引用本文： 步紹翀, 張哲, 王瓊, 洪亞茹, 李筱榮, 東莉潔. 結締組織生長因子刺激后視網膜Müller細胞基因表達譜的轉錄組學分析及驗證. 中華眼底病雜志, 2020, 36(12): 964-970. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200116-00026 復制
增生性玻璃體視網膜病變（PVR）是孔源性視網膜脫離及眼后節創傷后造成視力喪失的主要原因[1]。Müller細胞是構成PVR視網膜增生膜的主要視網膜神經膠質細胞之一，在維持視網膜神經細胞的神經遞質代謝、細胞內外離子及水分平衡中有著至關重要的作用[2-3]。在缺氧、高糖、創傷、炎癥等應激條件，Müller細胞會出現以膠質纖維酸性蛋白表達上調為特征的膠質增生反應（gliosis），并出現活化、增生、移行和分化而參與視網膜增生膜的形成和收縮[4-5]。結締組織生長因子（CTGF）是一種相對分子質量為38×103的分泌性生長因子，是TGF-β重要的下游效應因子，在創傷修復和組織纖維化過程中有促進細胞增生、介導細胞黏附和移行、促進細胞向成肌纖維細胞轉化、促進細胞外基質蛋白合成和纖維化瘢痕形成的作用[6-8]。目前關于CTGF作用于Müller細胞在視網膜損傷修復過程中的增生、移行、分化以及細胞外基質合成的調控作用及對蛋白和基因表達的影響尚未闡明。基因組學是一門研究基因結構、功能及表達產物的學科，近年來基因組學技術在生物醫學領域的應用日益廣泛[9-10]。本研究擬通過RNA轉錄組分析技術研究CTGF對Müller細胞影響的生物學信息，以期為以抗CTGF為切入點治療PVR提供更為全面的分子生物學依據。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料、細胞培養及分組
Müller細胞（MIO-M1，永生化人視網膜Müller細胞）；DMEM培養液、胰蛋白酶、胎牛血清、青鏈霉素、谷氨酰胺、PBS（美國Gibco公司）；6孔板、24孔板、96孔板（美國Life Technologies公司）；MTT粉末（中國索萊寶公司）；骨形態發生蛋白4（BMP4）抗體（中國博士德公司）；Trizol試劑、CTGF（美國Invitrogen公司）；熒光染料SYBR Green（瑞士Roche公司）。
Müller細胞采用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM在37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養。當細胞密度達70%～80%時傳代，取對數生長期細胞用于實驗。實驗分為對照組、CTGF組進行。對照組細胞采用正常DMEM完全培養基培養；CTGF組細胞采用含有10 ng/ml CTGF的DMEM完全培養基持續培養24 h。
1.2 細胞劃痕實驗
參考文獻[11]的方法行細胞劃痕實驗。以6×105個/孔的細胞密度將Müller細胞接種于6孔板中，在每一個孔中均加入2 ml完全培養基。待細胞能夠覆蓋70%～80%的孔板底面積后，用100～1000 μl槍頭于每孔中央劃痕，用PBS洗去刮除掉的細胞，用高倍顯微鏡拍照。按實驗分組加入CTGF刺激，24 h后于原拍照位置再次拍照，對比分析各條件下細胞劃痕遷移區面積。用cellSens Standard軟件計算遷移區面積。遷移率=（S0－St）/S0×100%（S0：原始劃痕面積；St：不同時間點劃痕區域面積）。
1.3 轉錄組文庫測序
參照文獻[12-13]的方法進行轉錄組測序。提取各組細胞總RNA，檢測其是否降解或者是否被污染；測定RNA純度、濃度以及測定RNA是否完整。將檢測完成的RNA用分裂緩沖液分解為較短的片段，通過加入引物利用處理過的mRNA合成一鏈cDNA；之后再通過加入脫氧核糖核苷酸dNTPs和DNA多聚酶polymeraseⅠ合成二鏈cDNA，最終得到的雙鏈cDNA經核酸純化試劑盒AMPure XP進行純化，在純化的基礎上再對末端進行修復，并加多聚氨基酸ployA尾連接測序接頭，對雙鏈cDNA進行PCR擴增，得到cDNA文庫。文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0進行初步定量，將總濃度稀釋至1 ng/μl，采用Agilent 2100對文庫的插入片段長度進行測定。稀釋文庫至1 ng/μl，隨后使用Agilent 2100生物分析儀對文庫的插入片段進行檢測，插入片段符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫的有效濃度（＞2 nmol/L）。庫檢合格后，合并不同文庫的有效濃度及其上機所需要的數量進行HiSeq高通量測序。
