引用本文： 李文博, 曹靖靖, 寇振宇, 韓菲菲, 劉愛華, 東莉潔. 聚嘧啶束結合蛋白相關剪接子高表達對人視網膜微血管內皮細胞凋亡和內質網氧化應激損傷的保護作用. 中華眼底病雜志, 2023, 39(8): 681-686. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210119-00033 復制
氧化應激（OS）是指細胞內氧化成分和抗氧化成分之間的失衡，在視網膜內皮細胞中，OS可誘導內皮細胞功能障礙[1]，從而在眼內各種血管性疾病中發揮重要的作用。視網膜血管性疾病是由眼部或全身性血管疾病引發的視網膜出血、滲出、水腫、缺血或梗死，嚴重者可引發失明。目前臨床中治療視網膜血管性疾病主要通過使用抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物，但由此引發的纖維化等并發癥將進一步加重疾病的進展[2]。內質網（ER）是參與蛋白質翻譯和加工的重要細胞器，過量的活性氧（ROS）通過干擾蛋白質翻譯和加工之間的平衡而引起ER應激，最終導致細胞凋亡。4-羥基壬烯醛（4-HNE）作為脂質過氧化/OS的重要標志，因高濃度4-HNE可以破壞信號轉導和蛋白質活性，誘導炎癥并觸發細胞凋亡[3]，而在模擬OS的實驗研究中被廣泛應用。有研究報道4-HNE可誘導人視網膜色素上皮（RPE）19細胞釋放VEGF，加速老年性黃斑變性（AMD）進展[4]。聚嘧啶束結合蛋白相關剪切子（PSF）是一種多功能蛋白，在DNA修復、RNA轉錄等方面發揮重要作用[5]。我們前期研究發現，過量ROS對視網膜Müller細胞、RPE細胞和血管內皮細胞均有不良影響[6-8]。本研究應用高濃度4-HNE建立人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC）氧化應激模型，探討PSF對其ROS產生的影響并初步探討潛在機制，以期為治療視網膜血管性疾病探索新的治療靶點。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
hRMEC購自北京北納科技有限公司[1]；4-HNE（美國Sigma公司）；膜聯蛋白（Annexin）Ⅴ/碘化丙啶凋亡試劑盒、2'，7'-二氯二氫熒光素雙乙酸鹽（DCFH-DA）（美國Sigma公司）。
1.2 方法
細胞分組。對數生長期hRMEC分為正常組、單純4-HNE處理組（單純4-HNE組）、空載質粒聯合4-HNE處理組（Vec+4-HNE組）、PSF高表達聯合4-HNE處理組（PSF+ 4-HNE組）。單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組細胞培養基加入10 μmol/L 4-HNE，刺激12 h。其后，Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組應用轉染試劑脂質體2000分別導入pcDNA空載體、pcDNA-PSF真核表達質粒，轉染24 h。正常組細胞常規培養。
流式細胞儀檢測hRMEC凋亡率。根據分組對細胞進行相應培養，消化離心并棄去上清液，分別用500 μl磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸成單細胞懸液，加入10 μl AnnexinV/熒光素異硫氰酸酯冰上避光孵育15 min；加入400 μl結合緩沖液、5 μl PI冰上避光孵育5 min；混勻流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組樣品設置3個副孔，每孔獲取50 000個微粒信號，實驗重復3次，檢測結果通過Flowjo7.6軟件進行分析。
DCFH-DA探針檢測PSF高表達對hRMEC內ROS表達的影響。單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組細胞與含有10 μmol/L DCFH-DA的無血清培養基于37 °C下孵育30 min，PBS洗滌2次。采用熒光顯微鏡拍攝圖像，觀察ROS表達情況；通過Image J分析熒光強度。
