生物鐘之間的同步性。
生物鐘基因是能產生晝夜節律并控制其運轉的基因，是生物鐘的分子基礎。核心生物鐘基因包括：時鐘晝夜調節器（Clock）、腦和肌肉組織芳香烴受體核轉運蛋白的類似蛋白1（Bmal1）、周期蛋白家族（Per，包括Per1、Per2、Per3）、隱花色素家族（Cry，包括Cry1和Cry2）。生物鐘基因及其編碼的蛋白質通過轉錄-翻譯反饋環路來實現對24 h晝夜節律的調控作用。首先，胞質中Clock和Bmal1形成異源二聚體，二聚體結合Per和Cry基因的上游啟動子上的E‐box，激活轉錄從而增加Per及Cry水平，當兩者在胞質中達到一定水平則可形成二聚體進入細胞核，反饋性饋抑制Clock-Bmal1的轉錄活性。其次，視黃酸受體相關的孤兒受體α（RORα）和孤核受體（Nr1d1/REV-ERBα）基因轉錄可被Clock-Bmal1異二聚體激活，二者都可與Bmal1啟動子結合，進而促進或阻遏Bmal1基因的轉錄[4]。因此，生物鐘基因之間形成的反饋環路，共同調節晝夜節律的穩定，生物鐘基因調控紊亂可使機體內環境失調，進而導致疾病發生。
2 生物鐘基因與糖代謝紊亂
近年研究發現，血糖代謝存在明顯晝夜節律，其節律受到生物鐘基因調控。現代社會中熬夜、輪班工作以及電子產品的廣泛使用，使人類作息時間不再遵循原本的生物鐘，并易導致糖代謝紊亂。流行病學證據顯示輪班工作人群T2DM患病率明顯升高[5]，夜班輪班工作時間每增加5年，T2DM患病率即升高31%[6]。動物研究亦證實，發現連續10周予以小鼠夜間光照，將破壞小鼠胰島生物鐘基因振蕩幅度及相位，最終導致胰島素分泌減少及DM發生[7]。由此可見，生活方式的改變破壞了晝夜節律及生物鐘基因的表達，進而通過影響胰島素分泌及胰島素敏感性干預糖代謝過程。其中，不規律的生活方式是啟動因素，生物鐘基因多態性和表達的改變是關鍵，其介導下T2DM及DR患病風險的增加也同樣預示著兩者存在進一步研究的價值[8-9]。
中央及外周生物鐘基因均參與調控糖代謝過程。其中，SCN γ-氨基丁酸能神經元中的REV-ERB基因能控制胰島素抑制肝臟糖異生的晝夜節律，REV-ERB基因敲除小鼠出現空腹糖耐量異常[10]。另外，人、小鼠和大鼠的胰腺及胰島細胞中Clock、Bmal1、Per1、Per2、Cry1、Cry2、REV-ERBα等生物鐘基因均呈晝夜振蕩表達，并調控胰島α和β細胞分泌的胰高血糖素和胰島素水平的24 h晝夜變化[11]。Clock是核心生物鐘基因之一，Corella等[12]對7 098名參與者進行研究，結果發現Clock基因多態性位點rs4580704與T2DM發病風險有關。Bmal1具有調節胰島素分泌節律的功能，Marcheva等[13]研究發現，敲除小鼠胰腺Bmal1基因后，小鼠出現高血糖、低胰島素血癥和葡萄糖耐受不良。Rev-ERBα參與調節胰島β細胞分泌胰島素功能，使用siRNA下調小鼠胰島β細胞Rev-ERBα表達后，小鼠出現葡萄糖依賴的胰島素分泌受損[14]。此外，Cry與胰島素敏感性密切相關，在Cry1/2-/-小鼠模型中，肝臟胰島素抵抗及脂肪胰島素敏感性增加，從而引起脂肪的大量攝入，最終導致肥胖和DM發生。后續的研究發現，T2DM小鼠（db/db小鼠）過表達Cry1可使胰島素敏感性升高，并且降低血糖水平[15]。生物鐘基因已成為糖代謝調控新靶點，中藥參芪復方通過上調DM大鼠生物鐘基因CRY1和白蛋白位點D結合蛋白的表達，增加胰島素分泌及胰島素敏感性，維持葡萄糖穩態[16]。胰島素增敏劑羅格列酮可通過抑制肝臟Bmal1的活性，恢復胰島素敏感性[17]。胰高血糖素樣肽-1受體激動劑利拉魯肽能通過激活磷酸腺苷依賴性蛋白激酶（AMPK）信號通路，恢復胰島β細胞內在生物鐘節律從而改善胰島β細胞功能，最終延緩DM進展[18]。