1.4 差異表達基因的功能分析
將得到的表達譜進行差異表達分析。采用軟件Bioconductor中的edgeR/泵i數做差異表達分析，edgeR函數假設測序讀數的計數對于每個基因來說是負二項分布，基于此理論分布來做假設檢驗。并將差異顯著的基因（P≤0.001）提取相應的蛋白質序列進行基因注釋（GO）功能、信號通路顯著性富集分析。采用瓦勒紐斯非中心超幾何分布的方法以及GOseq軟件對差異表達基因進行GO功能分析。所篩選出的差異基因通過ID對應GO編號，進而對應到其具體的功能類別或者在細胞中的定位等。同時，對靶基因進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路顯著性富集分析。
1.5 差異表達基因的分析和驗證
基于轉錄組數據，篩選出對照組和CTGF組之間差異表達倍數位于前10名的基因，分析其基因特征。
采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測BMP4的mRNA表達。以GAPDH作為對照，采用Primer軟件對目標引物進行設計。BMP4正向引物5’-GCCCGCAGCCTAGCAA-3’，反向引物5’-CGGTAAAGATCCCGCATGTAG-3’[13]。在384孔板中依次加入2 μl cDNA、2 μl引物、4 μl SYBR。放入qRT-PCR儀內進行反應，反應條件及數據處理方法同文獻[6]。
采用Western blot檢測BMP4的蛋白表達水平。6孔板中每孔接種6×105個細胞，待細胞覆蓋孔板底面積達到70%左右，按細胞分組進行相應處理后收集不同刺激條件下所提取的全蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白復合物；轉膜后用5%脫脂奶粉在室溫條件下封閉1 h，加入一抗進行雜交，4 ℃孵育過夜后，以1倍TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；用HRP標記的二抗繼續孵育1 h后，再以1倍TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；最后加入ECL曝光底物，暗室中曝光，從而測定目標蛋白的表達[14]。
采用免疫熒光定性檢測BMP4的蛋白表達水平。24孔板中每孔接種1.5×105個細胞，待細胞融合度為70%，按細胞分組進行相應處理后，4%多聚甲醛室溫下固定20 min，加入0.25% Triton X-100破膜10 min，血清封閉1 h后加入一抗，4 ℃過夜；第二天吸除一抗，加入二抗及DAPI。熒光顯微鏡下拍照觀察。
1.6 統計學方法
采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，計量數據用均數±標準差（
）表示。體外細胞實驗的比較采用獨立樣本t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 CTGF對細胞遷移的影響
經24 h培養后，對照組僅有少量細胞遷移進入裸區，CTGF組可見大量細胞遷移進入裸區（圖1A～1D）。對照組、CTGF組細胞遷移率分別為（0.057±0.015）%、（0.137±0.018）%，CTGF組細胞遷移率較對照組明顯升高，差異有統計學意義（t=3.453，P=0.026）（圖1E）。
圖1
兩組細胞遷移率比較。1A、1B分別示對照組和CTGF組細胞培養0 h；1C、1D分別示對照組和CTGF組細胞培養24 h，對照組僅有少量細胞遷移進入裸區，CTGF組可見大量細胞遷移進入裸區；1E示對照組和CTGF組細胞培養24 h的細胞遷移率比較。*P＜0.05