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組hRMEC內的ER氧化物蛋白1（Ero-1）、蛋白質二硫鍵異構酶（PDI）、C/EBP同源轉錄因子（CHOP）、葡萄糖調節蛋白（GRP）78、蛋白激酶R樣ER激酶（PERK）/磷酸化PERK（p-PERK）、真核起始因子（eIF）2α/磷酸化eIF（peIF）、活化轉錄因子4（ATF4）蛋白相對表達量。收集各組細胞總蛋白，調整蛋白濃度。每個樣孔加入60 μg待測樣品，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳；80 V 恒壓0.5 h，樣品進入分離膠后100 V恒壓2 h，進行蛋白分離。將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，90 V恒壓100 min。5％脫脂牛奶封閉1 h，與特定一抗 4℃孵育過夜。PBS洗膜，加入1∶5 000稀釋的山羊抗兔IgG 辣根過氧化物室溫孵育2 h。化學發光試劑盒顯色，以磷酸甘油醛脫氫酶為內參照，多光譜成像系統掃描蛋白條帶并應用Image J進行半定量分析。
1.3 統計學處理
采用SPSS22.0軟件進行統計分析。計量數據以均數±標準差（x±s）表示。組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 PSF蛋白抑制4-HNE誘導的hRMEC凋亡
流式細胞儀檢測結果顯示，單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組細胞凋亡率分別為（22.50±0.58）%、（26.93±0.55）%、（11.70±0.17）%；三組間細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（F=24.531，P＜0.05）（圖1）。
圖1
各組hRMEC凋亡率比較（n=3） 1A～1D分別示正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組流式細胞儀檢測像；1E示4組細胞凋亡率比較，1、2、3、4分別為正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組；*P＜0.05 PSF：聚嘧啶束結合蛋白相關剪切子；4-HNE：4-羥基壬烯醛；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；Annexin-V：膜聯蛋白-V；PI：碘化丙啶
2.2 PSF蛋白抑制4-HNE誘導的ROS產生
DCFH-DA探針檢測結果顯示，單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組細胞內ROS表達量分別為0.23±0.03、1.60±0.06、0.50±0.06；Vec+4-HNE組ROS表達水平較單純4-HNE組、PSF+4-HNE組顯著升高，差異有統計學意義（F=37.274，P＜0.05）（圖2）。
圖2
各組hRMEC內ROS表達水平比較（n=3） 2A～2D分別示正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組熒光顯微鏡像（×20）；2E示4組ROS表達水平比較，1、2、3、4分別為正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組；*P＜0.05 PSF：聚嘧啶束結合蛋白相關剪切子；4-HNE：4-羥基壬烯醛；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；ROS：活性氧
2.3 4-HNE處理后PSF上調Ero-1α、PDI表達
Western blot檢測結果顯示，正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組細胞ER中Ero-1、PDI蛋白相對表達量分別為1.25±0.03、0.45±0.03、0.63±0.03、1.13±0.09和1.00±0.10、0.27±0.10、0.31±0.05、0.80±0.06；4組Ero-1、PDI蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（F=43.164、36.643，P＜0.05）（圖3）。
圖3
各組hRMEC內Ero-1α、PDI蛋白相對表達量比較（n=3） 3A示Ero-1，*P＜0.05；3B示PD1，1、2、3、4分別為正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組；*P＜0.05 PSF：聚嘧啶束結合蛋白相關剪切子；4-HNE：4-羥基壬烯醛；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；Ero-1：內質網氧化物蛋白1；PDI：蛋白質二硫鍵異構酶
2.4 PSF下調4HNE誘導的CHOP、GRP78表達