3 生物鐘基因與DR
生物鐘基因存在于多種視網膜細胞上，并通過神經突觸、間隙連接和釋放的神經遞質整合，集成形成內源性晝夜節律起搏器，從而廣泛調節視網膜的生理功能的晝夜變化，包括多巴胺合成、褪黑素（MLT）釋放、細胞外pH值、光感受器細胞桿盤脫落、視網膜電圖（ERG）b波振幅等[4,19]。若生物鐘基因表達發生異常，則將破壞視網膜生理功能的正常節律。如敲除小鼠視網膜Bmal1基因后會出現暗視及明視ERG反應b波晝夜節律消失、振幅下降[20]。晝夜節律紊亂是DR的重要臨床特征。DR患者易出現睡眠障礙、晝夜血壓均升高等全身晝夜節律紊亂表現[21-23]，同時視網膜結構及功能也表現出相應的節律紊亂，如視網膜厚度晝夜變化增加及ERG固有晝夜節律隨DR病情加重而逐漸下降[24-25]。在DM動物模型中，視網膜部分生物鐘基因表達異常，但SCN中央生物鐘基因并沒有出現相應改變，這也提示DM視網膜生物鐘基因失調可能加劇DR進展[26-28]。近年來，生物鐘基因通過影響視網膜脂代謝、Müller細胞功能及血管內皮祖細胞（EPC）的數量和功能等機制，調控DR發生發展受到重視。
3.1 生物鐘基因與視網膜脂代謝紊亂
近年來脂代謝紊亂在DR中的作用受到關注。一項隊列研究顯示，脂代謝紊亂可能會損傷DM患者視網膜微循環，進而加重DR病情[29]。一方面，循環中低密度脂蛋白水平升高是DR患者視網膜硬性滲出增加及黃斑水腫加重的直接原因[30]。另一更重要的原因在于，視網膜脂代謝過程中的脂肪酸氧化是視網膜能量的重要來源，而此過程正常運行的必要條件是視網膜脂代謝相關基因的晝夜節律性表達。而高糖將影響視網膜生物鐘基因及脂代謝基因的節律性表達，并進一步導致視網膜脂代謝異常及DR微循環障礙[31]。
參與脂質代謝的基因固醇調節元件結合蛋白-1c（srebp1c）、過氧化物酶體增生物激活受體（PPAR）中的PPARα和PPARγ、脂肪酸延長酶（Elovls）中Elovl2和Elovl4在視網膜的表達均具有晝夜節律性。其中，srebp1c在脂質代謝基因轉錄中起核心調控作用[32]。PPARα是控制細胞代謝的關鍵基因，它能直接與Bmal1啟動子相結合[33]，PPARγ則可以調節Bmal1轉錄水平[34]。Elovl2和Elovl4在視網膜中的節律性表達，可以通過影響長鏈不飽和脂肪酸DHA22:6n3的合成，進而激活人視網膜血管內皮細胞中核因子κB和粘附分子的表達，并發揮抗炎作用[35]。
在DR與視網膜脂代謝的研究中，Tikhonenko等[36]首先發現DR大鼠視網膜Elovl2和Elovl4表達降低，其節律性振蕩的缺失進一步誘發視網膜慢性炎癥的發生，促進DR發生進程。然而，負責調控Elovl2和Elovl4表達下降的機制尚不明確。因此，其團隊經深入研究證實，高血糖致大鼠視網膜血管內皮細胞中的核心生物鐘基因（Clock、Bmal1、Cry1、Cry2）表達上調，脂代謝基因srebp1c mRNA表達升高以及PPARα、PPARγ、Elovl2、Elovl4 mRNA表達降低。該研究最終得出結論，DM對視網膜核心生物鐘基因與脂代謝相關基因的晝夜表達的影響，導致視網膜脂代謝失衡，并最終加重DR大鼠視網膜炎癥和微血管損傷[27]。然而，視網膜生物鐘基因與脂代謝基因的內在調控關系并未完全闡明，且尚需進一步的研究。
3.2 生物鐘基因與Müller細胞功能障礙