2.2 轉錄組文庫測序
所有樣品經轉錄組測序后，分別得到對照組和CTGF組總原始數據50 757 454條和49 120 378條；過濾質量較低的數據，分別得到對照組和CTGF組過濾數據47 865 006條和46 291 200條，所占比例分別為97.89%、97.82%。對照組與CTGF組之間共有325個差異表達基因，其中上調者152個，下調者173個（圖2）。
圖2
差異表達基因火山圖
2.3 差異表達基因的功能分析
GO功能顯著性富集分析結果顯示，差異miRNA的功能主要分為生物學過程、細胞成分和分子功能3類（圖3）。KEGG通路顯著性富集分析結果顯示，差異miRNA表達高度富集在神經系統間信號傳遞、細胞間黏附以及細胞因子與其受體相互作用等相關的通路（圖4）。
圖3
差異表達基因GO功能注釋分類統計圖。1～24為生物學過程；25～39為細胞成分；40～51為分子功能。1：細胞行為；2：生物粘附；3：生物調節；4：細胞殺傷；5：細胞成分組織或生成；6：細胞生物學過程；7：發育過程；8：生長；9：激素分泌；10：免疫系統過程；11：局限化；12：細胞微運動；13：代謝過程；14：多器官過程；15：多細胞有機體過程；16：生物學過程的負向調節；17：生物學過程的正向調節；18：生物學過程調節；19：生育；20：生育過程；21：應激反應；22：節律過程；23：信號；24：單細胞過程；25：細胞；26：細胞連接；27：細胞組分；28：細胞外基質；29：細胞外區域；30：細胞外區域組分；31：大分子復合體；32：細胞膜；33：膜組分；34：膜相關管腔；35：細胞器；36：細胞器組分；37：突觸；38：突觸組分；39：病毒顆粒；40：連接；41：裂解活性；42：通道調節活性；43：酶調節活性；44：鳥苷酸交換因子活性；45：分子傳導活性；46：核苷酸連接轉錄因子活性；47：蛋白連接轉錄因子活性；48：受體活性；49：結構分子活性；50：轉運因子活性
圖4
差異miRNA KEGG富集排名前20的信號通路統計散點圖。1：維生素消化吸收；2：色氨酸尿代謝；3：類固醇合成；4：鞘類磷脂代謝；5：Notch信號通路；6：神經活性配體受體相互作用；7：礦物質吸收；8：青年發病的成年糖尿病；9：絲裂原活化蛋白激酶信號通路；10：賴氨酸合成；11：胰島素信號通路；12：糖蛋白降解；13：半乳糖代謝；14：果糖和甘露糖代謝；15：脂肪酸合成；16：范可尼貧血通路；17：背腹軸形成；18：細胞因子間受體作用；19：細胞粘附分子；20：膀胱癌
2.4 差異表達基因的分析和驗證
分析325個差異表達基因中差異表達位于前10名的基因特征及其在兩組間的表達情況，結果顯示，這些差異表達基因參與組織炎癥反應及纖維化過程等不同的代謝通路及生物學過程（表1）。
表1
前10個差異表達基因統計情況
qRT-PCR、Western blot及免疫熒光定性檢測結果顯示，CTGF組細胞中BMP4 mRNA及蛋白表達均較對照組明顯提高，差異有統計學意義（t=39.490、10.110、5.470，P=0.004、0.001、0.006）（圖5，6）。
圖5
兩組細胞中BMP4 mRNA及蛋白表達比較。5A示qRT-PCR測得的mRNA表達；5B示Western blot測得的蛋白表達；5C示免疫熒光定性檢測測得的蛋白表達。*P＜0.05
圖6
兩組細胞中BMP4蛋白表達的免疫熒光像。6A示對照組；6B示CTGF組。CTGF組Müller細胞內BMP4蛋白熒光染色增強 BMP4+DAPI 標尺：25 μm
3 討論
PVR是一個多種細胞因子共同參與的復雜病理生理過程，其中PVR增生膜及玻璃體液中CTGF的mRNA和蛋白表達增加是調控纖維瘢痕化過程中上皮間質化（EMT）的重要因素之一[13]。近年來，越來越多的學者認為視網膜Müller細胞在PVR的發生發展中的作用至關重要，在整個PVR發生發展過程中，Müller細胞應激活化后自身發生增生、移行和分化，導致組織纖維化，分泌炎癥因子，是導致PVR發展的關鍵因素[14-17]。但在PVR發生發展過程中，Müller細胞增生、移行及轉化的調控機制仍有許多細節不明，如由于尚未確定刺激細胞增生和表型轉化的關鍵因子，而不能采用具有特異性的拮抗劑加以干預。因此，本研究采用RNA轉錄組測序分析來研究CTGF刺激對Müller細胞的影響，并通過GO功能、KEGG通路顯著性富集分析來探索CTGF導致Müller細胞基因表達的整體化改變，并對其中表達上調明顯且與組織纖維化關系密切的BMP4蛋白表達進行驗證。