Western blot檢測結果顯示，正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組細胞ER中CHOP、GRP78蛋白相對表達量分別為0.55±0.06、1.13±0.09、0.90±0.06、0.48±0.04和0.48±0.04、1.25±0.03、1.03±0.09、0.50±0.06；4組CHOP、GRP78蛋白相對表達量比較，差異均有有統計學意義（F=42.855、45.275，P＜0.05）（圖4）。
圖4
各組hRMEC內CHOP、GRP78蛋白相對表達量比較（n=3） 4A示CHOP，*P＜0.05；4B示GRP78，1、2、3、4分別為正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組，*P＜0.05 PSF：聚嘧啶束結合蛋白相關剪切子；4-HNE：4-羥基壬烯醛；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；CHOP：C/EBP同源轉錄因子；GRP78：葡萄糖調節蛋白78
2.5 PSF下調4-HNE作用下PERK/eIF2α/ATF4的信號活化水平
Western blot檢測結果顯示，正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組細胞ER p-PERK/PERK、peIF2α/eIF、ATF4蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表1）。
表1
4組hRMEC ER p-PERK/PERK、peIF2α/eIF、ATF4蛋白相對表達量比較（x±s）
3 討論
4-HNE是脂質過氧化作用的終產物之一。生理條件下，4-HNE在血漿中的濃度極低，而細胞中則較高，但其濃度可以響應OS而增加100倍[9]。4-HNE可以通過修飾蛋白質的組氨酸、半胱氨酸和賴氨酸殘基，形成HNE-蛋白質加合物參與細胞周期停滯，細胞分化和細胞死亡的調節[10]。既往文獻報道，4-HNE的積累多與年齡相關性疾病相關，包括阿爾茨海默病、帕金森病、癌癥等[11-13]。有研究顯示，AMD患者血漿及視網膜中4-HNE水平均顯著增高[14]。Sharma等[15]研究發現，4-HNE可以誘導RPE細胞中p53激活、磷酸化及核累積。因此本研究選擇4-HNE作為誘導劑以模擬hRMEC的OS狀態。
ER是細胞內合成蛋白質部位，負責蛋白質的折疊，生物合成，轉運和翻譯后修飾等過程。ER作為一個動態的細胞器，調控著幾乎所有膜蛋白和大多數分泌蛋白的折疊和翻譯后成熟。ER合成的蛋白質，需要通過蛋白質二硫鍵異構酶（PDI）家族和其他氧化還原酶介導形成二硫鍵才能獲得特定的三維結構來發揮功能，并且ER中ROS的產生和消耗也有PDI的參與[16]。PDI對于維持ER穩態具有重要作用。研究發現，ER穩態一旦遭到破壞就會引起不正確蛋白質折疊，最終導致ER應激。而PDI在應激條件下可以防止蛋白質的蓄積，并且在珠蛋白的核心區維持疏水囊，從而抑制未折疊的蛋白效應（UPR）[17]。在生理條件下，免疫球蛋白重鏈結合蛋白/GRP78是正常細胞ER未折疊蛋白反應的主要調控因子[18]，而在應激條件下，GRP78在細胞膜上的過度表達介導大量蛋白質紊亂，促進細胞損傷凋亡。當ER穩態一旦受到破壞時，ER內的未折疊蛋白大量增加并聚集在ER上，引發UPR，進而激發內質網PERK/eIF2α/ATF4信號級聯[19]，促進細胞凋亡，并且，作為ER應激誘導細胞凋亡的主要促凋亡基因，誘導的UPR調節CHOP在ER應激反應中也發揮著重要作用[20]。
PSF是細胞核內重要的調節蛋白，在修復DNA損傷，調節RNA轉錄等方面發揮重要作用[5]。在本研究中，我們發現4-HNE誘導細胞內Ero-1α/PDI降低，使得大量的未折疊的蛋白質聚集在ER上，大量未折疊蛋白質聚集引起GRP78表達增加，引發UPR。此外，我們發現4-HNE作用下ER PERK/eIF2α/ATF4信號通路也被激活，進一步導致UPR。UPR一方面導致ER氧化還原紊亂和ER應激反應，引起ER功能障礙進而導致細胞受損凋亡；另一方面UPR誘導CHOP表達引起細胞凋亡。而當PSF作用于受4-HNE誘導的hRMEC時，GRP78和CHOP表達下降，Ero-1/PDI表達增加。此外，我們觀察到PERK，eIF的磷酸化及ATF4蛋白表達受到PSF抑制，從而導致PERK/eIF2a/ATF4信號通路激活受阻，提示PSF蛋白對OS狀態下ER的保護作用。