DR以視網膜神經變性及微循環障礙為特征。Müller細胞貫穿視網膜各層，連接神經元與血視網膜屏障，在高糖環境下通過分泌血管新生因子和炎性因子、下調內向整流性鉀通道4.1（Kir4.1）、減少神經營養物質分泌等途徑促進DR進展[37]。哺乳動物Müller細胞表達完整生物鐘基因并產生晝夜節律，Xu等[38]分離小鼠和人視網膜Müller細胞并進行體外培養，發現核心生物鐘基因（Clock、Bmal1、Per1、Per2、Cry1和Cry2）在兩者的細胞中均呈節律性表達。進一步基因敲除實驗表明，Per1或Bmal1是維持小鼠Müller細胞節律性所必須，而人Müller細胞對Per1的依賴性則降低[38]。生物鐘基因可能通過影響Müller細胞分泌血管新生因子、Kir4.1的表達來誘導DR發病。
Müller細胞產生的血管內皮生長因子（VEGF）通過增加血管滲漏和促進新生血管形成參與DR關鍵病理過程。Xu等[39]敲除體外低氧Müller細胞及體內氧誘導視網膜病變（OIR）小鼠模型中生物鐘基因Per1、Per2后，出現低氧Müller細胞中VEGF水平升高，及OIR小鼠視網膜新生血管增加。所以該研究認為Per1、Per2對新生血管形成具有抑制作用，并可能成為干預血管新生的新靶點。Xu等[40-41]進一步研究發現，敲除低氧Müller細胞中Per1、Per2基因后，還會出現Bmal1表達顯著增加及低氧誘導因子（HIF-1α）水平顯著降低，故生物鐘基因Per1、Per2、Bmal1以及血管新生因子HIF-1α和VEGF可能是血管新生及增生性視網膜病變過程中的關鍵調節因子。此外，另有研究表明晝夜節律系統的負性轉錄因子-胚胎軟骨差異表達基因（Dec2）也可調節缺氧環境下Müller細胞中VEGF的表達。Kusunose等[42]發現，在缺氧誘導人視網膜Müller細胞中，Dec2基因和VEGF水平顯著增加，敲除Dec2基因可通過抑制HIF-1α，從而進一步降低VEGF表達。目前抗VEGF藥物是中晚期DR的主要治療方式，研究生物鐘基因可能有助于探索從HIF-1α和VEGF上游進行干預從而有效抑制新生血管形成的治療新方法。
Müller細胞上Kir4.1的表達具有晝夜節律性并受到生物鐘基因調控。Kir4.1是表達在視網膜Müller細胞上的一種特殊的通道蛋白，對維持視網膜內鉀離子濃度和視網膜各層的“干燥”狀態起關鍵作用。Kir4.1通道具有晝夜節律變化，鏈脲佐菌素誘導的OIR大鼠視網膜炎性因子腫瘤壞死因子表達增加，可破壞Müller細胞Kir4.1通道的晝夜節律及表達，從而導致Müller細胞功能障礙[43]。生物鐘基因Bmal1是調控Kir4.1通道節律性的關鍵，其在DR過程中可介導相關因子對Kir4.1通道的作用[44]。如胰島素信號傳導的重要調節劑胰島素受體底物1（IRS-1），其在Müller細胞中與Kir4.1保持節律同步。T2DM小鼠（db/db小鼠）視網膜IRS-1降低后，可通過抑制Bmal1并下調Kir4.1的表達，最終導致Müller細胞凋亡[45]。因此，生物鐘基因在維持DR Müller細胞Kir4.1正常功能過程中起關鍵作用，并已成為改善Müller細胞功能障礙的潛在靶點。Alex等[46]使用二甲雙胍干預T2DM小鼠（db/db小鼠）后發現，其可通過激活Bmal1-AMPK糾正晝夜節律紊亂，恢復Kir4.1的正常表達，進而改善Müller細胞功能障礙。
3.3 生物鐘基因與EPC數量及功能障礙