本研究RNA轉錄組測序結果顯示，CTGF導致Müller細胞功能改變的過程中涉及到細胞的各種生物學過程改變，由RNA測序得出的325個差異表達基因中，其中GRAP、CNTD2、BMP4等基因與這種改變密切相關。GRAP不僅可以促進細胞的增生、遷移行為，還可以導致細胞組織的纖維化，與PVR的發病機制密切相關。GRAP能將來自受體和細胞質酪氨酸激酶的信號偶聯到腎素血管緊張素系統（Ras）信號傳導途徑，進而激活細胞外信號調節激酶（ERK）。ERK參與增生、轉錄調節、分化和發育等多種細胞的生物學過程。此外，GRAP一方面可通過與TGF-β1等其他細胞因子受體的相互作用來傳遞來自細胞膜的信號。Cummins等[18]報道了腎小管中的GRAP表達上調與腎纖維化相關，GRAP被證明是人腎小管細胞中TGF-β1信號傳導的新組分，GRAP可促進人腎近端小管HK11細胞中細胞外基質蛋白的表達，并增強TGF-β1誘導的纖連蛋白積累。這些研究結果表明，GRAP可能加劇TGF-β1的促纖維化作用。另一方面，GRAP可激活Ras /絲裂原活化蛋白激酶信號傳導從而促進EMT，細胞發生EMT和細胞外基質合成是PVR形成的關鍵環節[19-21]。此外，在顯著性表達的差異基因中，IL23A、IL18和GRAP等與炎癥反應密切相關。炎癥在PVR纖維膜形成過程中也起著重要作用，視網膜前膜的形成需要持續的眼內慢性炎癥反應刺激。由于血視網膜屏障的破壞、小膠質細胞和巨噬細胞等遷移入玻璃體腔并釋放炎癥產物，當炎癥達到一定水平時，分離的視網膜引起的重塑機制被放大，導致進入PVR過程[21-24]。
KEGG通路顯著性富集分析結果顯示，細胞因子與其受體作用通路為差異基因顯著富集的通路，BMP4為該通路中顯著性表達的基因。BMP4是TGF超家族中的一員, 可調節多種細胞的生長及遷移，增加膠原產生和細胞外基質沉積。BMP4與細胞表面的受體結合，活化并激活下游信號分子，使Smad1/5/8磷酸化，活化的Smad1/5/8與Smad4結合形成復合體并轉移至細胞核內，調控相關轉錄因子從而對機體進行功能調節[25-27]。Yao等[28]研究發現，BMP4及其受體與PVR增生膜內的細胞角蛋白和α平滑肌肌絲蛋白陽性細胞共標記。此外，氧化應激在PVR的發病機制中起著關鍵作用。氧化應激是指ROS產生和抗氧化劑系統之間的不平衡，可能導致細胞損傷。越來越多的證據表明，氧化應激增加可能會誘導細胞線粒體DNA受到優先損害，從而導致細胞死亡[29]。因此，抑制Müller細胞中的氧化應激是防止PVR進展的有效方法。而BMP4可促進PVR視網膜中氧化應激反應，其通過NADPH氧化酶增加ROS的形成，進而對組織及細胞造成損傷[30-32]。基于BMP4與TGF-β、CTGF以及PVR的發病機制有著密切關系，我們在后續的實驗中，選取BMP4進行驗證以及功能性實驗。在CTGF刺激的Müller細胞中從mRNA水平及蛋白水平檢測BMP4的表達，結果顯示BMP4在CTGF刺激條件下表達明顯升高，與RNA測序結果相一致。這提示BMP4在PVR的發展中可能起著重要作用。
本研究的內容主要集中于對人源性永生化視網膜Müller細胞離體條件下CTGF作用對其基因表達變化的研究和膠質細胞纖維化過程中參與的多種細胞因子成分的研究，雖然能夠提供進一步的機理探索和治療靶點的方向，但PVR本身是一個多種細胞成分共同作用的及其復雜的病理生理學過程，單一細胞研究難以闡明或提高完善的治療解決方案。同時，由于CTGF和BMP4參與人體內多種組織器官的生理過程，只有進一步明確其在PVR過程中下游信號通路的成分，才有可能尋找到具有特異性的生物治療靶點，形成具有實踐意義的生物治療手段。