本研究旨在以ER為切入點解讀PSF對hRMEC OS的調控作用，并明確PSF作為潛在抗氧化劑其發揮作用的分子機制，為眼內OS相關性疾病的治療提供新的可能靶點，目前我們的研究僅在細胞中進行了驗證，PSF在體內的安全性及有效性尚需進一步明確。接下來我們將開展體內實驗探究PSF的安全性及有效性，旨在全面掌握PSF對于眼內OS相關性疾病治療的重要性。
氧化應激（OS）是指細胞內氧化成分和抗氧化成分之間的失衡，在視網膜內皮細胞中，OS可誘導內皮細胞功能障礙[1]，從而在眼內各種血管性疾病中發揮重要的作用。視網膜血管性疾病是由眼部或全身性血管疾病引發的視網膜出血、滲出、水腫、缺血或梗死，嚴重者可引發失明。目前臨床中治療視網膜血管性疾病主要通過使用抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物，但由此引發的纖維化等并發癥將進一步加重疾病的進展[2]。內質網（ER）是參與蛋白質翻譯和加工的重要細胞器，過量的活性氧（ROS）通過干擾蛋白質翻譯和加工之間的平衡而引起ER應激，最終導致細胞凋亡。4-羥基壬烯醛（4-HNE）作為脂質過氧化/OS的重要標志，因高濃度4-HNE可以破壞信號轉導和蛋白質活性，誘導炎癥并觸發細胞凋亡[3]，而在模擬OS的實驗研究中被廣泛應用。有研究報道4-HNE可誘導人視網膜色素上皮（RPE）19細胞釋放VEGF，加速老年性黃斑變性（AMD）進展[4]。聚嘧啶束結合蛋白相關剪切子（PSF）是一種多功能蛋白，在DNA修復、RNA轉錄等方面發揮重要作用[5]。我們前期研究發現，過量ROS對視網膜Müller細胞、RPE細胞和血管內皮細胞均有不良影響[6-8]。本研究應用高濃度4-HNE建立人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC）氧化應激模型，探討PSF對其ROS產生的影響并初步探討潛在機制，以期為治療視網膜血管性疾病探索新的治療靶點。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
hRMEC購自北京北納科技有限公司[1]；4-HNE（美國Sigma公司）；膜聯蛋白（Annexin）Ⅴ/碘化丙啶凋亡試劑盒、2'，7'-二氯二氫熒光素雙乙酸鹽（DCFH-DA）（美國Sigma公司）。
1.2 方法
細胞分組。對數生長期hRMEC分為正常組、單純4-HNE處理組（單純4-HNE組）、空載質粒聯合4-HNE處理組（Vec+4-HNE組）、PSF高表達聯合4-HNE處理組（PSF+ 4-HNE組）。單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組細胞培養基加入10 μmol/L 4-HNE，刺激12 h。其后，Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組應用轉染試劑脂質體2000分別導入pcDNA空載體、pcDNA-PSF真核表達質粒，轉染24 h。正常組細胞常規培養。
流式細胞儀檢測hRMEC凋亡率。根據分組對細胞進行相應培養，消化離心并棄去上清液，分別用500 μl磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸成單細胞懸液，加入10 μl AnnexinV/熒光素異硫氰酸酯冰上避光孵育15 min；加入400 μl結合緩沖液、5 μl PI冰上避光孵育5 min；混勻流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組樣品設置3個副孔，每孔獲取50 000個微粒信號，實驗重復3次，檢測結果通過Flowjo7.6軟件進行分析。
DCFH-DA探針檢測PSF高表達對hRMEC內ROS表達的影響。單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組細胞與含有10 μmol/L DCFH-DA的無血清培養基于37 °C下孵育30 min，PBS洗滌2次。采用熒光顯微鏡拍攝圖像，觀察ROS表達情況；通過Image J分析熒光強度。
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組hRMEC內的ER氧化物蛋白1（Ero-1）、蛋白質二硫鍵異構酶（PDI）、C/EBP同源轉錄因子（CHOP）、葡萄糖調節蛋白（GRP）78、蛋白激酶R樣ER激酶（PERK）/磷酸化PERK（p-PERK）、真核起始因子（eIF）2α/磷酸化eIF（peIF）、活化轉錄因子4（ATF4）蛋白相對表達量。收集各組細胞總蛋白，調整蛋白濃度。每個樣孔加入60 μg待測樣品，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳；80 V 恒壓0.5 h，樣品進入分離膠后100 V恒壓2 h，進行蛋白分離。將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，90 V恒壓100 min。5％脫脂牛奶封閉1 h，與特定一抗 4℃孵育過夜。PBS洗膜，加入1∶5 000稀釋的山羊抗兔IgG 辣根過氧化物室溫孵育2 h。化學發光試劑盒顯色，以磷酸甘油醛脫氫酶為內參照，多光譜成像系統掃描蛋白條帶并應用Image J進行半定量分析。