當DR出現血管損傷時，成熟的視網膜血管內皮細胞增生和修復能力有限，因此需要骨髓來源的EPC募集到視網膜并完成血管修復功能[47]。動物及人體研究均證實循環EPC數量減少及功能障礙與DR進程相關[48-49]。EPC釋放存在晝夜節律性且受生物鐘基因影響。Thomas等[50]發現，健康人EPC數量顯示出晝夜變化，EPC數量在上午8點至下午3點之間出現下降，在晚上10點顯著增加。相關研究發現，與健康大鼠相比，T2DM大鼠骨髓、外周血及視網膜生物鐘基因（Clock、Bmal1、Per-1、Per-2、Cry1、Cry2、REV-ERBα和RORα）表達均顯著減少，而SCN中央生物鐘改變并不明顯。這種外周生物鐘基因表達廣泛降低引起晝夜振蕩的減弱促使骨髓EPC釋放晝夜節律喪失，循環中EPC的數量也隨之減少，進而出現視網膜無細胞毛細血管的增生，導致視網膜血管功能障礙并加快DR進展[26]。因此，DM導致的外周生物鐘的廣泛抑制是DR血管病變的重要原因。此外，研究發現Per2基因突變小鼠出現了與DR大鼠相似的缺陷，即EPC水平降低及視網膜血管功能障礙。此結果進一步證明了生物鐘基因異常與DR血管病變之間的密切聯系[51-52]。目前臨床上有報道使用粒細胞集落刺激因子和促紅細胞生成素來增加EPC數量及功能，但這兩種藥物價格昂貴且作用有限，因此干預外周生物鐘基因可能是改善DR血管功能障礙的新方法。
4 生物鐘基因與DR的治療
調控晝夜節律和生物鐘基因已成為DR治療新方向。首先，改變不健康的生活及飲食方式，如制定科學的輪班模式、合理安排休息時間、定期體育鍛煉有利于使機體更大程度地適應晝夜節律變化[53]。其次，外源性藥物MLT及MLT受體激動劑如雷美替胺、阿戈美拉汀等已廣泛應用于改善睡眠及調整晝夜節律的治療中[54]。一項正在進行的隨機對照雙盲臨床試驗予以DR患者連續21 d睡前口服MLT，將ERG振蕩電位、瞳孔反應、唾液MLT水平和睡眠情況、視網膜結構作為結局指標，試驗結果將評估MLT對DR患者晝夜節律及視功能的影響[1]。再者，學者在降糖藥物與生物鐘基因內在關系的研究中發現，無論是西藥羅格列酮以及利拉魯肽，或者是中藥參芪復方，其降糖作用機制均與生物鐘基因的調控密切相關。基于生物鐘基因在DR病理生理過程中的關鍵作用，探索新的治療靶點及藥物值得期待。但需注意的是，生物鐘是多基因參與的反饋調節系統，各基因之間的復雜聯系尚未得到完全證實，若僅使用藥物或者基因敲除等手段改變某種生物鐘基因的表達水平，可能受到其他基因的干擾，甚至造成整個生物鐘系統的紊亂。因此，生物鐘基因在DR治療中的研究尚需進一步深入。
5 小結與展望
異常生活方式導致的晝夜節律紊亂影響了生物鐘基因的正常表達，而生物鐘基因異常通過影響一系列病理生理過程，增加了DM及DR的患病風險。因此，對DM及DR患者的晝夜節律和生物鐘基因的干預將有利于疾病的綜合防治。一方面，順應晝夜節律的行為，如減少熬夜、改善睡眠、規律飲食可減少糖代謝紊亂，降低T2DM及DR患病風險。另一方面，研發針對生物鐘基因的藥物可能有助于治療DR，但需長期且更加深入的探索。故維持正常的晝夜節律可作為疾病預防策略，研究生物鐘基因在DR中的分子機制可為更加全面地闡述DR發病機制、尋找治療新靶點提供新思路。
糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病（DM）最常見和最嚴重的并發癥之一，其發病機制尚未完全闡明。最近有研究指出，維持晝夜節律的生物鐘基因在多水平上參與DR的調控[1]。一方面，晝夜紊亂相關行為干擾了生物鐘基因的晝夜振蕩，其表達水平的改變易致糖代謝調控失衡，最終增加2型DM（T2DM）及DR發病風險[2]。另一方面，DR患者表現出晝夜節律紊亂特點，生物鐘基因可能通過影響一系列視網膜病理生理過程，調控DR發生和發展。現就生物鐘基因在DR發病機制中的作用作一綜述，以期為進一步理解和研究DR發病機制提供理論基礎。