通過全面分析轉錄組測序的數據，我們發現CTGF對于Müller細胞的影響是多方面的，如影響其增生、遷移等生物學功能以及促進炎癥反應及纖維化的發生發展。本研究利用轉錄組測序技術對CTGF作用于Müller細胞的分子作用機制進行了探索，未來將進一步分析CTGF及BMP4在PVR中的作用與功能，有望為開發新的PVR靶向制劑奠定理論基礎。
增生性玻璃體視網膜病變（PVR）是孔源性視網膜脫離及眼后節創傷后造成視力喪失的主要原因[1]。Müller細胞是構成PVR視網膜增生膜的主要視網膜神經膠質細胞之一，在維持視網膜神經細胞的神經遞質代謝、細胞內外離子及水分平衡中有著至關重要的作用[2-3]。在缺氧、高糖、創傷、炎癥等應激條件，Müller細胞會出現以膠質纖維酸性蛋白表達上調為特征的膠質增生反應（gliosis），并出現活化、增生、移行和分化而參與視網膜增生膜的形成和收縮[4-5]。結締組織生長因子（CTGF）是一種相對分子質量為38×103的分泌性生長因子，是TGF-β重要的下游效應因子，在創傷修復和組織纖維化過程中有促進細胞增生、介導細胞黏附和移行、促進細胞向成肌纖維細胞轉化、促進細胞外基質蛋白合成和纖維化瘢痕形成的作用[6-8]。目前關于CTGF作用于Müller細胞在視網膜損傷修復過程中的增生、移行、分化以及細胞外基質合成的調控作用及對蛋白和基因表達的影響尚未闡明。基因組學是一門研究基因結構、功能及表達產物的學科，近年來基因組學技術在生物醫學領域的應用日益廣泛[9-10]。本研究擬通過RNA轉錄組分析技術研究CTGF對Müller細胞影響的生物學信息，以期為以抗CTGF為切入點治療PVR提供更為全面的分子生物學依據。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料、細胞培養及分組
Müller細胞（MIO-M1，永生化人視網膜Müller細胞）；DMEM培養液、胰蛋白酶、胎牛血清、青鏈霉素、谷氨酰胺、PBS（美國Gibco公司）；6孔板、24孔板、96孔板（美國Life Technologies公司）；MTT粉末（中國索萊寶公司）；骨形態發生蛋白4（BMP4）抗體（中國博士德公司）；Trizol試劑、CTGF（美國Invitrogen公司）；熒光染料SYBR Green（瑞士Roche公司）。
Müller細胞采用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM在37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養。當細胞密度達70%～80%時傳代，取對數生長期細胞用于實驗。實驗分為對照組、CTGF組進行。對照組細胞采用正常DMEM完全培養基培養；CTGF組細胞采用含有10 ng/ml CTGF的DMEM完全培養基持續培養24 h。
1.2 細胞劃痕實驗
參考文獻[11]的方法行細胞劃痕實驗。以6×105個/孔的細胞密度將Müller細胞接種于6孔板中，在每一個孔中均加入2 ml完全培養基。待細胞能夠覆蓋70%～80%的孔板底面積后，用100～1000 μl槍頭于每孔中央劃痕，用PBS洗去刮除掉的細胞，用高倍顯微鏡拍照。按實驗分組加入CTGF刺激，24 h后于原拍照位置再次拍照，對比分析各條件下細胞劃痕遷移區面積。用cellSens Standard軟件計算遷移區面積。遷移率=（S0－St）/S0×100%（S0：原始劃痕面積；St：不同時間點劃痕區域面積）。
1.3 轉錄組文庫測序
參照文獻[12-13]的方法進行轉錄組測序。提取各組細胞總RNA，檢測其是否降解或者是否被污染；測定RNA純度、濃度以及測定RNA是否完整。將檢測完成的RNA用分裂緩沖液分解為較短的片段，通過加入引物利用處理過的mRNA合成一鏈cDNA；之后再通過加入脫氧核糖核苷酸dNTPs和DNA多聚酶polymeraseⅠ合成二鏈cDNA，最終得到的雙鏈cDNA經核酸純化試劑盒AMPure XP進行純化，在純化的基礎上再對末端進行修復，并加多聚氨基酸ployA尾連接測序接頭，對雙鏈cDNA進行PCR擴增，得到cDNA文庫。文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0進行初步定量，將總濃度稀釋至1 ng/μl，采用Agilent 2100對文庫的插入片段長度進行測定。稀釋文庫至1 ng/μl，隨后使用Agilent 2100生物分析儀對文庫的插入片段進行檢測，插入片段符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫的有效濃度（＞2 nmol/L）。庫檢合格后，合并不同文庫的有效濃度及其上機所需要的數量進行HiSeq高通量測序。