1.3 統計學處理
采用SPSS22.0軟件進行統計分析。計量數據以均數±標準差（x±s）表示。組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 PSF蛋白抑制4-HNE誘導的hRMEC凋亡
流式細胞儀檢測結果顯示，單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組細胞凋亡率分別為（22.50±0.58）%、（26.93±0.55）%、（11.70±0.17）%；三組間細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（F=24.531，P＜0.05）（圖1）。
圖1
各組hRMEC凋亡率比較（n=3） 1A～1D分別示正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組流式細胞儀檢測像；1E示4組細胞凋亡率比較，1、2、3、4分別為正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組；*P＜0.05 PSF：聚嘧啶束結合蛋白相關剪切子；4-HNE：4-羥基壬烯醛；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；Annexin-V：膜聯蛋白-V；PI：碘化丙啶
2.2 PSF蛋白抑制4-HNE誘導的ROS產生
DCFH-DA探針檢測結果顯示，單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組細胞內ROS表達量分別為0.23±0.03、1.60±0.06、0.50±0.06；Vec+4-HNE組ROS表達水平較單純4-HNE組、PSF+4-HNE組顯著升高，差異有統計學意義（F=37.274，P＜0.05）（圖2）。
圖2
各組hRMEC內ROS表達水平比較（n=3） 2A～2D分別示正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組熒光顯微鏡像（×20）；2E示4組ROS表達水平比較，1、2、3、4分別為正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組；*P＜0.05 PSF：聚嘧啶束結合蛋白相關剪切子；4-HNE：4-羥基壬烯醛；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；ROS：活性氧
2.3 4-HNE處理后PSF上調Ero-1α、PDI表達
Western blot檢測結果顯示，正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組細胞ER中Ero-1、PDI蛋白相對表達量分別為1.25±0.03、0.45±0.03、0.63±0.03、1.13±0.09和1.00±0.10、0.27±0.10、0.31±0.05、0.80±0.06；4組Ero-1、PDI蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（F=43.164、36.643，P＜0.05）（圖3）。
圖3
各組hRMEC內Ero-1α、PDI蛋白相對表達量比較（n=3） 3A示Ero-1，*P＜0.05；3B示PD1，1、2、3、4分別為正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組；*P＜0.05 PSF：聚嘧啶束結合蛋白相關剪切子；4-HNE：4-羥基壬烯醛；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；Ero-1：內質網氧化物蛋白1；PDI：蛋白質二硫鍵異構酶
2.4 PSF下調4HNE誘導的CHOP、GRP78表達