1 生物鐘概述
機體的生理、代謝和行為活動等均遵從一定的晝夜節律變化，而這種節律變化由生物鐘系統所調控[3]。哺乳動物生物鐘系統由下丘腦視交叉上核（SCN）的中央生物鐘以及外周組織的外周生物鐘組成[2]。SCN中央生物鐘接收來自視網膜的光信號后，調節機體內部節律，使其與外環境的24 h節律同步，并通過神經和體液信號整合所有的外周生物鐘，以保證不同組織外周生物鐘之間的同步性。
生物鐘基因是能產生晝夜節律并控制其運轉的基因，是生物鐘的分子基礎。核心生物鐘基因包括：時鐘晝夜調節器（Clock）、腦和肌肉組織芳香烴受體核轉運蛋白的類似蛋白1（Bmal1）、周期蛋白家族（Per，包括Per1、Per2、Per3）、隱花色素家族（Cry，包括Cry1和Cry2）。生物鐘基因及其編碼的蛋白質通過轉錄-翻譯反饋環路來實現對24 h晝夜節律的調控作用。首先，胞質中Clock和Bmal1形成異源二聚體，二聚體結合Per和Cry基因的上游啟動子上的E‐box，激活轉錄從而增加Per及Cry水平，當兩者在胞質中達到一定水平則可形成二聚體進入細胞核，反饋性饋抑制Clock-Bmal1的轉錄活性。其次，視黃酸受體相關的孤兒受體α（RORα）和孤核受體（Nr1d1/REV-ERBα）基因轉錄可被Clock-Bmal1異二聚體激活，二者都可與Bmal1啟動子結合，進而促進或阻遏Bmal1基因的轉錄[4]。因此，生物鐘基因之間形成的反饋環路，共同調節晝夜節律的穩定，生物鐘基因調控紊亂可使機體內環境失調，進而導致疾病發生。
2 生物鐘基因與糖代謝紊亂
近年研究發現，血糖代謝存在明顯晝夜節律，其節律受到生物鐘基因調控。現代社會中熬夜、輪班工作以及電子產品的廣泛使用，使人類作息時間不再遵循原本的生物鐘，并易導致糖代謝紊亂。流行病學證據顯示輪班工作人群T2DM患病率明顯升高[5]，夜班輪班工作時間每增加5年，T2DM患病率即升高31%[6]。動物研究亦證實，發現連續10周予以小鼠夜間光照，將破壞小鼠胰島生物鐘基因振蕩幅度及相位，最終導致胰島素分泌減少及DM發生[7]。由此可見，生活方式的改變破壞了晝夜節律及生物鐘基因的表達，進而通過影響胰島素分泌及胰島素敏感性干預糖代謝過程。其中，不規律的生活方式是啟動因素，生物鐘基因多態性和表達的改變是關鍵，其介導下T2DM及DR患病風險的增加也同樣預示著兩者存在進一步研究的價值[8-9]。
中央及外周生物鐘基因均參與調控糖代謝過程。其中，SCN γ-氨基丁酸能神經元中的REV-ERB基因能控制胰島素抑制肝臟糖異生的晝夜節律，REV-ERB基因敲除小鼠出現空腹糖耐量異常[10]。另外，人、小鼠和大鼠的胰腺及胰島細胞中Clock、Bmal1、Per1、Per2、Cry1、Cry2、REV-ERBα等生物鐘基因均呈晝夜振蕩表達，并調控胰島α和β細胞分泌的胰高血糖素和胰島素水平的24 h晝夜變化[11]。Clock是核心生物鐘基因之一，Corella等[12]對7 098名參與者進行研究，結果發現Clock基因多態性位點rs4580704與T2DM發病風險有關。Bmal1具有調節胰島素分泌節律的功能，Marcheva等[13]研究發現，敲除小鼠胰腺Bmal1基因后，小鼠出現高血糖、低胰島素血癥和葡萄糖耐受不良。Rev-ERBα參與調節胰島β細胞分泌胰島素功能，使用siRNA下調小鼠胰島β細胞Rev-ERBα表達后，小鼠出現葡萄糖依賴的胰島素分泌受損[14]。