1.4 差異表達基因的功能分析
將得到的表達譜進行差異表達分析。采用軟件Bioconductor中的edgeR/泵i數做差異表達分析，edgeR函數假設測序讀數的計數對于每個基因來說是負二項分布，基于此理論分布來做假設檢驗。并將差異顯著的基因（P≤0.001）提取相應的蛋白質序列進行基因注釋（GO）功能、信號通路顯著性富集分析。采用瓦勒紐斯非中心超幾何分布的方法以及GOseq軟件對差異表達基因進行GO功能分析。所篩選出的差異基因通過ID對應GO編號，進而對應到其具體的功能類別或者在細胞中的定位等。同時，對靶基因進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路顯著性富集分析。
1.5 差異表達基因的分析和驗證
基于轉錄組數據，篩選出對照組和CTGF組之間差異表達倍數位于前10名的基因，分析其基因特征。
采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測BMP4的mRNA表達。以GAPDH作為對照，采用Primer軟件對目標引物進行設計。BMP4正向引物5’-GCCCGCAGCCTAGCAA-3’，反向引物5’-CGGTAAAGATCCCGCATGTAG-3’[13]。在384孔板中依次加入2 μl cDNA、2 μl引物、4 μl SYBR。放入qRT-PCR儀內進行反應，反應條件及數據處理方法同文獻[6]。
采用Western blot檢測BMP4的蛋白表達水平。6孔板中每孔接種6×105個細胞，待細胞覆蓋孔板底面積達到70%左右，按細胞分組進行相應處理后收集不同刺激條件下所提取的全蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白復合物；轉膜后用5%脫脂奶粉在室溫條件下封閉1 h，加入一抗進行雜交，4 ℃孵育過夜后，以1倍TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；用HRP標記的二抗繼續孵育1 h后，再以1倍TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；最后加入ECL曝光底物，暗室中曝光，從而測定目標蛋白的表達[14]。
采用免疫熒光定性檢測BMP4的蛋白表達水平。24孔板中每孔接種1.5×105個細胞，待細胞融合度為70%，按細胞分組進行相應處理后，4%多聚甲醛室溫下固定20 min，加入0.25% Triton X-100破膜10 min，血清封閉1 h后加入一抗，4 ℃過夜；第二天吸除一抗，加入二抗及DAPI。熒光顯微鏡下拍照觀察。
1.6 統計學方法
采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，計量數據用均數±標準差（）表示。體外細胞實驗的比較采用獨立樣本t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 CTGF對細胞遷移的影響
經24 h培養后，對照組僅有少量細胞遷移進入裸區，CTGF組可見大量細胞遷移進入裸區（圖1A～1D）。對照組、CTGF組細胞遷移率分別為（0.057±0.015）%、（0.137±0.018）%，CTGF組細胞遷移率較對照組明顯升高，差異有統計學意義（t=3.453，P=0.026）（圖1E）。
圖1
兩組細胞遷移率比較。1A、1B分別示對照組和CTGF組細胞培養0 h；1C、1D分別示對照組和CTGF組細胞培養24 h，對照組僅有少量細胞遷移進入裸區，CTGF組可見大量細胞遷移進入裸區；1E示對照組和CTGF組細胞培養24 h的細胞遷移率比較。*P＜0.05
2.2 轉錄組文庫測序