Western blot檢測結果顯示，正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組細胞ER中CHOP、GRP78蛋白相對表達量分別為0.55±0.06、1.13±0.09、0.90±0.06、0.48±0.04和0.48±0.04、1.25±0.03、1.03±0.09、0.50±0.06；4組CHOP、GRP78蛋白相對表達量比較，差異均有有統計學意義（F=42.855、45.275，P＜0.05）（圖4）。
圖4
各組hRMEC內CHOP、GRP78蛋白相對表達量比較（n=3） 4A示CHOP，*P＜0.05；4B示GRP78，1、2、3、4分別為正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組，*P＜0.05 PSF：聚嘧啶束結合蛋白相關剪切子；4-HNE：4-羥基壬烯醛；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；CHOP：C/EBP同源轉錄因子；GRP78：葡萄糖調節蛋白78
2.5 PSF下調4-HNE作用下PERK/eIF2α/ATF4的信號活化水平
Western blot檢測結果顯示，正常組、單純4-HNE組、Vec+4-HNE組、PSF+4-HNE組細胞ER p-PERK/PERK、peIF2α/eIF、ATF4蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表1）。
表1
4組hRMEC ER p-PERK/PERK、peIF2α/eIF、ATF4蛋白相對表達量比較（x±s）
3 討論
4-HNE是脂質過氧化作用的終產物之一。生理條件下，4-HNE在血漿中的濃度極低，而細胞中則較高，但其濃度可以響應OS而增加100倍[9]。4-HNE可以通過修飾蛋白質的組氨酸、半胱氨酸和賴氨酸殘基，形成HNE-蛋白質加合物參與細胞周期停滯，細胞分化和細胞死亡的調節[10]。既往文獻報道，4-HNE的積累多與年齡相關性疾病相關，包括阿爾茨海默病、帕金森病、癌癥等[11-13]。有研究顯示，AMD患者血漿及視網膜中4-HNE水平均顯著增高[14]。Sharma等[15]研究發現，4-HNE可以誘導RPE細胞中p53激活、磷酸化及核累積。因此本研究選擇4-HNE作為誘導劑以模擬hRMEC的OS狀態。
ER是細胞內合成蛋白質部位，負責蛋白質的折疊，生物合成，轉運和翻譯后修飾等過程。ER作為一個動態的細胞器，調控著幾乎所有膜蛋白和大多數分泌蛋白的折疊和翻譯后成熟。ER合成的蛋白質，需要通過蛋白質二硫鍵異構酶（PDI）家族和其他氧化還原酶介導形成二硫鍵才能獲得特定的三維結構來發揮功能，并且ER中ROS的產生和消耗也有PDI的參與[16]。PDI對于維持ER穩態具有重要作用。研究發現，ER穩態一旦遭到破壞就會引起不正確蛋白質折疊，最終導致ER應激。而PDI在應激條件下可以防止蛋白質的蓄積，并且在珠蛋白的核心區維持疏水囊，從而抑制未折疊的蛋白效應（UPR）[17]。在生理條件下，免疫球蛋白重鏈結合蛋白/GRP78是正常細胞ER未折疊蛋白反應的主要調控因子[18]，而在應激條件下，GRP78在細胞膜上的過度表達介導大量蛋白質紊亂，促進細胞損傷凋亡。當ER穩態一旦受到破壞時，ER內的未折疊蛋白大量增加并聚集在ER上，引發UPR，進而激發內質網PERK/eIF2α/ATF4信號級聯[19]，促進細胞凋亡，并且，作為ER應激誘導細胞凋亡的主要促凋亡基因，誘導的UPR調節CHOP在ER應激反應中也發揮著重要作用[20]。
PSF是細胞核內重要的調節蛋白，在修復DNA損傷，調節RNA轉錄等方面發揮重要作用[5]。在本研究中，我們發現4-HNE誘導細胞內Ero-1α/PDI降低，使得大量的未折疊的蛋白質聚集在ER上，大量未折疊蛋白質聚集引起GRP78表達增加，引發UPR。此外，我們發現4-HNE作用下ER PERK/eIF2α/ATF4信號通路也被激活，進一步導致UPR。UPR一方面導致ER氧化還原紊亂和ER應激反應，引起ER功能障礙進而導致細胞受損凋亡；另一方面UPR誘導CHOP表達引起細胞凋亡。而當PSF作用于受4-HNE誘導的hRMEC時，GRP78和CHOP表達下降，Ero-1/PDI表達增加。此外，我們觀察到PERK，eIF的磷酸化及ATF4蛋白表達受到PSF抑制，從而導致PERK/eIF2a/ATF4信號通路激活受阻，提示PSF蛋白對OS狀態下ER的保護作用。
本研究旨在以ER為切入點解讀PSF對hRMEC OS的調控作用，并明確PSF作為潛在抗氧化劑其發揮作用的分子機制，為眼內OS相關性疾病的治療提供新的可能靶點，目前我們的研究僅在細胞中進行了驗證，PSF在體內的安全性及有效性尚需進一步明確。接下來我們將開展體內實驗探究PSF的安全性及有效性，旨在全面掌握PSF對于眼內OS相關性疾病治療的重要性。