此外，Cry與胰島素敏感性密切相關，在Cry1/2-/-小鼠模型中，肝臟胰島素抵抗及脂肪胰島素敏感性增加，從而引起脂肪的大量攝入，最終導致肥胖和DM發生。后續的研究發現，T2DM小鼠（db/db小鼠）過表達Cry1可使胰島素敏感性升高，并且降低血糖水平[15]。生物鐘基因已成為糖代謝調控新靶點，中藥參芪復方通過上調DM大鼠生物鐘基因CRY1和白蛋白位點D結合蛋白的表達，增加胰島素分泌及胰島素敏感性，維持葡萄糖穩態[16]。胰島素增敏劑羅格列酮可通過抑制肝臟Bmal1的活性，恢復胰島素敏感性[17]。胰高血糖素樣肽-1受體激動劑利拉魯肽能通過激活磷酸腺苷依賴性蛋白激酶（AMPK）信號通路，恢復胰島β細胞內在生物鐘節律從而改善胰島β細胞功能，最終延緩DM進展[18]。
3 生物鐘基因與DR
生物鐘基因存在于多種視網膜細胞上，并通過神經突觸、間隙連接和釋放的神經遞質整合，集成形成內源性晝夜節律起搏器，從而廣泛調節視網膜的生理功能的晝夜變化，包括多巴胺合成、褪黑素（MLT）釋放、細胞外pH值、光感受器細胞桿盤脫落、視網膜電圖（ERG）b波振幅等[4,19]。若生物鐘基因表達發生異常，則將破壞視網膜生理功能的正常節律。如敲除小鼠視網膜Bmal1基因后會出現暗視及明視ERG反應b波晝夜節律消失、振幅下降[20]。晝夜節律紊亂是DR的重要臨床特征。DR患者易出現睡眠障礙、晝夜血壓均升高等全身晝夜節律紊亂表現[21-23]，同時視網膜結構及功能也表現出相應的節律紊亂，如視網膜厚度晝夜變化增加及ERG固有晝夜節律隨DR病情加重而逐漸下降[24-25]。在DM動物模型中，視網膜部分生物鐘基因表達異常，但SCN中央生物鐘基因并沒有出現相應改變，這也提示DM視網膜生物鐘基因失調可能加劇DR進展[26-28]。近年來，生物鐘基因通過影響視網膜脂代謝、Müller細胞功能及血管內皮祖細胞（EPC）的數量和功能等機制，調控DR發生發展受到重視。
3.1 生物鐘基因與視網膜脂代謝紊亂
近年來脂代謝紊亂在DR中的作用受到關注。一項隊列研究顯示，脂代謝紊亂可能會損傷DM患者視網膜微循環，進而加重DR病情[29]。一方面，循環中低密度脂蛋白水平升高是DR患者視網膜硬性滲出增加及黃斑水腫加重的直接原因[30]。另一更重要的原因在于，視網膜脂代謝過程中的脂肪酸氧化是視網膜能量的重要來源，而此過程正常運行的必要條件是視網膜脂代謝相關基因的晝夜節律性表達。而高糖將影響視網膜生物鐘基因及脂代謝基因的節律性表達，并進一步導致視網膜脂代謝異常及DR微循環障礙[31]。
參與脂質代謝的基因固醇調節元件結合蛋白-1c（srebp1c）、過氧化物酶體增生物激活受體（PPAR）中的PPARα和PPARγ、脂肪酸延長酶（Elovls）中Elovl2和Elovl4在視網膜的表達均具有晝夜節律性。其中，srebp1c在脂質代謝基因轉錄中起核心調控作用[32]。PPARα是控制細胞代謝的關鍵基因，它能直接與Bmal1啟動子相結合[33]，PPARγ則可以調節Bmal1轉錄水平[34]。Elovl2和Elovl4在視網膜中的節律性表達，可以通過影響長鏈不飽和脂肪酸DHA22:6n3的合成，進而激活人視網膜血管內皮細胞中核因子κB和粘附分子的表達，并發揮抗炎作用[35]。