所有樣品經轉錄組測序后，分別得到對照組和CTGF組總原始數據50 757 454條和49 120 378條；過濾質量較低的數據，分別得到對照組和CTGF組過濾數據47 865 006條和46 291 200條，所占比例分別為97.89%、97.82%。對照組與CTGF組之間共有325個差異表達基因，其中上調者152個，下調者173個（圖2）。
圖2
差異表達基因火山圖
2.3 差異表達基因的功能分析
GO功能顯著性富集分析結果顯示，差異miRNA的功能主要分為生物學過程、細胞成分和分子功能3類（圖3）。KEGG通路顯著性富集分析結果顯示，差異miRNA表達高度富集在神經系統間信號傳遞、細胞間黏附以及細胞因子與其受體相互作用等相關的通路（圖4）。
圖3
差異表達基因GO功能注釋分類統計圖。1～24為生物學過程；25～39為細胞成分；40～51為分子功能。1：細胞行為；2：生物粘附；3：生物調節；4：細胞殺傷；5：細胞成分組織或生成；6：細胞生物學過程；7：發育過程；8：生長；9：激素分泌；10：免疫系統過程；11：局限化；12：細胞微運動；13：代謝過程；14：多器官過程；15：多細胞有機體過程；16：生物學過程的負向調節；17：生物學過程的正向調節；18：生物學過程調節；19：生育；20：生育過程；21：應激反應；22：節律過程；23：信號；24：單細胞過程；25：細胞；26：細胞連接；27：細胞組分；28：細胞外基質；29：細胞外區域；30：細胞外區域組分；31：大分子復合體；32：細胞膜；33：膜組分；34：膜相關管腔；35：細胞器；36：細胞器組分；37：突觸；38：突觸組分；39：病毒顆粒；40：連接；41：裂解活性；42：通道調節活性；43：酶調節活性；44：鳥苷酸交換因子活性；45：分子傳導活性；46：核苷酸連接轉錄因子活性；47：蛋白連接轉錄因子活性；48：受體活性；49：結構分子活性；50：轉運因子活性
圖4
差異miRNA KEGG富集排名前20的信號通路統計散點圖。1：維生素消化吸收；2：色氨酸尿代謝；3：類固醇合成；4：鞘類磷脂代謝；5：Notch信號通路；6：神經活性配體受體相互作用；7：礦物質吸收；8：青年發病的成年糖尿病；9：絲裂原活化蛋白激酶信號通路；10：賴氨酸合成；11：胰島素信號通路；12：糖蛋白降解；13：半乳糖代謝；14：果糖和甘露糖代謝；15：脂肪酸合成；16：范可尼貧血通路；17：背腹軸形成；18：細胞因子間受體作用；19：細胞粘附分子；20：膀胱癌
2.4 差異表達基因的分析和驗證
分析325個差異表達基因中差異表達位于前10名的基因特征及其在兩組間的表達情況，結果顯示，這些差異表達基因參與組織炎癥反應及纖維化過程等不同的代謝通路及生物學過程（表1）。
表1
前10個差異表達基因統計情況
qRT-PCR、Western blot及免疫熒光定性檢測結果顯示，CTGF組細胞中BMP4 mRNA及蛋白表達均較對照組明顯提高，差異有統計學意義（t=39.490、10.110、5.470，P=0.004、0.001、0.006）（圖5，6）。
圖5
兩組細胞中BMP4 mRNA及蛋白表達比較。5A示qRT-PCR測得的mRNA表達；5B示Western blot測得的蛋白表達；5C示免疫熒光定性檢測測得的蛋白表達。*P＜0.05
圖6
兩組細胞中BMP4蛋白表達的免疫熒光像。6A示對照組；6B示CTGF組。CTGF組Müller細胞內BMP4蛋白熒光染色增強 BMP4+DAPI 標尺：25 μm
3 討論
PVR是一個多種細胞因子共同參與的復雜病理生理過程，其中PVR增生膜及玻璃體液中CTGF的mRNA和蛋白表達增加是調控纖維瘢痕化過程中上皮間質化（EMT）的重要因素之一[13]。近年來，越來越多的學者認為視網膜Müller細胞在PVR的發生發展中的作用至關重要，在整個PVR發生發展過程中，Müller細胞應激活化后自身發生增生、移行和分化，導致組織纖維化，分泌炎癥因子，是導致PVR發展的關鍵因素[14-17]。但在PVR發生發展過程中，Müller細胞增生、移行及轉化的調控機制仍有許多細節不明，如由于尚未確定刺激細胞增生和表型轉化的關鍵因子，而不能采用具有特異性的拮抗劑加以干預。因此，本研究采用RNA轉錄組測序分析來研究CTGF刺激對Müller細胞的影響，并通過GO功能、KEGG通路顯著性富集分析來探索CTGF導致Müller細胞基因表達的整體化改變，并對其中表達上調明顯且與組織纖維化關系密切的BMP4蛋白表達進行驗證。