在DR與視網膜脂代謝的研究中，Tikhonenko等[36]首先發現DR大鼠視網膜Elovl2和Elovl4表達降低，其節律性振蕩的缺失進一步誘發視網膜慢性炎癥的發生，促進DR發生進程。然而，負責調控Elovl2和Elovl4表達下降的機制尚不明確。因此，其團隊經深入研究證實，高血糖致大鼠視網膜血管內皮細胞中的核心生物鐘基因（Clock、Bmal1、Cry1、Cry2）表達上調，脂代謝基因srebp1c mRNA表達升高以及PPARα、PPARγ、Elovl2、Elovl4 mRNA表達降低。該研究最終得出結論，DM對視網膜核心生物鐘基因與脂代謝相關基因的晝夜表達的影響，導致視網膜脂代謝失衡，并最終加重DR大鼠視網膜炎癥和微血管損傷[27]。然而，視網膜生物鐘基因與脂代謝基因的內在調控關系并未完全闡明，且尚需進一步的研究。
3.2 生物鐘基因與Müller細胞功能障礙
DR以視網膜神經變性及微循環障礙為特征。Müller細胞貫穿視網膜各層，連接神經元與血視網膜屏障，在高糖環境下通過分泌血管新生因子和炎性因子、下調內向整流性鉀通道4.1（Kir4.1）、減少神經營養物質分泌等途徑促進DR進展[37]。哺乳動物Müller細胞表達完整生物鐘基因并產生晝夜節律，Xu等[38]分離小鼠和人視網膜Müller細胞并進行體外培養，發現核心生物鐘基因（Clock、Bmal1、Per1、Per2、Cry1和Cry2）在兩者的細胞中均呈節律性表達。進一步基因敲除實驗表明，Per1或Bmal1是維持小鼠Müller細胞節律性所必須，而人Müller細胞對Per1的依賴性則降低[38]。生物鐘基因可能通過影響Müller細胞分泌血管新生因子、Kir4.1的表達來誘導DR發病。
Müller細胞產生的血管內皮生長因子（VEGF）通過增加血管滲漏和促進新生血管形成參與DR關鍵病理過程。Xu等[39]敲除體外低氧Müller細胞及體內氧誘導視網膜病變（OIR）小鼠模型中生物鐘基因Per1、Per2后，出現低氧Müller細胞中VEGF水平升高，及OIR小鼠視網膜新生血管增加。所以該研究認為Per1、Per2對新生血管形成具有抑制作用，并可能成為干預血管新生的新靶點。Xu等[40-41]進一步研究發現，敲除低氧Müller細胞中Per1、Per2基因后，還會出現Bmal1表達顯著增加及低氧誘導因子（HIF-1α）水平顯著降低，故生物鐘基因Per1、Per2、Bmal1以及血管新生因子HIF-1α和VEGF可能是血管新生及增生性視網膜病變過程中的關鍵調節因子。此外，另有研究表明晝夜節律系統的負性轉錄因子-胚胎軟骨差異表達基因（Dec2）也可調節缺氧環境下Müller細胞中VEGF的表達。Kusunose等[42]發現，在缺氧誘導人視網膜Müller細胞中，Dec2基因和VEGF水平顯著增加，敲除Dec2基因可通過抑制HIF-1α，從而進一步降低VEGF表達。目前抗VEGF藥物是中晚期DR的主要治療方式，研究生物鐘基因可能有助于探索從HIF-1α和VEGF上游進行干預從而有效抑制新生血管形成的治療新方法。
Müller細胞上Kir4.1的表達具有晝夜節律性并受到生物鐘基因調控。Kir4.1是表達在視網膜Müller細胞上的一種特殊的通道蛋白，對維持視網膜內鉀離子濃度和視網膜各層的“干燥”狀態起關鍵作用。Kir4.1通道具有晝夜節律變化，鏈脲佐菌素誘導的OIR大鼠視網膜炎性因子腫瘤壞死因子表達增加，可破壞Müller細胞Kir4.1通道的晝夜節律及表達，從而導致Müller細胞功能障礙[43]。生物鐘基因Bmal1是調控Kir4.1通道節律性的關鍵，其在DR過程中可介導相關因子對Kir4.1通道的作用[44]。如胰島素信號傳導的重要調節劑胰島素受體底物1（IRS-1），其在Müller細胞中與Kir4.1保持節律同步。T2DM小鼠（db/db小鼠）視網膜IRS-1降低后，可通過抑制Bmal1并下調Kir4.1的表達，最終導致Müller細胞凋亡[45]。因此，生物鐘基因在維持DR Müller細胞Kir4.1正常功能過程中起關鍵作用，并已成為改善Müller細胞功能障礙的潛在靶點。Alex等[46]使用二甲雙胍干預T2DM小鼠（db/db小鼠）后發現，其可通過激活Bmal1-AMPK糾正晝夜節律紊亂，恢復Kir4.1的正常表達，進而改善Müller細胞功能障礙。
3.3 生物鐘基因與EPC數量及功能障礙
當DR出現血管損傷時，成熟的視網膜血管內皮細胞增生和修復能力有限，因此需要骨髓來源的EPC募集到視網膜并完成血管修復功能[47]。動物及人體研究均證實循環EPC數量減少及功能障礙與DR進程相關[48-49]。EPC釋放存在晝夜節律性且受生物鐘基因影響。Thomas等[50]發現，健康人EPC數量顯示出晝夜變化，EPC數量在上午8點至下午3點之間出現下降，在晚上10點顯著增加。相關研究發現，與健康大鼠相比，T2DM大鼠骨髓、外周血及視網膜生物鐘基因（Clock、Bmal1、Per-1、Per-2、Cry1、Cry2、REV-ERBα和RORα）表達均顯著減少，而SCN中央生物鐘改變并不明顯。這種外周生物鐘基因表達廣泛降低引起晝夜振蕩的減弱促使骨髓EPC釋放晝夜節律喪失，循環中EPC的數量也隨之減少，進而出現視網膜無細胞毛細血管的增生，導致視網膜血管功能障礙并加快DR進展[26]。因此，DM導致的外周生物鐘的廣泛抑制是DR血管病變的重要原因。此外，研究發現Per2基因突變小鼠出現了與DR大鼠相似的缺陷，即EPC水平降低及視網膜血管功能障礙。此結果進一步證明了生物鐘基因異常與DR血管病變之間的密切聯系[51-52]。目前臨床上有報道使用粒細胞集落刺激因子和促紅細胞生成素來增加EPC數量及功能，但這兩種藥物價格昂貴且作用有限，因此干預外周生物鐘基因可能是改善DR血管功能障礙的新方法。
4 生物鐘基因與DR的治療
調控晝夜節律和生物鐘基因已成為DR治療新方向。首先，改變不健康的生活及飲食方式，如制定科學的輪班模式、合理安排休息時間、定期體育鍛煉有利于使機體更大程度地適應晝夜節律變化[53]。其次，外源性藥物MLT及MLT受體激動劑如雷美替胺、阿戈美拉汀等已廣泛應用于改善睡眠及調整晝夜節律的治療中[54]。一項正在進行的隨機對照雙盲臨床試驗予以DR患者連續21 d睡前口服MLT，將ERG振蕩電位、瞳孔反應、唾液MLT水平和睡眠情況、視網膜結構作為結局指標，試驗結果將評估MLT對DR患者晝夜節律及視功能的影響[1]。再者，學者在降糖藥物與生物鐘基因內在關系的研究中發現，無論是西藥羅格列酮以及利拉魯肽，或者是中藥參芪復方，其降糖作用機制均與生物鐘基因的調控密切相關。基于生物鐘基因在DR病理生理過程中的關鍵作用，探索新的治療靶點及藥物值得期待。但需注意的是，生物鐘是多基因參與的反饋調節系統，各基因之間的復雜聯系尚未得到完全證實，若僅使用藥物或者基因敲除等手段改變某種生物鐘基因的表達水平，可能受到其他基因的干擾，甚至造成整個生物鐘系統的紊亂。因此，生物鐘基因在DR治療中的研究尚需進一步深入。
5 小結與展望
異常生活方式導致的晝夜節律紊亂影響了生物鐘基因的正常表達，而生物鐘基因異常通過影響一系列病理生理過程，增加了DM及DR的患病風險。因此，對DM及DR患者的晝夜節律和生物鐘基因的干預將有利于疾病的綜合防治。一方面，順應晝夜節律的行為，如減少熬夜、改善睡眠、規律飲食可減少糖代謝紊亂，降低T2DM及DR患病風險。另一方面，研發針對生物鐘基因的藥物可能有助于治療DR，但需長期且更加深入的探索。故維持正常的晝夜節律可作為疾病預防策略，研究生物鐘基因在DR中的分子機制可為更加全面地闡述DR發病機制、尋找治療新靶點提供新思路。