本研究RNA轉錄組測序結果顯示，CTGF導致Müller細胞功能改變的過程中涉及到細胞的各種生物學過程改變，由RNA測序得出的325個差異表達基因中，其中GRAP、CNTD2、BMP4等基因與這種改變密切相關。GRAP不僅可以促進細胞的增生、遷移行為，還可以導致細胞組織的纖維化，與PVR的發病機制密切相關。GRAP能將來自受體和細胞質酪氨酸激酶的信號偶聯到腎素血管緊張素系統（Ras）信號傳導途徑，進而激活細胞外信號調節激酶（ERK）。ERK參與增生、轉錄調節、分化和發育等多種細胞的生物學過程。此外，GRAP一方面可通過與TGF-β1等其他細胞因子受體的相互作用來傳遞來自細胞膜的信號。Cummins等[18]報道了腎小管中的GRAP表達上調與腎纖維化相關，GRAP被證明是人腎小管細胞中TGF-β1信號傳導的新組分，GRAP可促進人腎近端小管HK11細胞中細胞外基質蛋白的表達，并增強TGF-β1誘導的纖連蛋白積累。這些研究結果表明，GRAP可能加劇TGF-β1的促纖維化作用。另一方面，GRAP可激活Ras /絲裂原活化蛋白激酶信號傳導從而促進EMT，細胞發生EMT和細胞外基質合成是PVR形成的關鍵環節[19-21]。此外，在顯著性表達的差異基因中，IL23A、IL18和GRAP等與炎癥反應密切相關。炎癥在PVR纖維膜形成過程中也起著重要作用，視網膜前膜的形成需要持續的眼內慢性炎癥反應刺激。由于血視網膜屏障的破壞、小膠質細胞和巨噬細胞等遷移入玻璃體腔并釋放炎癥產物，當炎癥達到一定水平時，分離的視網膜引起的重塑機制被放大，導致進入PVR過程[21-24]。
KEGG通路顯著性富集分析結果顯示，細胞因子與其受體作用通路為差異基因顯著富集的通路，BMP4為該通路中顯著性表達的基因。BMP4是TGF超家族中的一員, 可調節多種細胞的生長及遷移，增加膠原產生和細胞外基質沉積。BMP4與細胞表面的受體結合，活化并激活下游信號分子，使Smad1/5/8磷酸化，活化的Smad1/5/8與Smad4結合形成復合體并轉移至細胞核內，調控相關轉錄因子從而對機體進行功能調節[25-27]。Yao等[28]研究發現，BMP4及其受體與PVR增生膜內的細胞角蛋白和α平滑肌肌絲蛋白陽性細胞共標記。此外，氧化應激在PVR的發病機制中起著關鍵作用。氧化應激是指ROS產生和抗氧化劑系統之間的不平衡，可能導致細胞損傷。越來越多的證據表明，氧化應激增加可能會誘導細胞線粒體DNA受到優先損害，從而導致細胞死亡[29]。因此，抑制Müller細胞中的氧化應激是防止PVR進展的有效方法。而BMP4可促進PVR視網膜中氧化應激反應，其通過NADPH氧化酶增加ROS的形成，進而對組織及細胞造成損傷[30-32]。基于BMP4與TGF-β、CTGF以及PVR的發病機制有著密切關系，我們在后續的實驗中，選取BMP4進行驗證以及功能性實驗。在CTGF刺激的Müller細胞中從mRNA水平及蛋白水平檢測BMP4的表達，結果顯示BMP4在CTGF刺激條件下表達明顯升高，與RNA測序結果相一致。這提示BMP4在PVR的發展中可能起著重要作用。
本研究的內容主要集中于對人源性永生化視網膜Müller細胞離體條件下CTGF作用對其基因表達變化的研究和膠質細胞纖維化過程中參與的多種細胞因子成分的研究，雖然能夠提供進一步的機理探索和治療靶點的方向，但PVR本身是一個多種細胞成分共同作用的及其復雜的病理生理學過程，單一細胞研究難以闡明或提高完善的治療解決方案。同時，由于CTGF和BMP4參與人體內多種組織器官的生理過程，只有進一步明確其在PVR過程中下游信號通路的成分，才有可能尋找到具有特異性的生物治療靶點，形成具有實踐意義的生物治療手段。
通過全面分析轉錄組測序的數據，我們發現CTGF對于Müller細胞的影響是多方面的，如影響其增生、遷移等生物學功能以及促進炎癥反應及纖維化的發生發展。本研究利用轉錄組測序技術對CTGF作用于Müller細胞的分子作用機制進行了探索，未來將進一步分析CTGF及BMP4在PVR中的作用與功能，有望為開發新的PVR靶向制劑奠定理論基礎。
